PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 tests à utiliser avec l
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PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 tests à utiliser avec l’instrument Autostainer Link 48 Utilisation prévue Destiné à un usage diagnostic in vitro. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx est un test immunohistochimique qualitatif qui utilise le clone 22C3 de l’anticorps monoclonal murin anti-PD-L1 pour la détection de la protéine PD-L1 dans des coupes de tissu de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) fixées au formol et incluses en paraffine (FFPE) au moyen du système de visualisation EnVision FLEX sur l’instrument Autostainer Link 48. L’expression de la protéine PD-L1 est déterminée à l’aide du score TPS (Tumor Proportion Score), qui représente le pourcentage de cellules tumorales viables présentant une coloration membranaire partielle ou complète. L’échantillon doit être considéré comme étant positif pour la protéine PD-L1 si le score TPS est ≥ 50 % de cellules tumorales viables présentant une coloration membranaire de quelconque intensité. Le test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx est indiqué pour faciliter la détermination des patients atteints de CPNPC qui sont admissibles au traitement par KEYTRUDA® (pembrolizumab). Résumé et explication La liaison des ligands PD-1, PD-L1 et PD-L2, au récepteur PD-1 se trouvant sur les lymphocytes T inhibe la prolifération des lymphocytes T et la production de cytokine. Une régulation en amont des ligands PD-1 se produit dans certaines tumeurs, et la signalisation par cette voie peut contribuer à l’inhibition de la surveillance immunitaire active des tumeurs par les lymphocytes T. KEYTRUDA® (pembrolizumab) est un anticorps monoclonal humanisé qui se lie au récepteur PD-1 et bloque son interaction avec PD-L1 et PD-L2, permettant l’inhibition par la voie PD-1 de la réponse immunitaire, notamment la réponse immunitaire antitumorale. Dans les modèles tumoraux syngéniques murins, le blocage de l’activité PD-1 a permis de réduire la croissance tumorale. Principe de la procédure Le test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx contient des réactifs optimisés et intègre le protocole requis pour réaliser une procédure de coloration IHC d’échantillons FFPE avec l’instrument Autostainer Link 48. Après incubation avec l’anticorps monoclonal primaire dirigé contre PD-L1 ou le réactif de contrôle négatif (RCN), les échantillons sont incubés avec un anticorps de liaison spécifique à l’espèce hôte de l’anticorps primaire, puis avec un réactif de visualisation prêt à l’emploi constitué de molécules d’anticorps secondaire et de molécules de peroxydase de raifort couplées à une chaîne principale du dextrane (polymère). La conversion enzymatique du chromogène ajouté par la suite entraîne la précipitation d’un produit de réaction visible sur le site de l’antigène. La couleur de la réaction chromogénique est modifiée par un réactif d’amplification du chromogène. L’échantillon peut alors être contre-coloré et recouvert d’une lamelle de protection. Un microscope optique est utilisé pour l’interprétation des résultats. Matériel fourni Le test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (réf. SK006) est destiné à la coloration automatisée au moyen de l’instrument Autostainer Link 48. Chaque trousse comprend 19,5 mL d’anticorps primaire dirigé contre PD-L1 (concentration de protéines d’environ 3 µg/mL) et contient les réactifs nécessaires pour effectuer 50 tests jusqu’à 15 cycles individuels. Le matériel indiqué ci-dessous permet d’effectuer 50 tests (50 lames incubées avec l’anticorps primaire dirigé contre PD-L1 et 50 lames incubées avec le réactif de contrôle négatif correspondant; soit un total de 100 lames). Le nombre de tests indiqué suppose l’utilisation de 2 x 150 µL de chaque réactif par lame sauf pour DAB+ et la solution de récupération des cibles. La trousse contient une quantité suffisante de matériel pour un maximum de 15 cycles de coloration. Quantité 1 x 34,5 mL Description Réactif de blocage de la peroxydase PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Solution tampon contenant du peroxyde d’hydrogène, un détergent et 0,015 mol/L d’azoture de sodium. 1 x 19,5 mL Anticorps primaire : anticorps monoclonal murin anti-PD-L1, clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Anticorps monoclonal murin anti-PD-L1 dans une solution tampon contenant une protéine stabilisante et 0,015 mol/L d’azoture de sodium. 1 x 15 mL Réactif de contrôle négatif NEGATIVE CONTROL REAGENT Anticorps monoclonal murin IgG de contrôle dans une solution tampon contenant une protéine stabilisante et 0,015 mol/L d’azoture de sodium. 1 x 34,5 mL Anticorps de liaison murin LINKER, ANTI-MOUSE Anticorps secondaire de lapin dirigé contre les immunoglobulines murines dans une solution tampon contenant une protéine stabilisante et 0,015 mol/L d’azoture de sodium. P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 1/12 1 x 34,5 mL Réactif de visualisation HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextrane couplé à des molécules de peroxydase et à des molécules d’anticorps secondaire de chèvre dirigé contre les immunoglobulines de lapin et de souris dans une solution tampon contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien. 15 x 7,2 mL Tampon de substrat DAB+ DAB+ SUBSTRATE BUFFER Solution tampon contenant du peroxyde d’hydrogène et un agent antimicrobien. 1 x 5 mL Chromogène DAB+ DAB+ CHROMOGEN Tétrahydrochlorure de 3,3’-diaminobenzidine dans un solvant organique. 1 x 34,5 mL Amplificateur DAB DAB ENHANCER Sulfate de cuivre dans l’eau. 6 x 30 mL Solution de récupération des cibles EnVision FLEX, faible pH, 50x EnVision™ FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X) Solution tampon, pH de 6,1 contenant un détergent et un agent antimicrobien. 15 lames Lames de contrôle PD-L1 IHC 22C3 pharmDx CONTROL SLIDES XXXXX PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Chaque lame contient des sections de deux lignées cellulaires concentrées fixées au formol et incluses en paraffine : NCI-H226* avec expression de la protéine PD-L1 modérée et MCF-7 avec expression de la protéine PD-L1 négative. MCF-7 : PD-L1 négatif NCI-H226 : PD-L1 positif * La participation des Drs AF Gazdar et JD Minna du NIH dans la mise au point de NCI-H226 (n° ATCC : CRL-5826™) est soulignée (1). Remarque : Tous les réactifs inclus sont formulés spécifiquement pour être utilisés avec cette trousse. Pour que le test fonctionne comme indiqué, aucune substitution ne doit être effectuée, à l’exception de la solution de récupération des cibles EnVision FLEX, faible pH, 50x (réf. K8005). Le test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx a été spécialement conçu pour être utilisé avec l’instrument Autostainer Link 48. Pour de plus amples renseignements, se reporter aux guides de l’utilisateur des instruments Autostainer Link 48 et PT Link. Matériel requis, mais non fourni Module de prétraitement PT Link (réf. PT100) Instrument Autostainer Link 48 (réf. AS480) Tampon de lavage EnVision FLEX, 20x (réf. K8007) Hématoxyline (réf. K8008) Eau distillée ou désionisée (eau de qualité requise pour les réactifs) Minuteur Tissus positifs et négatifs à utiliser comme témoins dans le processus (voir la section Contrôle de la qualité) Lames porte-objets : Lames porte-objets Dako FLEX IHC (réf. K8020) ou lames chargées Fisherbrand Superfrost Plus Couvre-objets Milieu de montage permanent et réactifs auxiliaires nécessaires au montage des couvre-objets Microscope optique (grossissement de l’objectif de 4 à 40x) Précautions 1. Destiné à un usage diagnostic in vitro. 2. Réservé à des utilisateurs professionnels. 3. Ce produit contient de l’azoture de sodium (NaN3), une substance chimique hautement toxique dans sa forme pure. Aux concentrations du produit, bien qu’il ne soit pas classé comme dangereux, le NaN3 peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations pour former des azotures métalliques hautement explosifs. Lors de l’élimination, rincer abondamment à l’eau pour éviter toute accumulation d’azoture dans les canalisations (2). 4. L’anticorps primaire, le réactif de contrôle négatif, l’anticorps de liaison et le réactif de visualisation contiennent des matériaux d’origine animale. 5. Les échantillons, avant et après la fixation, ainsi que tous les matériaux qui y ont été exposés, doivent être manipulés comme s’ils pouvaient transmettre une infection et être éliminés avec toutes les précautions nécessaires (3). 6. Toutes durées, températures ou méthodes d’incubation autres que celles indiquées peuvent entraîner des résultats erronés. 7. Les réactifs sont à la dilution optimale. Une dilution supplémentaire peut entraîner une perte de coloration des antigènes. P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 2/12 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Une exposition à une luminosité élevée peut endommager le réactif de visualisation, le chromogène DAB+ liquide et la solution de substrat chromogène DAB+. Ne pas conserver les composants de la trousse ni effectuer de coloration sous une lumière vive, comme la lumière directe du soleil. Les résidus de paraffine peuvent produire des faux négatifs. L’utilisation de volumes de réactif autres que ceux recommandés peut entraîner une perte de l’immunoréactivité visible à PD-L1. Les résultats d’une étude de petite envergure ont mis en évidence une plage dynamique similaire de l’expression de PD-L1 dans des paires d’échantillons de patients atteints de CPNPC métastatique et primaire. Il est dès lors possible que des différences surviennent, chez un même patient, au niveau de l’expression de PD-L1 dans le cas de tumeurs primaires ou métastatiques. De grandes coupes de tissus peuvent nécessiter 3 x 150 µL de réactif. En règle générale, les personnes âgées de moins de 18 ans ne sont pas autorisées à manipuler ce produit. Les utilisateurs doivent être formés aux procédures de travail adéquates, aux propriétés dangereuses du produit et aux instructions de sécurité nécessaires. Se reporter à la fiche signalétique pour plus de plus amples renseignements. Porter un équipement de protection individuelle approprié pour éviter tout contact avec les yeux et la peau. Les solutions non utilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations locales, fédérales et provinciales. La fiche signalétique destinée aux utilisateurs professionnels est disponible sur demande. Danger Chromogène DAB+ : 1-5 % de tétrachlorure de biphényl-3,3’,4,4’-tétrayltétraammonium H350 Peut provoquer le cancer. H341 Susceptible d’induire des anomalies génétiques. P201 Se procurer les instructions avant utilisation. P202 Ne pas manipuler avant d’avoir lu et compris toutes les précautions de sécurité. P280 Porter des gants de protection. Porter un équipement de protection des yeux ou du visage. Porter des vêtements de protection. P308 + P313 EN CAS d’exposition prouvée ou suspectée : Consulter un médecin. P405 Garder sous clef. P501 Éliminer le contenu et le récipient conformément à toutes les réglementations locales, régionales, nationales et internationales. Mise en garde Solution de récupération des cibles EnVision FLEX, faible pH (50x) : 1-5 % d’acide citrique H319 Provoque une sévère irritation des yeux. H411 Toxique pour les organismes aquatiques, entraîne des effets néfastes à long terme. P280 Porter un équipement de protection des yeux ou du visage. P273 Éviter le rejet dans l’environnement. P264 Se laver soigneusement les mains après manipulation. P305 + P351 + EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX : Rincer avec précaution à l’eau pendant plusieurs minutes. Enlever P338 les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer. P337 + P313 Si l’irritation oculaire persiste : Consulter un médecin. P501 Éliminer le contenu et le récipient conformément à toutes les réglementations locales, régionales, nationales et internationales. Conservation Conserver tous les composants du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, y compris les lames de contrôle, dans l’obscurité et à une température entre 2 et 8 °C lorsqu’ils ne sont pas utilisés sur l’instrument Autostainer Link 48. Ne pas utiliser la trousse après la date de péremption indiquée sur la boîte. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles indiquées dans la notice, ceux-ci doivent être validés par l’utilisateur. Aucun signe évident n’indique l’instabilité de ce produit. Par conséquent, les contrôles positifs et négatifs doivent être analysés en même temps que les échantillons de patients. Préparation des échantillons Les échantillons doivent être manipulés de façon à préserver le tissu pour la coloration IHC. Des méthodes standard de traitement des tissus doivent être utilisées pour tous les échantillons. Coupes incluses en paraffine L’utilisation de coupes de tissu fixées au formol et incluses en paraffine est convenable. Les autres fixateurs n’ont pas été validés et peuvent produire des résultats erronés. Il est recommandé de respecter un temps de fixation de 12 à 72 heures dans une solution de formol neutre tamponné à 10 %. Toutefois, une étude menée sur un nombre limité d’échantillons a révélé que des temps de fixation de 4 à 168 heures dans une solution de formol neutre tamponné à 10 % n’altéraient pas systématiquement la détection de PD-L1. Des temps de fixation ≤ 3 heures peuvent causer une détection variable de PD-L1. Les échantillons doivent être inclus dans des blocs d’une épaisseur de 3 à 4 mm, fixés au formol puis déshydratés et nettoyés dans une série de bains d’alcools et de xylène, et enfin infiltrés par la paraffine fondue. La température de la paraffine ne doit pas dépasser 60 °C. L’utilisation de blocs de tissus fixés au formol et inclus en paraffine datant de cinq ans ou plus peut entraîner une perte de l’immunoréactivité à PD-L1. L’épaisseur des coupes d’échantillons tissulaires doit être comprise entre 4 et 5 µm. Après avoir été coupés, les tissus doivent être montés sur des lames Fisherbrand Superfrost Plus ou des lames porte-objets Dako FLEX IHC (réf. K8020), puis placés dans un four à 58 ± 2 °C pendant une heure. Afin de préserver l’antigénicité, les coupes de tissus, une fois montées sur les lames, doivent être conservées dans l’obscurité entre 2 et 8 °C, ou à température ambiante maximale de 25 °C, puis colorées dans les six mois suivant la coupe. Les conditions de conservation et de manipulation des lames ne doivent à aucun moment dépasser 25 °C après le montage, afin de garantir l’intégrité et l’antigénicité des tissus. L’utilisation du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx sur des tissus décalcifiés n’a pas été validée et n’est pas recommandée. P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 3/12 Préparation des réactifs Les réactifs suivants doivent être préparés avant de procéder à la coloration : Solution de récupération des cibles EnVision FLEX, faible pH, 50x Préparer une quantité suffisante de solution de récupération des cibles 1x, faible pH, en diluant la solution de récupération des cibles, faible pH, 50x selon un rapport de dilution de 1/50 avec de l’eau distillée ou désionisée (eau de qualité requise pour les réactifs); le pH de la solution de récupération des cibles 1x doit être de 6,1 ± 0,2. Un pH inférieur à 5,9 risque d’entraîner des résultats erronés. Un flacon de 30 mL de solution de récupération des cibles, faible pH, 50x, diluée selon un rapport de dilution de 1/50, donne 1,5 L de réactif 1x, suffisant pour remplir un réservoir PT Link, qui permettra de traiter jusqu’à 24 lames à la fois. Jeter la solution de récupération des cibles 1x après trois utilisations et ne pas l’utiliser plus de cinq jours après la dilution. Une solution de récupération des cibles EnVision FLEX, faible pH, 50x supplémentaire est disponible, au besoin (réf. K8005). Tampon de lavage EnVision FLEX, 20x Préparer une quantité suffisante de tampon de lavage en diluant le tampon de lavage 20x selon un rapport de dilution de 1/20 avec de l’eau distillée ou désionisée (eau de qualité requise pour les réactifs) pour les étapes de lavage. Conserver la solution 1x inutilisée à une température entre 2 et 8 °C pendant un maximum d’un mois. Jeter le tampon s’il semble trouble. Se reporter au guide de l’utilisateur de l’instrument Autostainer Link 48 pour plus d’information. Le tampon de lavage EnVision FLEX, 20x, est disponible sous la réf. K8007. Solution de substrat chromogène DAB+ Cette solution doit être bien mélangée avant utilisation. La formation d’un précipité dans la solution n’affecte pas la qualité de la coloration. Pour préparer la solution de substrat chromogène DAB+, ajouter 1 goutte de chromogène liquide DAB+ par mL de tampon de substrat DAB+ et mélanger. Une fois préparé, le substrat chromogène est stable pendant cinq jours s’il est conservé dans l’obscurité à une température entre 2 et 8 °C. Remarques importantes : Si on utilise un flacon entier de tampon de substrat DAB+, ajouter neuf gouttes de chromogène DAB+. Bien que l’étiquette indique 7,2 mL, il s’agit du volume utilisable, qui ne prend pas en compte le « volume mort » dans le flacon. La couleur du chromogène DAB+ liquide dans le flacon peut varier de transparent à lavande-brun. Cela n’affecte en rien les performances de ce produit. Diluer conformément aux instructions indiquées ci-dessus. L’ajout d’une quantité trop importante de chromogène liquide DAB+ dans le tampon de substrat DAB+ entraîne une détérioration du signal positif. Procédure de coloration sur la solution Autostainer Link Remarques sur la procédure L’utilisateur doit lire attentivement les présentes instructions et se familiariser avec tous les composants et les instruments avant utilisation (voir la section Précautions). Tous les réactifs doivent être portés à température ambiante (20-25 °C) avant la coloration immunologique. De même, toutes les incubations doivent être effectuées à température ambiante. Ne pas laisser les coupes de tissu sécher pendant la procédure de coloration. Les coupes de tissus séchées peuvent présenter une coloration non spécifique plus importante. Les étapes et les temps d’incubation requis pour la coloration sont tous préprogrammés dans le logiciel Dako Link. Se reporter aux guides de l’utilisateur des instruments Autostainer Link 48 et PT Link pour plus d’information sur les protocoles de programmation et le chargement des lames et des réactifs. Remarque : Les réactifs fournis dans cette trousse et les instructions correspondantes ont été conçus pour des performances optimales lors de leur utilisation avec les réactifs et matériels recommandés. Toute dilution supplémentaire des réactifs de la trousse, ainsi que toute modification des temps ou températures d’incubation, peut produire des résultats erronés ou discordants. Protocole de coloration Sélectionner le protocole de coloration PD-L1 IHC 22C3 pharmDx dans les options du menu déroulant Dako Link. Les étapes et les temps d’incubation requis pour la coloration sont tous préprogrammés dans l’instrument Autostainer Link 48. Si les protocoles PD-L1 IHC 22C3 pharmDx correspondants ne se trouvent pas sur votre serveur, communiquez avec votre représentant du service technique local pour les obtenir. Étape 1 : Procédure de déparaffinage, réhydratation et récupération des cibles (3 en 1) Pour plus de détails, se reporter au guide de l’utilisateur de l’instrument PT Link. Régler le préchauffage et le refroidissement de l’instrument PT Link (réf. PT100) à 65 °C. Régler le chauffage à 97 °C pendant 20 minutes. ►Remplir les réservoirs PT Link avec 1,5 L de solution de récupération des cibles, faible pH (solution de travail 1x) pour recouvrir les coupes tissulaires. ►Préchauffer la solution de récupération des cibles à 65 °C. ►Immerger les portoirs Autostainer contenant les coupes tissulaires fixées au formol et incluses en paraffine dans la solution de récupération des cibles préchauffée, faible pH (solution de travail 1x) présente dans le réservoir PT Link. Incuber pendant 20 minutes à 97 °C. ►Une fois la durée d’incubation de récupération des cibles terminée et la température redescendue à 65 °C, retirer du réservoir PT Link chaque portoir Autostainer comportant les lames et placer immédiatement le portoir Autostainer avec les lames dans un réservoir (p. ex. station de rinçage PT Link, réf. PT109) contenant un tampon de lavage dilué à température ambiante (réf. K8007). ►Incuber les lames dans le tampon de lavage dilué à température ambiante pendant 5 minutes. Étape 2 : Procédure de coloration Après la procédure de déparaffinage, réhydratation et récupération des cibles (3 en 1), les portoirs Autostainer avec les lames sont placés sur l’instrument Autostainer Link 48. L’instrument effectue le processus de coloration en appliquant le réactif approprié, en surveillant le temps d’incubation et en rinçant les lames entre les réactifs. Les temps d’incubation des réactifs sont préprogrammés dans le logiciel Dako Link. Étape 3 : Contre-coloration Les lames doivent être contre-colorées pendant 5 minutes avec de l’hématoxyline (Link) (réf. K8008). Le temps d’incubation de l’hématoxyline est préprogrammé dans le protocole. Étape 4 : Montage Milieu de montage permanent non aqueux requis. P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 4/12 Remarque : La coloration des lames pourrait s’atténuer. Ce phénomène est lié à plusieurs facteurs, notamment la contre-coloration, les matériels et méthodes de montage, ainsi que les conditions de conservation des lames. Pour limiter cette atténuation, conserver les lames dans l’obscurité à température ambiante (20-25 °C). Contrôle qualité La qualité des réactifs fournis avec le test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx a été contrôlée par immunohistochimie à l’aide des procédures de récupération des cibles et de coloration indiquées ci-dessus. Le non-respect des procédures recommandées pour la fixation, le traitement et l’inclusion des tissus par le laboratoire de l’utilisateur peuvent générer une variabilité significative des résultats. Des contrôles internes doivent être inclus à chaque cycle de coloration. Des différences au niveau de la fixation, du traitement et de l’inclusion des tissus au sein du laboratoire de l’utilisateur peuvent générer une variabilité significative des résultats, requérant des contrôles internes réguliers, en complément des lames de contrôle fournies dans la trousse (4). Aux États-Unis, les utilisateurs doivent consulter les consignes de contrôle qualité du Certification Program for Immunohistochemistry du College of American Pathologists (CAP), ainsi que le document Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline, du CLSI (5) pour plus de plus amples renseignements. Tableau 1 : Objectif du contrôle qualité quotidien Tissu Réactifs Fonction Contrôle positif : Tissu ou cellules contenant l’antigène cible à détecter. Le contrôle idéal est un tissu présentant une faible coloration positive, qui tend à se révéler plus sensible pour détecter une dégradation de l’antigène. Anticorps primaire et système de détection Contrôle toutes les étapes de l’analyse. Valide les réactifs et les procédures utilisés pour la coloration de PD-L1. Contrôle négatif : Tissu ou cellules devant être négatifs (peuvent être situés dans un tissu de patient ou un tissu de contrôle positif) Anticorps primaire et système de détection Détection d’une réactivité croisée inattendue de l’anticorps aux cellules/éléments cellulaires. Lame de contrôle fournie par Dako Anticorps primaire et système de détection Contrôle la procédure de coloration uniquement. Lame de tissu du patient * Réactif de contrôle négatif et Détection d’une coloration de fond non spécifique. même système de détection que celui utilisé avec l’anticorps primaire * Réactif provenant de la même espèce que l’anticorps primaire, mais pas dirigé contre le même antigène cible. Pour détecter une liaison non spécifique de l’anticorps, par exemple une liaison de la partie Fc de l’anticorps par le tissu. Lames de lignées cellulaires de contrôle (fournies) Chaque lame contient des sections de deux lignées cellulaires concentrées fixées au formol et incluses en paraffine : NCI-H226 avec expression de la protéine PD-L1 modérée et MCF-7 avec expression de la protéine PD-L1 négative. Une lame de contrôle doit être colorée avec l’anticorps primaire dirigé contre PD-L1 à chaque cycle de coloration. L’évaluation des lignées cellulaires des lames de contrôle fournies dans la trousse indique la validité du cycle de coloration. Elles ne doivent pas être utilisées à des fins d’interprétation des résultats de patient. Tissu de contrôle positif Les contrôles doivent être des échantillons de biopsie/chirurgie récents de la même indication tumorale que les échantillons du patient, fixés, traités et inclus dès que possible et de la même manière que les échantillons du patient. Les tissus de contrôle positif permettent d’indiquer si les tissus ont été préparés correctement et si des techniques de coloration appropriées ont été utilisées. Un tissu de contrôle positif pour chaque ensemble de conditions de test doit être inclus dans chaque cycle de coloration. Les tissus sélectionnés pour être utilisés comme tissus de contrôle positif doivent donner une coloration faible à modérée afin de permettre la détection de changements minimes dans la sensibilité du dosage. Les échantillons traités différemment des échantillons de patients permettent uniquement de valider les performances des réactifs, sans vérifier la préparation des tissus. Les tissus de contrôle positif connus ne doivent être utilisés que pour vérifier les bonnes performances des tissus traités et des réactifs de test, et NON pour établir un diagnostic spécifique aux échantillons de patient. Si les tissus de contrôle positif ne présentent pas la coloration positive appropriée, les résultats des échantillons à analyser doivent être considérés comme non valides. Tissu de contrôle négatif Utiliser un tissu de contrôle négatif (dont on sait qu’il est négatif pour PD-L1) de la même indication tumorale que l’échantillon du patient, fixé, traité et inclus de la même manière que les échantillons du patient, avec chaque cycle de coloration pour vérifier la spécificité de l’anticorps primaire et fournir une indication de la coloration de fond non spécifique. La variété des différents types cellulaires présents dans la plupart des coupes de tissu offre des sites de contrôle négatif internes (cela doit être vérifié par l’utilisateur). Si une coloration spécifique se produit dans le tissu de contrôle négatif, les résultats des échantillons de patient doivent être considérés comme non valides. Tissu de contrôle amygdalien (facultatif) Utiliser un tissu amygdalien humain fixé, traité et inclus de la même manière que les échantillons du patient comme matériel de contrôle supplémentaire pour vérifier la sensibilité, la spécificité et la coloration de fond non spécifique du dosage. Une forte coloration positive doit être détectée dans certaines régions de l’épithélium cryptique, et une coloration faible à modérée doit survenir au niveau des macrophages folliculaires des centres germinatifs. Une coloration négative doit être observée au niveau de l’endothélium, des fibroblastes et de l’épithélium de surface. Réactif de contrôle négatif Utiliser le réactif de contrôle négatif fourni au lieu de l’anticorps primaire sur une coupe de chaque échantillon de patient afin d’évaluer la coloration non spécifique et d’obtenir une meilleure interprétation de la coloration spécifique au niveau du site de l’antigène. La période d’incubation du réactif de contrôle négatif doit être équivalente à celle de l’anticorps primaire. Vérification du dosage Avant toute première utilisation d’une trousse de coloration lors d’une procédure diagnostique, l’utilisateur doit vérifier les performances du dosage en le testant sur une série de tissus à l’interne dont les performances IHC sont connues, représentant des tissus positifs et négatifs connus. Consulter les procédures de contrôle qualité décrites dans cette section de la notice d’emballage, ainsi que les exigences de contrôle qualité du Certification Program for Immunohistochemistry du CAP et/ou du document Quality Assurance for P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 5/12 Immunocytochemistry, Approved Guideline du CLSI (5). Ces procédures de contrôle qualité doivent être reproduites pour chaque nouveau lot d’anticorps ou dès qu’un changement est apporté aux paramètres de dosage. Interprétation de la notation – CPNPC Toutes les cellules tumorales viables présentes sur la totalité de la lame doivent être évaluées et incluses dans l’évaluation de la notation de PD-L1. Au moins 100 cellules tumorales viables doivent être présentes pour que l’échantillon soit considéré comme adéquat pour l’évaluation de la positivité pour PD-L1. Pour que la notation des échantillons colorés au moyen du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx soit correcte, il est essentiel que les cellules appropriées soient évaluées, que la localisation cellulaire adéquate soit déterminée et que l’intensité de coloration soit correctement interprétée. L’évaluation des lames doit être effectuée par un pathologiste à l’aide d’un microscope optique. Pour l’évaluation de la coloration immunocytochimique et la notation, un objectif à grossissement de 10-40x est approprié. Toute coloration membranaire perceptible des cellules tumorales doit être incluse dans la notation. Noter toute coloration membranaire partielle ou totale (≥ 1+) distincte de la coloration cytoplasmique. La coloration cytoplasmique doit être considérée comme une coloration non spécifique et doit être exclue de l’évaluation de l’intensité de coloration. Les cellules normales et les cellules immunitaires associées à la tumeur, telles que les lymphocytes infiltrants ou les macrophages, ne doivent pas être incluses dans la notation pour la détermination de la positivité pour PD-L1. Les échantillons tumoraux colorés avec le réactif de contrôle négatif doivent présenter une coloration spécifique nulle (0) et une coloration de fond < 1+. Le score TPS (Tumor Proportion Score) correspond au pourcentage de cellules tumorales viables présentant une coloration membranaire partielle ou totale (≥ 1+). L’échantillon est considéré positif pour la protéine PD-L1 si le score TPS est ≥ 50 % de cellules tumorales viables présentant une coloration membranaire de quelconque intensité (c’est-à-dire ≥ 1+). Pour chaque cycle de coloration, les lames doivent être examinées dans l’ordre présenté au tableau 2 pour déterminer la validité du cycle de coloration et permettre une évaluation de la coloration du tissu de l’échantillon. Pour des explications complémentaires, se reporter au manuel d’interprétation du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Tableau 2 : Ordre recommandé pour l’évaluation des lames Ordre recommandé Justification pour l’interprétation des lames 1. Lame de lignées La lame de lignées cellulaires de contrôle colorée avec l’anticorps primaire PD-L1 provenant du test PD-L1 cellulaires de contrôle IHC 22C3 pharmDx doit tout d’abord être examinée pour vérifier que tous les réactifs fonctionnent contenant les lignées correctement. La présence d’un produit de réaction brun (3,3’-diaminobenzidine, DAB) au niveau de la cellulaires positives et membrane cellulaire indique une réactivité positive. négatives pour PD-L1 Critères d’acceptation de NCI-H226 (lignée cellulaire de contrôle positive à la PD-L1) : Coloration de la membrane cellulaire ≥ 70 % des cellules à une intensité de coloration moyenne ≥ 2+. Coloration non spécifique d’intensité < 1+. Critères d’acceptation de MCF-7 (lignée cellulaire de contrôle négative pour PD-L1) : Pas de coloration spécifique. Coloration non spécifique d’intensité < 1+. Noter que la coloration de quelques cellules dans le culot de cellules MCF-7 peut parfois être observée. Les critères d’acceptation suivants sont applicables : la présence de ≤ 10 cellules totales avec une coloration différente de la membrane plasmatique est acceptable. Si l’une des lignées cellulaires de contrôle ne respecte pas ces critères, tous les résultats obtenus à partir des échantillons de patients doivent être considérés comme non valides. 2. Lame de tissu de La lame de tissu de contrôle positif doit être examinée ensuite. Cette lame permet de vérifier que la méthode contrôle positif de fixation et le processus de récupération des épitopes fonctionnent. Utiliser des cellules intactes pour (CPNPC) l’interprétation des résultats de coloration; les cellules nécrotiques ou dégénérées se colorent souvent de manière non spécifique. Une coloration brune de la membrane plasmatique doit être observée. La coloration non spécifique doit être ≤ 1+. 3. Lame de tissu de La lame de tissu de contrôle négatif doit être examinée après le tissu de contrôle positif pour vérifier la contrôle négatif spécificité du marquage de l’antigène cible par l’anticorps primaire. L’absence de coloration spécifique sur la (CPNPC) lame de tissu de contrôle négatif confirme l’absence de réactivité croisée de la trousse aux cellules/composants cellulaires. D’autre part, les portions négatives du tissu de contrôle positif peuvent servir de tissu de contrôle négatif, mais cela doit être vérifié par l’utilisateur. Si une coloration membranaire spécifique non désirée se produit sur la lame de tissu de contrôle négatif, les résultats des échantillons de patient doivent être considérés comme non valides. 4. Lame de tissu de Examiner les échantillons de patient colorés avec le réactif de contrôle négatif issu du test PD-L1 IHC 22C3 patient colorée en pharmDx. L’absence de coloration membranaire permet de vérifier le marquage spécifique de l’antigène cible utilisant le réactif de par l’anticorps primaire. Toute coloration observée dans la région du cytoplasme de l’échantillon traité avec le contrôle négatif réactif de contrôle négatif doit être considérée comme une coloration non spécifique. 5. Lame de tissu de Examiner la totalité de la lame de l’échantillon de patient colorée avec l’anticorps primaire anti-PD-L1 issu du test patient colorée en PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, après avoir confirmé la validité de l’ensemble des lames de contrôle. L’intensité de utilisant l’anticorps coloration positive doit être évaluée dans le contexte de la coloration de fond non spécifique observée sur la primaire lame du réactif de contrôle négatif pendant le même cycle. À l’instar de tout test immunocytochimique, un résultat négatif signifie que l’antigène n’a pas été détecté et pas forcément que l’antigène est absent des cellules/tissus testés. Se reporter aux sections Résumé et explication, Limites et Caractéristique de performance pour obtenir de l’information spécifique sur l’immunoréactivité du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Une coloration de la membrane linéaire partielle et/ou périphérique complète des cellules tumorales indique une coloration positive pour PD-L1. Une coloration granulaire du cytoplasme n’est pas considérée comme une coloration positive. Recommandations supplémentaires pour l’interprétation de la coloration avec le test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 1. Une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de l’échantillon tissulaire est recommandée pour la première évaluation de l’échantillon de patient. Le dosage PD-L1 IHC 23C3 pharmDx et la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine doivent être pratiqués sur des coupes consécutives issues du même bloc de paraffine de l’échantillon. 2. Pour vérifier la coloration membranaire, utiliser un grossissement de 10 à 40x. P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 6/12 3. Divers éléments non ciblés, comme les cellules immunitaires associées à la tumeur (macrophages, par exemple) ou les cellules stromales, peuvent également présenter une coloration positive pour PD-L1. Ces cellules ne doivent toutefois pas être incluses dans la notation. Limites générales 1. L’immunohistochimie est un processus diagnostique à plusieurs étapes qui requiert une formation spécialisée pour la sélection des réactifs appropriés; la sélection, la fixation et le traitement des tissus; la préparation des lames IHC; et l’interprétation des résultats de coloration. 2. La coloration des tissus dépend de la manipulation et du traitement corrects des tissus avant la coloration. Des procédures de fixation, de congélation, de décongélation, de lavage, de séchage, de chauffage, de coupe inadaptées ou une contamination par d’autres tissus ou fluides peuvent générer des artéfacts, un piégeage des anticorps ou des faux négatifs. Des résultats incohérents peuvent être dus à des variations dans les méthodes de fixation et d’inclusion, ou à des irrégularités inhérentes au tissu. 3. Une contre-coloration excessive ou incomplète peut conduire à une interprétation erronée des résultats. 4. L’interprétation clinique de toute coloration positive ou de son absence doit être effectuée dans le contexte de la présentation clinique, de la morphologie et d’autres critères histopathologiques. L’interprétation clinique de toute coloration, ou de l’absence de coloration, doit être complétée par des études morphologiques et des contrôles appropriés ainsi que par d’autres tests diagnostiques. L’interprétation de la coloration est sous la responsabilité d’un pathologiste qualifié devant être familiarisé avec les anticorps, les réactifs et les méthodes de coloration utilisés. La coloration doit être réalisée dans un laboratoire autorisé et certifié, sous la supervision d’un pathologiste responsable de l’examen des lames colorées et qui s’assure de la pertinence des contrôles positifs et négatifs. 5. Les tissus de patients infectés par le virus de l’hépatite B et porteurs de l’antigène de surface de l’hépatite B (HBsAg) peuvent présenter une coloration non spécifique avec la peroxydase de raifort (6). 6. Les réactifs peuvent présenter des réactions inattendues dans des types de tissus non testés précédemment. La possibilité de réactions inattendues même dans les types de tissus préalablement testés ne peut pas être complètement écartée, du fait de la variabilité biologique de l’expression des antigènes dans les néoplasmes, ou autres tissus pathologiques. Contacter l’assistance technique Dako pour faire part de ces réactions inattendues. 7. Des faux positifs peuvent être dus à une liaison non immunologique des protéines ou des produits de réaction du substrat. Ils peuvent aussi être causés par une activité pseudoperoxydasique (érythrocytes) ou par une activité peroxydasique endogène (cytochrome C) (6). 8. Les réactifs fournis dans cette trousse et les instructions correspondantes ont été conçus pour des performances optimales. Toute dilution supplémentaire des réactifs de la trousse, ainsi que toute modification des temps ou températures d’incubation, peut produire des résultats erronés ou discordants. Limitations spécifiques du produit 1. Les faux négatifs peuvent être dus à une dégradation de l’antigène dans les tissus au fil du temps. Les échantillons doivent être colorés dans les six mois suivant le montage des tissus sur les lames lorsqu’ils sont conservés dans l’obscurité à une température entre 2 et 8 °C. 2. Pour des résultats optimaux et reproductibles, la protéine PD-L1 requiert un prétraitement de récupération des cibles lorsque les tissus sont fixés en routine (formol neutre tamponné) et inclus en paraffine. 3. Ne pas utiliser de réactifs portant un numéro de lot différent ou provenant de trousses d’autres fabricants. La seule exception est la solution de récupération des cibles EnVision FLEX, faible pH, 50x, qui peut être obtenue au besoin sous la réf. K8005. 4. Les lignées cellulaires de contrôle colorées doivent être utilisées uniquement pour la validation du cycle de coloration et non pour noter la réaction de coloration dans les coupes de tissus. 5. L’utilisation du test Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx sur des tissus fixés par d’autres produits que le formol n’a pas été validée. Évaluation des performances cliniques L’utilité clinique du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx a été examinée dans le cadre d’une étude multicentrique et ouverte avec répartition aléatoire visant à évaluer l’innocuité et l’efficacité de KEYTRUDA chez des patients atteints de CPNPC au stade avancé. Les patients inclus dans l’étude étaient porteurs de PD-L1 (d’après un test de détection) et avaient vu leur maladie progresser malgré un traitement chimiothérapeutique à base de platine. Avant de recevoir KEYTRUDA, les patients affichant des anomalies tumorales au niveau du récepteur EGFR ou du gène ALK avaient vu leur maladie progresser en dépit d’un traitement approuvé par la FDA pour le traitement de ces anomalies. Une évaluation du statut tumoral a été réalisée toutes les neuf semaines. Le principal critère d’évaluation de l’efficacité reposait sur le taux de réponse globale (TRG) (selon les nouveaux critères RECIST 1.1 évalués à l’insu par un comité d’examen central indépendant) et la durée de la réponse (7). Pour évaluer l’utilité clinique du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, des échantillons archivés tirés d’études cliniques ont été rétrospectivement analysés dans un laboratoire de référence basé aux États-Unis à l’aide du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Chez les patients atteints d’un CPNPC porteurs de PD-L1 selon le test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, KEYTRUDA® (pembrolizumab) était associé à un fort taux de réponse globale et à une durée de réponse cliniquement significative. Selon le dosage de recherche, 223 patients atteints de CPNPC au total ont été inscrits dans l’étude. Sur ces 223 patients, les tissus tumoraux de 220 patients ont été rétrospectivement analysés avec le test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Les échantillons de 61 patients exprimaient PD-L1 (≥ 50 % de cellules tumorales viables présentant une coloration membranaire de quelconque intensité), tandis que les échantillons de 104 patients n’exprimaient pas PD-L1 (< 50 % de cellules tumorales viables présentant une coloration membranaire de quelconque intensité). Les caractéristiques initiales des 61 patients dont la tumeur exprimait PD-L1 au test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx étaient les suivantes : âge médian de 60 ans (34 % âgés de 65 ans ou plus); 61 % d’hommes; 79 % de race blanche; et indice de performance ECOG de 0 (34 %) ou de 1 (64 %). Les caractéristiques de la maladie étaient les suivantes : cancers épidermoïdes (21 %) et non épidermoïdes (75 %); leucémies de type M1 (98 %); métastases cérébrales (11 %); et un (26 %), deux (30 %) ou trois traitements antérieurs et plus (44 %). Le statut des mutations chez les patients concernait le récepteur EGFR (10 %), le gène ALK (0 %) ou le gène Kras (16 %). Les résultats de l’efficacité pour le CPNPC sont résumés au tableau 3. P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 7/12 Tableau 3 : Réponse à KEYTRUDA® (pembrolizumab) chez les patients atteints d’un CPNPC ayant déjà reçu un traitement auparavant et ayant un score TPS pour la PD-L1 ≥ 50 % Critère d’évaluation N = 61 Taux de réponse globale TRG (%) (IC à 95 %) 41 % (29, 54)* Réponse complète 0% Réponse partielle 41 % Durée de la réponse Durée médiane en mois (plage) Non atteinte (2,1+, 9,2+) % de réponse continue 84 %† * Chez les patients présentant un score TPS pour la PD-L1 < 50 % (n = 104), le TRG était de 13 % (8, 22) † Inclut 11 patients affichant une réponse continue d’au moins six mois. Sur les 61 patients, 25 (soit 41 %) ont obtenu une réponse partielle. Sur ces 25 patients, 21 (84 %) affichaient une réponse continue à la date finale d’analyse des données. À cette date, la durée de réponse était comprise entre 2,1 et 9,2 mois pour les 25 patients ayant obtenu une réponse partielle. Les patients ayant des durées de réponse de 2,1 et de 9,2 mois présentaient une réponse continue à la date finale d’analyse des données, ce qui est indiqué par l’ajout du symbole « + » dans le tableau. La durée de réponse médiane calculée sur la base du nombre d’événements et de leur durée n’était pas atteinte à la date finale d’analyse des données. Évaluation des performances non cliniques Sensibilité analytique La sensibilité analytique du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx a été testée sur des échantillons fixés au formol et inclus en paraffine de 127 cas uniques de CPNPC de stade I à IV à l’aide d’un lot de production fabriqué. L’évaluation de l’expression de PD-L1 a mis en évidence une coloration sur une plage de 0 à 100 % de cellules tumorales positives et à une intensité de coloration de 0 à 3. Répétabilité/reproductibilité externe La répétabilité et la reproductibilité externe du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx ont été évaluées chez Dako et dans trois sites de tests externes. Les données de performances sont présentées aux tableaux 4 et 5. En ce qui concerne les études de répétabilité menées chez Dako, le pourcentage de concordance négative (PCN), le pourcentage de concordance positive (PCP) et la concordance globale (CG) ont été déterminés en utilisant les méthodes illustrées au tableau 4. Les études de répétabilité ayant abouti à une concordance de 100 %, les intervalles de confiance ont été calculés à l’aide de la méthode du score de Wilson, en fonction du nombre de comparaisons indépendantes par paire. Pour ce qui est des études de reproductibilité externe, le pourcentage moyen de concordance négative (PMCN), le pourcentage moyen de concordance positive (PMCP) et la concordance globale (CG) ont été déterminés en utilisant les méthodes illustrées au tableau 5. Les pourcentages moyens de concordance ont été calculés, car il n’existe aucune référence naturelle dans les paramètres de reproductibilité, comme le site et l’observateur. Quant aux intervalles de confiance des pourcentages moyens de concordance, ils ont été déterminés à l’aide de la méthode d’auto-amorçage des percentiles. (Il faut noter que les études de répétabilité n’ont pas été analysées avec des intervalles de confiance d’auto-amorçage, ces derniers ne pouvant pas être calculés sur des données présentant une discordance nulle.) Tableau 4 : Répétabilité du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx analysée à un site Étude de répétabilité Seuil diagnostique Plan de l’étude % de concordance (IC à 95 %) Chacun des 16 échantillons de patients atteints de Seuil ≥ 50 % : PCN 100 % (92,9-100 %) CPNPC (10 négatifs pour PD-L1 et 6 positifs) avec PCP 100 % (88,6-100 %) une plage d’expression IHC de PD-L1 a été testé CG 100 % (95,4-100 %) sur chacun des six instruments Autostainer Link 48. Inter-opérateurs ≥ 50 % Chacun des 16 échantillons de patients atteints de Seuil ≥ 50 % : PCN 100 % (92,7-100 %) CPNPC (10 négatifs pour PD-L1 et 6 positifs) avec PCP 100 % (88,6-100 %) une plage d’expression IHC de PD-L1 a été testé CG 100 % (95,4-100 %) par six analystes sur un instrument Autostainer Link 48. Inter-jours ≥ 50 % Chacun des 16 échantillons de patients atteints de Seuil ≥ 50 % : PCN 100 % (92,9-100 %) CPNPC (10 négatifs pour PD-L1 et 6 positifs) avec PCP 100 % (88,6-100 %) une plage d’expression IHC de PD-L1 a été testé CG 100 % (95,4-100 %) sur six jours non consécutifs sur l’instrument Autostainer Link 48. Inter-lots ≥ 50 % Chacun des 16 échantillons de patients atteints de Seuil ≥ 50 % : PCN 100 % (92,6-100 %) CPNPC (8 négatifs pour PD-L1 et 8 positifs) avec PCP 100 % (92,6-100 %) une plage d’expression IHC de PD-L1 a été testé CG 100 % (96,2-100 %) avec trois réplicats et chacun des trois lots de réactifs sur l’instrument Autostainer Link 48. Intra-cycle ≥ 50 % Chacun des 16 échantillons de patients atteints de Seuil ≥ 50 % : PCN 100 % (92,9-100 %) CPNPC (10 négatifs pour PD-L1 et 6 positifs) avec PCP 100 % (88,6-100 %) une plage d’expression IHC de PD-L1 a été testé CG 100 % (95,4-100 %) avec six réplicats en un cycle sur l’instrument Autostainer Link 48. Intra-jour ≥ 50 % Chacun des 16 échantillons de patients atteints de Seuil ≥ 50 % : PCN 100 % (88,3-100 %) CPNPC (10 négatifs pour PD-L1 et 6 positifs) avec PCP 100 % (82,4-100 %) une plage d’expression IHC de PD-L1 a été testé CG 100 % (92,4-100 %) selon deux cycles en un jour, répétés sur trois jours, sur l’instrument Autostainer Link 48. PCA = pourcentage de concordance négative; PCP = pourcentage de concordance positive; CG = concordance globale Inter-instruments ≥ 50 % P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 8/12 Tableau 5 : Reproductibilité du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx analysée à trois sites externes Étude de Seuil diagnostique reproductibilité Plan de l’étude % de concordance (IC à 95 %) Inter-sites ≥ 50 % Chacun des 36 échantillons de patients atteints de ≥ 50 % : PMCN 90,3 % (84,4-95,2 %) CPNPC (21 négatifs pour PD-L1 et 15 positifs) avec une PMCP 85,2 % (75,6-92,9 %) plage d’expression IHC de PD-L1 a été testé sur cinq CG 88,3 % (81,4-94,3 %) jours non consécutifs. L’analyse inter-sites a été effectuée sur les trois sites sur un total de 2 700 comparaisons par paire. Intra-site ≥ 50 % Chacun des 36 échantillons de patients atteints de ≥ 50 % : PMCN 91,9 % (88,8-94,8 %) CPNPC (21 négatifs pour PD-L1 et 15 positifs) avec une PMCP 87,6 % (82,5-92,2 %) plage d’expression IHC de PD-L1 a été testé sur cinq CG 90,2 % (86,3-93,7 %) jours non consécutifs à chacun des trois sites d’étude. L’analyse intra-site a été effectuée pour les trois sites sur un total de 1 080 comparaisons par paire. Inter≥ 50 % Une évaluation de 62 échantillons de patients atteints de ≥ 50 % : PMCN 92,6 % (87,8-96,7 %) observateurs CPNPC (30 négatifs pour PD-L1 et 32 positifs) avec une PMCP 92,8 % (88,1-96,8 %) plage d’expression IHC de la PD-L1, colorés avec le test CG 92,7 % (88,1-96,8 %) PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, a été effectuée par trois pathologistes, un à chacun des trois sites d’étude, sur trois jours non consécutifs. L’analyse inter-observateurs a été effectuée aux trois sites sur un total de 1 674 comparaisons par paire. Intra≥ 50 % Une évaluation de 62 échantillons de patients atteints de ≥ 50 % : PMCN 96,4 % (94,0-98,5 %) observateur CPNPC (30 négatifs pour PD-L1 et 32 positifs) avec une PMCP 96,5 % (94,3-98,6 %) plage d’expression IHC de la PD-L1, colorés avec le test CG 96,4 % (94,3-98,6 %) PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, a été effectuée par trois pathologistes, un à chacun des trois sites d’étude, sur trois jours non consécutifs. L’analyse intra-observateur a été effectuée pour les trois sites sur un total de 558 comparaisons par paire. PMCN = pourcentage moyen de concordance négative; PMCP = pourcentage moyen de concordance positive; CG = concordance globale Tissus sains : Une coloration de la membrane plasmatique a été observée sur des cellules immunitaires et des cellules d’origine épithéliale. Une coloration cytoplasmique a été constatée dans certains types de cellules, mais n’a pas été considérée comme une coloration positive. Le tableau 6 résume l’immunoréactivité du clone 22C3 de l’anticorps monoclonal murin anti-PD-L1 sur le panel recommandé de tissus sains. Tous les tissus ont été fixés au formol et inclus en paraffine, puis colorés à l’aide du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx conformément aux instructions de la présente notice. Aucun résultat inattendu n’a été constaté dans les types cellulaires ou tissulaires testés. La coloration observée s’est révélée cohérente avec les publications mentionnées concernant l’expression IHC de PD-L1 dans les tissus sains (8,9). Tableau 6 : Résumé de la réactivité des tissus sains au test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Type de tissu Coloration positive de la Coloration cytoplasmique positive : (nbre testé) membrane plasmatique : Éléments tissulaires Éléments tissulaires Amygdale (3) 3/3 épithélium cryptique 0/3 2/3 centre germinatif (macrophages) Cellules mésothéliales (2) 0/2 0/2 Cerveau (3) 0/3 0/3 Cervelet (3) 0/3 0/3 Col de l’utérus (3) 1/3 épithélium 0/3 Côlon (3) 2/3 macrophages 0/3 Estomac (3) 2/3 lymphocytes 1/3 glandes gastriques 1/3 glandes gastriques Foie (3) 1/3 macrophages 0/3 1/3 hépatocytes Glande salivaire (3) 0/3 0/3 Hypophyse (3) 1/3 hypophyse antérieure 1/3 hypophyse antérieure 1/3 hypophyse postérieure 1/3 hypophyse postérieure Intestin grêle (3) 0/3 0/3 Moelle osseuse (3) 3/3 mégacaryocytes 3/3 mégacaryocytes Muscle cardiaque (3) 0/3 0/3 Muscle squelettique (3) 0/2 0/2 Nerf périphérique (3) 0/3 1/3 tissu conjonctif/vaisseaux Œsophage (3) 0/3 0/3 Ovaire (3) 0/3 0/3 Pancréas (3) 0/3 0/3 Parathyroïde (3) 1/3 épithélium glandulaire 0/3 Peau (3) 0/3 0/3 Poumon (3) 3/3 macrophages alvéolaires 0/3 Prostate (2) 2/2 épithélium 0/2 Rate (3) 2/3 macrophages 0/3 Rein (3) 1/3 épithélium tubulaire 0/3 Sein (3) 0/3 0/3 Surrénal (3) 0/3 1/3 cellules médullaires Testicule (3) 0/3 0/3 Thymus (3) 3/3 épithélium médullaire 0/3 Coloration non spécifique 0/3 0/2 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/2 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/2 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 9/12 Type de tissu (nbre testé) Thyroïde (3) Utérus (3) Coloration positive de la membrane plasmatique : Éléments tissulaires 0/3 0/3 Coloration cytoplasmique positive : Éléments tissulaires 0/3 0/3 Coloration non spécifique 0/3 0/3 Tissus néoplasiques : Une coloration de la membrane plasmatique a été observée sur des cellules immunitaires et des cellules d’origine épithéliale. Une coloration cytoplasmique a été constatée dans certains types de cellules, mais n’a pas été considérée comme une coloration positive. Le tableau 7 résume l’immunoréactivité du clone 22C3 de l’anticorps monoclonal murin anti-PD-L1 sur un panel de tissus néoplasiques. Tous les tissus ont été fixés au formol et inclus en paraffine, puis colorés à l’aide du test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx conformément aux instructions de la présente notice. Aucun résultat inattendu n’a été constaté dans les échantillons tumoraux testés. La coloration observée s’est révélée cohérente avec les publications mentionnées concernant l’expression IHC de PD-L1 dans les tissus néoplasiques (8-11). Tableau 7 : Résumé de la réactivité des tissus néoplasiques au test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Échantillons positifs Type de tumeur Site pour PD-L1/total N = 159 Appendice 0/1 Col de l’utérus, type endocervical 0/1 Côlon 0/5 Côlon, atteinte métastatique au foie 0/1 Côlon, mucineux 0/1 Estomac 0/6 Estomac, mucineux 0/1 GI, atteinte métastatique aux poumons 0/1 Glande salivaire/parotide 0/2 Intestin grêle 0/2 Œsophage 0/1 Ovaire 0/1 Ovaire, endométrioïde 0/1 Ovaire, mucineux 0/1 Ovaire, séreux 0/1 Adénocarcinome Pancréas 0/2 Pancréas, canalaire 0/3 Poumon 1/4 Prostate 0/5 Rectum 0/4 Sein, canalaire invasif 0/7 Sein, canalaire invasif, atteinte métastatique 0/1 dans les ganglions lymphatiques Sein, CCIS 0/2 Tête et cou, palais dur 0/1 Thyroïde, folliculaire 0/1 Thyroïde, folliculaire-papillaire 0/1 Thyroïde, papillaire 0/3 Utérus, cellules claires 0/1 Utérus, endomètre 0/3 Vésicule biliaire 1/5 Astrocytome Cerveau 0/3 Carcinome Nasopharynx, CNP 0/1 Carcinome à cellules en bague à chaton, 0/1 atteinte métastatique à l’ovaire Carcinome à cellules en bague à chaton Côlon 0/1 Carcinome à petites cellules Poumon 0/1 Carcinome basocellulaire Peau 0/1 Carcinome corticosurrénal Surrénal 0/1 Carcinome embryonnaire Testicule 0/1 Carcinome épidermoïde œsophagien, atteinte métastatique dans les ganglions 0/1 lymphatiques Col de l’utérus 2/5 Œsophage 0/7 Carcinome épidermoïde Peau 0/2 Poumon 1/2 Tête et cou 0/2 Utérus 0/1 Carcinome hépatocellulaire Foie 0/5 Carcinome médullaire Thyroïde 0/1 Rein 0/1 Carcinome transitionnel Vessie 0/6 Chondrosarcome Os 0/1 Chordome Cavité pelvienne 0/1 Épendymome Encéphale 0/1 Glioblastome Encéphale 0/1 Hépatoblastome Foie 0/1 Hypernéphrome Hypernéphrome Cellules claires Rein 0/6 P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 10/12 Type de tumeur Hypernéphrome Papillaire Interstitialome Léiomyosarcome Lymphome Lymphome Anaplasique à grandes cellules Lymphome Diffus à cellules B Lymphome Hodgkinien Lymphome Non hodgkinien Médulloblastome Mélanome Méningiome Mésothéliome Neuroblastome Neurofibrome Ostéosarcome Phéochromocytome Rhabdomyosarcome Séminome Spermatocytome Synovialome Thymome Tumeur des cellules des îlots pancréatiques Tumeur neuroectodermique primitive (TNEP) Site Rein Côlon Intestin grêle Rectum Tissu mou, paroi thoracique Vessie Échantillons positifs pour PD-L1/total N = 159 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 Ganglion lymphatique 0/1 Ganglion lymphatique Ganglion lymphatique Ganglion lymphatique Encéphale Cavité nasale Rectum Encéphale Péritoine Rétropéritoine Tissu mou, région lombaire Os Surrénal Prostate Rétropéritoine Tissu mou, embryonnaire Testicule Testicule Cavité pelvienne Médiastin 0/4 2/2 1/1 0/1 0/1 0/1 0/2 0/1 0/1 0/1 0/2 0/1 0/1 0/1 0/1 0/2 0/2 0/1 1/1 Pancréas 0/1 Rétropéritoine 0/1 Dépannage Tableau 8 : Dépannage Problème 1. Aucune coloration des lames Cause probable 1a. Erreur de programmation 1b. Absence de réaction à la solution de substrat chromogène DAB+ (DAB) 1c. Azoture de sodium dans le tampon de lavage 1d. Dégradation de la lame de contrôle 2a. Faible coloration des lames d’échantillons 2b. Coloration faible des lames d’échantillons ou de la lignée cellulaire positive sur la lame de contrôle fournie par Dako 3. Coloration de fond excessive des lames 4. Le tissu se détache des lames 5. Coloration spécifique trop forte 2a. Méthode de fixation inappropriée 2b. Récupération inadéquate des cibles 3a. Élimination incomplète de la paraffine 3b. Les lames ont séché pendant leur chargement sur l’instrument Autostainer Link 48 3c. Liaison non spécifique des réactifs aux coupes de tissus 4. Utilisation de lames porte-objets incorrectes 5a. Méthode de fixation inappropriée Mesure suggérée 1a. Vérifier que le programme PD-L1 IHC 22C3 pharmDx a été sélectionné pour la programmation des lames 1b. Vérifier que la solution de substrat chromogène DAB+ a été préparée correctement 1c. Utiliser uniquement le tampon de lavage Dako (réf. K8007) 1d. Vérifier la date de péremption et les conditions de conservation de la trousse indiquées sur la boîte 2a. S’assurer que seuls des fixateurs et des méthodes de fixation approuvés ont été utilisés 2b. Vérifier que la procédure de prétraitement 3 en 1 a été correctement effectuée 3a. Vérifier que la procédure de prétraitement 3 en 1 a été correctement effectuée 3b. S’assurer que les lames demeurent humides à l’aide d’un tampon pendant leur chargement et avant de lancer le cycle 3c. Vérifier que la fixation des échantillons est correcte ou rechercher la présence de nécrose 4. Utiliser des lames porte-objets Dako FLEX IHC (réf. K8020) ou des lames chargées (comme Fisherbrand Superfrost Plus) 5a. S’assurer que seuls des fixateurs et des méthodes de fixation approuvés ont été utilisés 5b. Utiliser uniquement le tampon de lavage Dako (réf. K8007) 6. Ceci est normal et n’affecte pas la coloration 5b. Utilisation d’un tampon de lavage inapproprié 6. La solution de restauration des 6. Lorsqu’elle est chauffée, la solution cibles est trouble lorsqu’elle est de récupération des cibles prend un chauffée aspect trouble REMARQUE : Si le problème ne peut pas être attribué à l’une des causes mentionnées ci-dessus, ou en cas d’échec de la mesure corrective, contacter l’assistance technique Dako pour obtenir de l’aide. Pour de plus amples renseignements sur les techniques de coloration et la préparation des échantillons, consulter le manuel de formation Dako sur les méthodes de coloration immunohistochimique (12) (disponible auprès de Dako). P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 11/12 Références 1. 2. R. Phelps, et al., Journal of Cellular Biochemistry Supplement (1966) 24:32-91. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976. 3. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN 1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 – 1898 USA, 2000. 4. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194. 5. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999. 6. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B s surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73:626. 7. Garon EB, Rizvi NA, Hui R, Leighl N, Balmanoukian AS, Eder JP, et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. New Eng J Med 2015; 372:2018-28. 8. Okazaki T, Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International Immunol 2007(19); 7:813. 9. Brown JA, Dorfman DM, Ma F-R, Sullivan EL, Munoz O, Wood CR, et al. Blockade of Programmed Death-1 Ligands on Dendritic Cells Enhances T Cell Activation and Cytokine Production. J Immunol 2003;170:1257. 10. Cooper WA, Tran T, Vilain RE, Madore J, Seliger CI, Kohonen-Cornish M, et al. PD-L1 expression is a favorable prognostic factor in early stage non-small cell carcinoma. Lung Cancer 2015; 89:181. 11. Chen B, Chapuy B, Ouyang J et al. PD-L1 Expression Is Characteristic of a Subset of Aggressive B-cell Lymphomas and VirusAssociated Malignancies. Clin Cancer Res 2013; 19:3462-3473. 12. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013. Édition 11/16 P04453CA_02/SK00621-5CA/2016.11 p. 12/12
