Rôle de la résistance multi-drogues dans les tumeurs

INTRODUCTION
La résistance à la chimiothérapie est un obstacle
majeur pour le traitement de nombreuses patholo-
gie malignes, dont les leucémies, les sarcomes et la
plupart des carcinomes, en particulier hépatiques,
rénaux, surrénaux et coliques. La tumeur exprime
d'emblée un niveau élévé de resistance à un large
éventail de drogues cytotoxiques, comme dans le
cancer rénal ou prostatique, ou bien des sous-popu-
lations de cellules résistantes sont séléctionnées
pendant les premiers cycles de chimiothérapie pour
des tumeurs initialement répondeuses et les réci-
dives sont peu chimio-sensibles. L’analyse des
mécanismes de chimio-résistance et leur controle
par des agents chimio-sensibilisants devrait per-
mettre un meilleur emploi des drogues de chimio-
thérapie usuelles [49, 52].
Après emploi de monochimiothérapie, un certain
nombre de tumeurs exprime une résistance primaire
ou aquise à différentes petites molécules d’origine
naturelle telles que doxorubicine, vincristine, col-
chicine, etoposide et d’autres. Cette résistance
multi-drogues (MDR) pour cette large catégorie de
chimiothérapies est associée à une diminution de la
captation intra-cellulaire des drogues et à une aug-
mentation de leur efflux, d’où une diminution de
leur concentration intra-cellulaire, et à l’augmenta-
tion de l’expression du produit d’un gène fortement
conservé, le gène MDR, codant pour une protéïne
responsable d’un efflux cellulaire actif et énerg i e -
dépendant appelée glycoprotéïne P (P-gp)[1, 19,
49]. Le gène MDR est conservé lors de l’évolution
des espèces, des bactéries aux mammifères, et chez
l’homme cette famille comporte le MDR 1, respon-
sable de la chimiorésistance, et le MDR 2, de rôle
inconnu. Le gène MDR 1 est transcrit en un ARN
messager de 4,5 kb et exprimé par une protéïne
transmembranaire de 170 000 Da, la glycoprotéïne
P, qui fonctionne alternativement comme un canal
de transport du chlore ou comme une pompe
e ffluente dépendant de l’ATP [18), active pour de
nombreux substrats. La séquence d’acides aminés a
montré que P-gp est constituée de deux séquences
homologues, composées chacunes de six segments
trans-membranaires et d’un site pour nucléotide,
disposé en canal trans-membranaire. La plupart des
tumeurs expriment P-gp, au moins en faible quan-
tité dans une sous-population cellulaire, ou pro-
viennent de tissus l’exprimant et subissant une
sélection pendant la chimiothérapie, responsable de
chimio-résistance. Il faut noter que la résistance
dépendant du MDR est limitée aux petites molé-
cules hydrophobes sus-mentionnées et que la résis-
tance à des agents tels que cis-platine, methotrexa-
te,5-fluorouracile, alkylants et autres dépend
d’autres mécanismes de détoxication.
DISTRIBUTION ET INHIBITION DE P-gp
1. Détection de P-gp (produit de MDR 1)
Il est indispensable de disposer de marqueurs
fiables de résistance dans les biopsies tumorales
pour sélectionner le protocole thérapeutique adapté
ou pour décider de l’emploi de modificateurs de la
résistance. L’expression et l’activité de P-gp peu-
vent être évaluées de différentes façons. L’ A R N
messager codé par MDR 1 peut être détecté par
hybridation avec différentes sondes spécifiques
(Northern Blot, Slot Blot, amplification par PCR-
Manuscrit reçu le 20 décembre 1992
Adresse pour correspondance : Dr. G. Theyer, Urologische
Abteilung, Wilhelminenspital, Vienna, Autriche
Traduction : Dr. Jean-Dominique Doublet
Progrès en Urologie (1993), 3, 385-392
385
Rôle de la résistance multi-drogues dans
les tumeurs génito-urinaires
Gerhard THEYER (1), Gerhard HAMILTON (2)
(1) Service d'Urologie, Wilhelminenspital, Vienna, Autriche
(2) Service de Chirurgie, University School of Medicine, Vienna, Autriche
ARTICLE DE REVUE

RT), la protéïne elle-même peut être détectée par
Western Blot, immunofluorescence, immuno-histo-
chimie avec un des anticorps monoclonaux dispo-
nibles [40, 45]. Le transport trans-membranaire
dépendant de P-gp peut être évalué par mesure de
l ’ e fflux actif de substrats marqués ou radioactifs
(rhodamine 123 ou 14C-doxorubicine) et par
réversion de la chimiorésistance par des chimio-
sensibilisateurs spécifiques.
Chaque méthode a ses difficultés intrinsèques: la
PCR, très sensible peut détecter le MDR 1 des vais-
seaux ou du stroma de la tumeur, les techniques de
blotting peuvent être en défaut pour des petites
populations cellulaires hautement résistantes et les
anticorps monoclonaux ne peuvent affirmer la
signification fonctionnelle de la présence de P-gp,
ou ne pas marquer de cellules positives dans de
grandes tumeurs hétérogènes. De plus, les anticorps
monoclonaux C219 [2], JSB-1 [42] et MRK16 [19]
fréquemment employés ne donnent pas nécessaire-
ment des résultats concordants et des réactions croi-
sées avec la myosine et les produits de MDR1 ont
été décrites [49]. Les tests fonctionnels de chimio-
résistance, qui mettent en évidence le mécanisme et
la modulation de la résistance pour des tumeurs
individuelles, nécessitent l’isolement de tumeur
viable et une quantification de l’efflux des substrats
marqués et de la survie cellulaire. En dépit de ces
d i fficultés, une relation directe entre l’expression
de MDR 1 et la chimio-sensibilité a été montrée
pour les leucémies, les lymphomes, les myélomes
et avec quelques restrictions pour les cancers mam-
maires, les cancers pulmonaires à petites cellules, le
carcinome ovarien [21], œsophagien [39], les sar-
comes de l’enfant [7] et les neuroblastomes [8].
2. Détection de P-gp dans les tissus humains
normaux
L’expression de P-gp dans les tissus normaux a été
étudiée en utilisant des anticorps monoclonaux diri-
gés contre différents épitopes de P-gp sur des tissus
congelés, car la fixation et l’inclusion en paraffine
conduisent à une perte d’antigénicité [10, 47, 51].
P-gp est exprimée dans un grand nombre de cel-
lules d’epitheliums glandulaires, en particulier
intestinales, tubulaires proximales rénales, surréna-
liennes, sudoripares, bronchiques, épithéliales pros-
tatiques, mammaires, endométriales, thyroïdiennes,
et dans des cellules endothéliales, en particulier au
niveau de la barrière hémato-encéphalique [46]. La
localisation de P-gp au niveau apical des cellules
secrétoires bordant la lumière suggère une fonction
sécrétoire de P-gp dans les tissus normaux, bien
que les substrats n’en aient pas encore été identi-
fiés. Des peptides naturels hydrophobes, des com-
posants environnementaux xénobiotiques, des com-
posants biliaires ont été évoqués. L’ a u g m e n t a t i o n
de l’expression de P-gp en réponse à une hépatecto-
mie partielle, un choc thermique, l’exposition à un
carcinogène ou aux métaux lourds concorde avec
un rôle de détoxification. Le P-gp codé par MDR 2,
qui n’intervient pas dans dans la résistance multi-
drogues est localisé aux membranes canaliculaires
des hépatocytes et pourrait être impliqué dans
l ’ e fflux d’anions organiques [4]. L’ i n t e r f é r e n c e
possible avec des mécanismes physiologiques des
tissus normaux doit être envisagée avant toute thé-
rapeutique anti-MDR, en particulier lors de
l’emploi d’anticorps anti P-pg [33], bien que cette
interférence n’ait pas encore joué de rôle dans la
détermination des doses toxiques à ce jour.
3. Détection de P-gp dans les tumeurs humaines
L’ARN messager de MDR 1 est surexprimé dans les
tumeurs dérivant de tissus exprimant normalement P-
gp, tel que le rein, le foie, le colon et la corticosurré-
nale, comme l’ont montré plusieurs études sur des tis-
sus de provenance clinique. Comme il est dit plus
haut, d’autres tumeurs sont P-gp positives: cancers
hématologiques [5, 12, 27, 36, 41], cancer du sein
[38,53], cancer œsophagien [39], ovarien [21], cancer
pulmonaire à petites cellules [21], sarcomes [7] et
neuroblastomes [8]. Les tumeurs épithéliales épider-
moïdes et certaines tumeurs neurectodermales (méla-
nomes, pheochromocytomes, sarcomes d’Ewing)
n’expriment pas P-gp de façon détectable [49]. Des
cellules exprimant P-gp peuvent être détectées dans
des tumeurs issues de tissus n’exprimant pas P-pg à
l’état physiologique telles que tumeurs urothéliales
vésicales, germinales ou certains sarcomes.
L’expression de P-gp varie entre échantillons de
tumeurs du même type et au sein d’une même
tumeur. L’expression de P-gp par le tissu endothé-
lial ou stromal ne peut pas être distinguée de celle
du tissu tumoral dans des extraits tumoraux totaux.
D’un autre coté, des petites sous-populations expri-
mant P-gp peuvent ne pas être détectées si elles
sont "diluées" dans une grande quantité de tissus P-
gp négatif. Plusieurs échantillons de tumeur résis-
tant à la doxorubicine et négatifs pour la recherche
386

de l’ARN messager MDR 1 se sont révélés positifs
en immuno-histochimie [24]. La détection de
petites sous-populations P-gp positives est essen-
tielle, dans la mesure ou la PCR a montré que des
expressions de P-gp proches du seuil de détection
des autres méthodes pouvait augmenter considéra-
blement la chimio-résistance [21]. Malgré ces dif-
ficultés, l’expression de P-gp est un indicateur de
mauvais pronostic, témoin de mécanismes médiés
par MDR 1 ou associés et indépendants. La liste
de tumeurs exprimant MDR 1 s’accroit, mais à
l’exception des cancers hématologiques, la contri-
bution de la MDR à la chimio-résistance de
tumeurs particulières reste à établir [41].
4. Chimio-sensibilisateurs
La capacité de certaines drogues à interagir avec
P-gp et à inhiber la résistance en inhibant l’efflux
des agents de chimiothérapie a été testée in vitro .
Un grand nombre de substances modifient la chi-
miorésistance, et cet effet est commun à de nom-
breuses substances lipophiles, qui s’insèrent dans
la membrane et bloquent la fonction de P-gp
[14,20]. Trois familles ont réussi à bloquer la chi-
miorésistance dépendant de MDR chez des
patients et sont en cours d’essais cliniques: les blo-
queurs des canaux calciques, tels que le Verapamil
[47] et, moins toxique, le R-Verapamil, la cyclo-
sporine et ses dérivés [15] tels que le PSC-833,
non immuno-suppresseur, et le tamoxifène, anti-
œstrogène qui agit indépendamment du statut hor-
monal de la cellule cible [37]. Le mécanisme n’est
pas clair; il s’agit probablement d’une association
de compétition inhibitrice avec P-gp [57], d’altéra-
tions dans la fluidité membranaire, d’effets indi-
rects de la baisse du calcium intra-cellulaire via la
calmoduline ou la protéïne kinase C. De forts taux
de rémission ont été rapportés chez des patients
ayant des tumeurs résistantes et recevant du vera-
pamil ou de la cyclosporine en plus de la chimio-
thérapie standard pour traitre des lymphomes, des
leucémies ou des myélomes [49]. Les essais cli-
niques de phase I du premier agent chimio-sensibi-
lisateur développé spécifiquement, le dérivé non-
immunosuppresseur de la cyclosporine PSC-833
ont débuté récemment [49]. D’une manière géné-
rale, le résultat clinique a été bien en dessous des
attentes, en raison du fait que la diminution de la
dose de cytotoxique nécessaire pour tuer les cel-
lules résistantes a été moins nette qu’in vitro, en
raison de la toxicité propre des chimio-sensibili-
sants et enfin du fait que la résistance due au MDR
n’est qu’une composante de la résistance et pas
nécessairement la plus importante. L’ a d j o n c t i o n
d’inhibiteurs d’autres mécanismes de détoxifica-
tion tels que la bulthionine sulfoximine (BSO)
pour la production de glutathion ou d’autres peu-
vent contribuer à une sensibilisation optimale [52].
Le développement de meilleurs sensibilisateurs et
de leurs combinaisons est en progrès et devrait
ouvrir la voie à d’importantes améliorations cli-
niques à l’avenir.
5. Relation entre expression de la P-gp et les
autres mécanismes de résistance.
P-gp n’est pas exprimé par nombre de tumeurs chi-
mio-résistantes, tels que mélanomes, cancers du
rein, cancer du poumon et cancers épidermoïdes,
ce qui implique d’autres mécanismes de chimio-
résistance. De plus, l’expression de P-gp
n’indique pas nécessairement que MDR soit le
mécanisme principal de résistance dans la tumeur
considérée, mais pourrait être le témoin de l’induc-
tion d’autres mécanismes d’inactivation des agents
chimiothérapiques, de protection des cellules
cibles ou autre forme d’aggressivité tumorale [55].
L’augmentaion des niveaux de glutathione-S-trans-
férase isoenzyme, qui détoxifie les xénobiotiques
par glutathio-conjugaison, ou une baisse des
niveaux de topo-isomérase II, impliquée dans la
réplication de l’ADN et est une cible des anthracy-
clines, sont deux mécanismes importants de chi-
miorésistance parmi d’autres influant sur la capta-
tion des drogues, leur métabolisme, la modifica-
tion des cibles et la réparation de l’ADN [28, 52].
La coexpression de ces mécanismes a été rappor-
tée dans les leucémies [16], les cancers du poumon
[17], les cancers du rein [31, 54], et les cancers de
vessie [23] entre-autres. Des sondes géniques, des
anticorps et des tests fonctionnels sont disponibles
pour détecter leurs effecteurs [16]. En conséquen-
ce, les sensibilisateurs dirigés sur le MDR
devraient être testés pour une tumeur donnée et
utilisés seuls seulement en cas de sensibilisation à
un anti-cancéreux donné.
S I G N I F I C ATION DE P-GP DANS CER-
TAINES TUMEURS GENITO-URINAIRES
Le traitement des tumeurs uro-génitales repose sur
la chirurgie, l’irradiation, l’hormonothérapie, la
387

chimiothérapie et l’emploi des modificateurs du
comportement biologique [11]. Beaucoup de can-
cers urogénitaux siont très chimio-résistants, en
particulier les cancers rénaux, et les intensifications
avec administration de facteurs hématopoïétiques,
l’emploi de nouvelles drogues et d’inhibiteurs
sélectifs des mécanismes de résistance cellulaire
ont été proposés. L’existence d’une résistance liée
au MDR est discutée ci-dessous.
1. Cancer rénal
L’adénocarcinome rénal représente 85% de tous les
cancers du parenchyme rénal et représente 2 à 3 %
des cancers de l’adulte. Les métastases, principale-
ment lymphatiques, pulmonaires et osseuses sont
présentes au moment du diagnostic chez environ 30
% des patients et il n’y a pas de marqueurs spéci-
fiques de cette maladie. La néphrectomie radicale
de tumeurs confinées au rein donnent 50 à 70 % de
survie à 5 ans, mais le pronostic des tumeurs éten-
dues est mauvauis, principalement du fait de
l’absence de chimiothérapie active. A ce jour,
aucune drogue seule ou en polychimiothérapie n’a
permis d’obtenir un taux de réponse supérieur à 10-
16%. La vinblastine est l’agent le plus eff i c a c e ,
mais la réponse est le plus souvent partielle et de
courte durée. L’immunothérapie, basée sur l’inter-
leukine 2, les interférons ou les “lymphokine acti-
vated killer” cells sont en cours d’étude, avec un
taux de réponse de 20 à 25% [9]. Le cancer rénal
disséminé exprime un haut niveau de chimiorésis-
tance primaire à une variété de cytotoxiques natu-
rels, incluant ceux caractéristiques de la MDR. En
accord avec ceci, P-gp est fortement exprimée dans
les tubules proximaux du rein [45], localisée aux
microvillosités des cellules épithéliales comme l’a
montré la microscopie électronique [34]. Les
lignées cellulaires dérivées de cancer rénaux expri-
ment de hauts niveaux d’ARN messagers de MDR
1, un grande résistance MDR dépendante et une
haute résistance non MDR dépendante [22, 34]. Le
cancer rénal humain surexprime MDR 1 dans une
grande majorité de cas [29]. Le Verapamil augmen-
te la chimiosensibilité à la vinblastine in vitro dans
la majorité des cancers chimio-résistants [32] et
des dérivés moins toxiques du Vérapamil, combi-
nés avec la vinblastine ont été efficaces sur un
groupe de cancers du rein [30]. Des essais de phase
I du R-vérapamil ont débuté, mais le degré de sen-
sibilisation du cancer rénal par le vérapamil reste à
évaluer. D’autres mécanismes de résistance que le
MDR sont à l’évidence présents, dans la mesure où
des drogues comme le cis-platine; l’hydroxyurée et
les alkylants sont inefficaces dans le traitement du
cancer rénal. Une étude récente a montré qu’un
seul marqueur de chimiorésistance n’était présent
que dans 10% des cas, et que le MDR était associé
à une augmentation d’expression de la glutathione-
S-transférase et/ou une diminution d’expression de
la topoisomérase II dans les autres cas [31).
2. Cancer de vessie
Le cancer urothélial de vessie est le plus souvent
une tumeur superficielle accessible à un traitement
local par résection endoscopique. Les facteurs
d’échec thérapeutique des tumeurs superficielles
récidivantes sont un stade et un grade avancé, la
multiplicité des tumeurs, un grand volume tumoral
et l’aneuploïdie. Pour les cancers infiltrants ou
métastatiques, la chimiothérapie néo-adjuvante
locale ou générale a permis d’obtenir des taux de
réponse de 50 à 70%, complète dans 30 à 50% des
patients pendant une période d’observation de trois
ans [43]. La plupart des protocoles combinent
méthotrexate et cisplatine dans une tri-chimiothéra-
pie (avec vinblastine - CMV) ou quadri-chimiothé-
rapie (avec doxorubicine - MVAC) Les taux de
réponse de la monochimiothérapie sont de 20 à 30
%. Le MVAC est supérieur au CMV, démontrant
l’efficacité de la doxorubicine dans ces tumeurs. La
résistance médiée par MDR 1, si elle est présente,
est censée réduire la réponse à la vinblastine et à la
doxorubicine et donc rendre les quadri-thérapies
moins efficaces [44].
De ce fait, l’expression de P-gp a été étudiée en
tant que possible paramètre de réponse à la chimio-
thérapie intra-vésicale ou générale. Une lignée cel-
lulaire résistante à la doxuribicine avec une résis-
tance multi-drogue classique et une surexpression
de MDR 1 a été développée à partir de la lignée
MGH-U1 [13]. Cette lignée, MGH-U1R , doxoru-
bicino-résistante montre une résistance moindre en
présence de vérapamil in vitro [25]. Par contre, les
études de la lignée UM-UC-6Dox expriment une
résistance atypique, non réversible par le vérapamil
et non liée à un efflux de drogues [50].
P-gp n’est en général pas exprimée par l’urothé-
lium normal ni par les cancers urothéliaux. Elle a
été détectée à des niveaux bas ou moyens dans seu-
388

lement 30% des patients au moment du diagnostic
et son niveau a été augmenté par la chimiothérapie
dans plusieurs cas [3]. Ces constatations ont été
confirmées par plusieurs études, rapportant une
expression faible avant traitement et une augmenta-
tion après M-VAC [34,44]. L’expression de MDR1
est donc bien documentée dans une sous-population
de patients, qui pourraient bénéficier de chimio-
sensibilisateurs. Dans des études expérimentales, la
s u r-expression in vitro de MDR 1 était associée
avec une résistance à la cytotoxicité “natural-killer-
like”, ce qui pourrait être important pour des
patients recevant du BCG [54]. Les cancers superfi-
ciels offrent des avantages uniques pour les essais
de chimiosensibilisation dans la mesure où l’agent
sensibilisant peut être confiné à la vessie. Le véra-
pamil administré en intra-vésical chez l’animah
était resté confiné à la muqueuse vésicale et était
absent du sang, démontrant la sécurité offerte par
l’administration intra-vésicale [25]. A l’opposé des
la thérapie systémique, cette voie d’administration
n’est pas limitée par les effets cardio-vasculaires
des inhibiteurs des canaux calciques et devrait per-
mettre d’utiliser de fortes doses, actives sur la
modification de la chimiosensibilité; ceci est appli-
quable aux autres formes de résistances.
Bien que les cytotoxiques cités plus haut soient des
constituants de polychimiothérapies appliquées au
cancer vésical, les drogues les plus actives semblent
être le méthotrexate et le cisplatine(MVA C = m é t h o-
trexate, vinblastine, adriamycine, cisplatine), qui
sont limitées dans leur action par des mécanismes
non MDR dépendants [44]. La résistance au cis pla-
tine est peut être le résultat de la sur-expression des
metallothioneïnes, en particulier la glutathione ,
diminution de la captation cellulaire ou augmenta-
tion de la réparation de l’ADN. Des essais cliniques
avec la buthionine sulfoximide, inhibiteur de la glu-
tathione-S-transférase et l’hydroxyurée et la cytosine
arabinoside afin d’empêcher la réparation de l’ARN
sont en cours.
3. Cancer prostatique
Le pronostic du cancer prostatique est bon tant que
le cancer est confiné à la glande et peut être enlevé
par prostatectomie radicale, mais il est mauvais
quand la tumeur est disséminée et le traitement
repose alors sur la déprivation androgénique chi-
rurgicale ou médicale [6]. Un fort pourcentage de
patients échappent à l’hormonothérapie de premiè-
re intention, et rechutent après 12 à 18 mois en
moyenne [26]. Les résultats de deux décades de
mono et de poly-chimiothérapie sont décevants et
n’ont pas montré d’amélioration de la survie. La
doxorubicine et mitomycine C sont les drogues les
plus efficaces, cependant la survie n’excèdait pas
28 semaines. De nouveaux produits comme la sur-
amine , et des agents interférant avec les boucles
de stimulation autocrine sont à l’étude. Le faible
taux de réponse des carcinomes prostatiques à dif-
férents types de chimiothérapies s’explique par le
faible nombre de cellules en division et par l’exis-
tence de mécanismes de résistance intrinsèque.
L’ARN messager de MDR 1 a été retrouvé dans
une métastase cérébrale de cancer prostatique [35].
Il n’y pas de rapport sur le rôle du MDR dans le
cancer prostatique, et nous présentons ici nos
résultats préliminaires in vitro. La sensibilité à la
doxorubicine de la lignée hormonosensible LNCaP
et des lignées hormono-indépendantes PC3 et DU-
145, issues de métastases de cancer prostatique, a
été étudiée en culture. La lignée LNCaP était sen-
sible à la doxorubicine,alors que les deux autres
lignées nécessitaient des doses léthales DL 50 de 5
à 10 ug/ml, ce qui est impossible à obtenir chez des
patients (maximum: environ 1ng/ml). La présence
de P-gp a été détectée à l’aide de l’anticorps mono-
clonal C219 dans les lignées PC 3 et DU 145, et
l ’ e fflux de drogue sensible au vérapamil a été
démontré (G.Theyer et al. soumis pour publica-
tion). Néanmoins, les chimio-sensibilisateurs véra-
pamil, cyclosporine A et tamoxifène n’ont fait
diminuer la DL 50 que dans de faibles proportions
(facteur 2 à 2,5]. Il est évident que dans ces études
in vitro sur des cultures, les concentrations de
doxorubicine nécessaires à la mort d’un grand
nombre de cellules excédait largement les taux
plasmatiques cliniques et que la réversion de résis-
tance obtenue était insuffisante. Les mécanismes
non-MDR dépendants sont probablement prépon-
dérants dans la chimio-résistance des cancers pros-
tatiques.
CONCLUSION
La résistance multi-drogues (MDR) par le glyco-
protéïne P diminue la sensibilité des cellules tumo-
rales aux anthracyclines, à la mitomycineC, aux
alcaloïdes de la Vinca et autres petite drogues
hydrophobes par augmentation de l’efflux nécessi-
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