LA RECHERCHE N°309 Mai 1998

LA RECHERCHE N°309 Mai 1998
PATRICE COURVALIN est responsable du Centre national de référence sur les mécanismes de
résistance aux antibiotiques et dirige l'Unité des agents antibactériens de l'Institut Pasteur.
PLANTES TRANSGENIQUES ET ANTIBIOTIQUES
Alors même que les bactéries développent une résistance de plus en plus efficace à tous les antibiotiques,
l'introduction à grande échelle de plantes transgéniques risque-t-elle de leur faciliter la tâche. Nombre de ces
OGM comportent en effet, intégré à leur génome, un gène de résistance aux antibiotiques, qui sert de marqueur.
Ce risque a été bien légèrement évacué par les experts. Il est d'autant plus sérieux que, parallèlement, on favorise
la résistance des bactéries pathogènes en utilisant largement les antibiotiques dans l'alimentation des animaux
d'élevage. Avant de répandre des OGM dans l'environnement, il serait opportun d'effectuer des « constructions
génétiques » qui n'utilisent pas ces gènes de résistance.
Les OGM risquent-ils d'aggraver le problème crucial de la résistance bactérienne?
La construction et la production à grande échelle de plantes génétiquement modifiées génèrent beaucoup d'espoir
mais suscitent également de nombreuses interrogations. L'une des plus sérieuses porte sur ce que l'on nomme la
résistance et recouvre deux questions distinctes. D'une part, la résistance au produit du gène transféré dans la
plante : cette question relève de compétences autres que la mienne(I). D'autre part, la résistance aux
antibiotiques. Celle-ci pourrait se répandre en raison des gènes bactériens utilisés pour mener l'opération de
transgenèse et qu'on a laissé subsister dans la plante transgénique où ils n'ont plus d'utilité. On ne peut exclure
que ces gènes de résistance aux antibiotiques puissent migrer de la plante transgénique aux bactéries. Cet
éventuel « retour à l'envoyeur » risque-t-il fortement d'accroître le phénomène de résistance aux antibiotiques
chez les bactéries pathogènes pour l'homme?
La transgenèse consiste à introduire dans le génome d'un organisme vivant un gène étranger, appelé transgène,
dont on suppose qu'il va conférer un avantage écologique, nutritionnel ou autre à son nouvel hôte, appelé OGM
(organisme génétiquement modifié). L'isolement et la purification du transgène d'intérêt s'effectuent au
laboratoire par clonage chez une bactérie, généralement Escherichia coli . Le clonage exige l'emploi de «
vecteurs », qui vont permettre d'introduire le gène dans la plante (voir l'encadré « La technique de la transgenèse
»). Les vecteurs de clonage bactérien comportent des caractères de résistance aux antibiotiques pour faciliter la
sélection des constructions génétiques. Dans certains OGM, ces gènes bactériens sont transférés avec le
transgène, bien qu'ils ne soient d'aucune utilité dans la plante elle-même. Il s'agit donc de résidus d'une des
étapes de la construction génétique. Selon le type de construction effectuée, ces gènes sont exprimés ou non. Ils
s'expriment par exemple dans la tomate mise au point par Calgène, mais le plus souvent, comme dans le maïs de
Novartis, ils ne sont pas exprimés.
Pour survivre en présence d'antibiotiques, les bactéries ont développé divers mécanismes de résistance(1). Un
des plus efficaces et des plus répandus est la synthèse d'enzymes qui inactivent les antibiotiques. La production
de ces enzymes est généralement due à l'acquisition de gènes provenant d'autres bactéries, par transfert «
horizontal » (c'est-à-dire d'une bactérie à une autre bactérie appartenant à une espèce ou à un genre différent, par
opposition au transfert « vertical » d'une génération à la suivante). L'incidence élevée de la résistance aux
antibiotiques chez les bactéries pathogènes est principalement due au fait qu'elles ont développé des systèmes de
transfert d'ADN extrêmement efficaces et à très large spectre d'hôte. Le transfert s'opère par différents
moyens(2): la conjugaison, qui implique un contact physique direct entre bactérie donatrice et bactérie
réceptrice, et par laquelle le plasmide passe de l'une à l'autre ; la transformation, par laquelle une bactérie dite "
compétente " incorpore de l'ADN nu présent dans l'environnement ; et la transduction, au cours de laquelle
l'ADN est véhiculé par un bactériophage..
Ce sont précisément certains de ces gènes de résistance qui sont utilisés lors de la construction de plantes
transgéniques. Les deux critères qui ont présidé au choix, parmi les très nombreux gènes de résistance aux
antibiotiques sont soit leur incidence élevée dans la nature, soit le fait qu'ils confèrent la résistance à des
antibiotiques qui ne sont plus utilisés en clinique humaine. Comme nous allons le montrer, ces choix,
particulièrement malheureux, dénotent une ignorance de l'écologie de la résistance aux antibiotiques(3) et
attestent de connaissances superficielles sur les mécanismes de résistance et de leur évolution(4).

L'introduction de la pénicilline G en clinique au milieu des années 1940 a été très rapidement suivie par
l'émergence de souches pathogènes résistant à cet antibiotique. Les souches résistaient par production d'une
enzyme, la pénicillinase, qui hydrolysait* l'antibiotique. Deux pistes ont été suivies par les chimistes de
l'industrie pharmaceutique pour contourner ce mécanisme. Tout d'abord, la synthèse de molécules dérivées de la
pénicilline G et réfractaires à l'action de l'enzyme. Ensuite, la synthèse d'inhibiteurs de l'enzyme qui restaurent la
sensibilité aux pénicillines des souches productrices de pénicillinase et sont donc utilisés en association avec ces
antibiotiques.
Le gène nommé blatem-1 très utilisé dans la modification génétique des plantes comme le maïs de Novartis
récemment autorisé, et en biologie moléculaire en général. Il commande la production d'une pénicillinase
capable de dégrader très efficacement les pénicillines (pénicilline G, ampicilline, amoxycilline, etc.). Il confère
donc la résistance à l'une des classes d'antibiotiques les plus utilisées en thérapeutique humaine. On sait que des
altérations de ce gène peuvent élargir considérablement le spectre de résistance que confère l'enzyme dont il
dirige la synthèse, et allonger ainsi la liste des antibiotiques rendus inefficaces. En effet, des mutations
ponctuelles (c'est-à-dire le changement d'une paire de bases) en de nombreux sites de ce gène peuvent conférer à
l'enzyme la propriété soit d'inactiver les céphalosporines* les plus récentes(5), soit d'être réfractaire à l'action des
inhibiteurs de pénicillinases(6). Ainsi, le plus simple événement génétique que l'on puisse concevoir dans ce
gène, et dont la survenue est inéluctable à une fréquence relativement élevée*, est capable de ruiner des dizaines
d'années d'effort de l'industrie pharmaceutique et de conférer une résistance efficace à des antibiotiques
particulièrement utilisés en clinique, notamment lors d'infections graves, et de loin les plus prescrits dans le
monde.
Le gène blatem-1 est répandu chez les entérobactéries* responsables notamment d'infections acquises à l'hôpital,
dites nosocomiales. Il est également présent chez environ la moitié des Escherichia coli , bactéries commensales
du tube digestif qui, dans certaines conditions, peuvent provoquer des infections. Il est en revanche inexact de
prétendre, que ce gène est présent chez « 50 % des bactéries pathogènes du tube digestif »(3) . Sa prévalence
chez les bactéries pathogènes responsables de diarrhée (salmonelles, shigelles, Escherichia coli producteurs de
certains facteurs de virulence et Vibrio cholerae ) varie selon les espèces mais ne dépasse guère quelques pour-
cent. De plus, la production de pénicillinases n'a pas encore été détectée en Europe chez l'entérocoque, bactérie
intestinale pathogène pour les sujets immunodéprimés, et que l'on isole de plus en plus fréquemment en
pathologie humaine, alors que de telles souches ont déjà été décrites en Amérique du Nord et du Sud. Le gène
blatem-1 n'est donc ni anodin ni ubiquiste chez les bactéries pathogènes pour l'homme.
D'autres gènes bactériens ont été utilisés pour la modification génétique des plantes. Le gène aph3'-2, également
connu sous la désignation NPTII, est l'un des plus utilisés : on le retrouve par exemple dans la tomate de
Calgène, dans un colza de PGS et un colza de Calgène, etc. Il confère la résistance à certains antibiotiques de la
famille des aminosides, notamment la kanamycine et la néomycine. Du fait de leur toxicité, ces antibiotiques
sont peu utilisés en thérapeutique humaine. Mais à l'instar du gène blatem-1 , une mutation ponctuelle dans ce
gène peut conférer à la bactérie qui l'héberge la résistance à un dérivé de la kanamycine, l'amikacine(7). Cet
aminoside est largement utilisé pour le traitement d'infections nosocomiales et connaît de nouvelles indications
dans le traitement de la tuberculose : on sait que le bacille de Koch résiste de plus en plus aux antibiotiques
habituellement utilisés contre lui.
Le gène aph3'-3 (8) , apparenté au précédent, spécifie quant à lui, d'emblée, la résistance à l'amikacine ; une
résistance d'autant plus embarrassante qu'elle est indécelable par les techniques usuelles d'étude de la sensibilité
in vitro des bactéries aux antibiotiques, utilisées dans les laboratoires de bactériologie.
Un quatrième gène de résistance utilisé dans les constructions d'OGM, aad3''9 , utilisé dans une autre variété de
coton de Monsanto, confère la résistance à la streptomycine et à la spectinomycine. Si ce dernier antibiotique est
utilisé exclusivement, et de moins en moins, dans le traitement de la gonorrhée, la streptomycine connaît un
regain d'intérêt en dépit d'effets secondaires indésirables (toxicité, douleur au point d'injection). Cet aminoside,
en effet, ne présente pas, par opposition aux autres membres de cette famille, de résistance croisée avec la
gentamicine chez les bactéries à Gram positif* (staphylocoques, streptocoques et entérocoques). La résistance à
la gentamicine étant de plus en plus fréquente chez les entérocoques, la streptomycine retrouve donc des
indications, en association avec les pénicillines, dans des infections sévères comme l'endocardite (infection
bactérienne, essentiellement localisée aux valves cardiaques)(9).
Le risque principal de la présence de gènes de résistance dans les plantes modifiées génétiquement est de
contribuer à la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes. Alors que les
transgènes d'intérêt agricole (résistance à la toxine de Bacillus thuringiensis ou aux herbicides par exemple)

pourraient disséminer par voie sexuée à des espèces proches, le transfert de la résistance aux antibiotiques des
plantes vers les bactéries pourrait résulter d'un transfert horizontal d'ADN.
Les connaissances sur le transfert d'information génétique entre organismes très éloignés sur le plan
phylogénétique sont récentes et parcellaires ; notre savoir est en pleine évolution. Si l'existence d'un flux de
gènes des cocci à Gram positif vers les bacilles à Gram négatif(10) et l'existence d'un système de transfert
génétique des bactéries vers les plantes(11) dans les conditions naturelles sont connues depuis maintenant quinze
ans, la démonstration au laboratoire d'un transfert d'ADN des bacilles à Gram négatif aux cocci à Gram
positif(10), des bactéries aux champignons(12) ou aux cellules de mammifères, y compris humaines(13), est
beaucoup plus récente.
Il est désormais avéré que les transferts d'ADN peuvent concerner les règnes les plus éloignés. Le transfert
inverse, qui nous préoccupe aujourd'hui, des eucaryotes aux procaryotes, est donc tout à fait concevable et a été
proposé dans quelques cas, notamment, de façon très convaincante, pour le gène Pgi , codant une enzyme,
l'isomérase du glucose phosphate(14), et pour les gènes des domaines de type III des protéines fibronectines(15).
Le transfert direct d'ADN des plantes aux bactéries, qui n'a pas fait l'objet d'études extensives, n'a pas été
reproduit. Ce résultat négatif n'autorise pas à considérer que la question de son éventuelle survenue « n'a pas lieu
d'être posée »(16) . Il faut conserver constamment présent à l'esprit que les opportunités d'échange de matériel
génétique entre organismes vivants dans la nature sont immenses et que la reconstitution de ces conditions au
laboratoire, et même sur le terrain, peut être plus difficile, voire impossible actuellement. Ceci souligne la faible
prédictibilité des expériences conduites au laboratoire.
Du fait des étapes requises, chacune ayant une probabilité de survenue faible, et de l'existence de la barrière
d'espèce, la possibilité d'un transfert de gènes des plantes aux bactéries, s'il existe, est, au moins en théorie,
probablement rare ; sauf si, comme nous allons le voir, on s'ingénie à multiplier les constructions et les
circonstances qui le favorisent. Enfin, il est inéluctable, contrairement à ce qui a été prétendu(3), que la culture
intensive d'une plante hébergeant un gène de résistance, aboutissant à l'augmentation du nombre de copies de ce
gène dans la nature, favorise son évolution et sa dissémination.
La dissémination horizontale d'information génétique implique trois étapes : le transfert de l'ADN, sa
stabilisation chez le nouvel hôte (requise pour assurer sa transmission à la descendance) et son expression.
Le retour d'un gène de résistance aux antibiotiques d'une plante génétiquement modifiée vers des bactéries
pourrait se produire dans deux types de circonstances. La première serait un transfert dans le tube digestif des
animaux ou de l'homme aux bactéries commensales du tube digestif. La stabilité thermique de l'ADN est telle
que, dans un certain nombre de cas, les gènes de résistance ne seront pas dénaturés par la préparation que
subissent les ali-ments avant ingestion. Dans l'écosystème intestinal, des bactéries appartenant à une multitude
d'espèces, la plupart encore non décrites, sont présentes en nombre extrêmement élevé et dans des états
physiologiques variés. Un certain nombre d'entre elles peut être en état de compétence, c'est-à-dire apte à
incorporer l'ADN de la plante libéré au cours de la digestion - notamment le fragment porteur du gène de
résistance blatem-1 qui, compte tenu de sa petite taille (858 paires de bases), risque fort d'être resté intact. De
plus, les bactéries étant en contact très intime les unes avec les autres, le tube digestif représente un écosystème
extrêmement favorable aux échanges génétiques entre bactéries appartenant à des genres différents(17). Dans ces
conditions, le gène de résistance pourrait être récupéré par transformation par une bactérie naturellement
compétente, transmis verticalement à sa descendance lors des divisions cellulaires mais également
horizontalement à d'autres micro-organismes. L'étude de l'évolution de la résistance bactérienne aux
antibiotiques au cours des vingt dernières années nous a enseigné qu'étant donné la taille gigantesque des
populations concernées un événement, même extrêmement rare, peut survenir pour peu que les condi-tions de
sélection adéquates soient présentes(18).
De ce point de vue, l'utilisation massive des antibiotiques comme promoteurs de croissance dans l'alimentation
animale crée les conditions les plus favorables à la sélection du transfert puis à la dissémination de la résistance.
Des travaux récents à propos de l'utilisation d'antibiotiques comme suppléments dans l'alimentation animale ont
démontré la possibilité de colonisation du tube digestif de l'homme par les bactéries d'origine animale et la
possibilité de transfert de gènes de résistance aux antibiotiques de ces micro-organismes aux bactéries
commensales de l'homme. Comme le maïs transgénique est principalement destiné à l'alimentation animale, la
conjonction de l'utilisation des antibiotiques dans l'alimentation animale et des OGM ne peut qu'accroître le
risque de dissémination.

La deuxième circonstance possible de retour des gènes est le passage aux bactéries du sol d'ADN de plantes
transgéniques en décomposition, et notamment de leurs racines. Cette éventualité est favorisée par le fait que
l'ADN, contrairement aux idées reçues et véhiculées encore récemment(4), est une molécule extrêmement stable
dans les sols et que certaines espèces bactériennes telluriques peuvent spontanément et efficacement incorporer
de l'ADN(19). Or, ces micro-organismes, tels les Acinetobacter , font partie des bactéries responsables
d'infections chez les malades immunodéprimés qui représentent une fraction croissante de la société (patients
atteints du sida, présentant une leucémie ou un cancer sous chimiothérapie, ayant subi une transplantation ou
hospitalisés en service de réanimation, personnes âgées).
Outre le retour du gène, il faut, pour sa transmission à la descendance et son expression continue, que l'ADN
entrant se stabilise dans la nouvelle cellule hôte. Cette stabilisation s'effectue par recombinaison homologue
entre les séquences flanquant le gène de résistance et l'ADN de la bactérie réceptrice ; le procédé est d'autant
plus efficace que les zones d'homologie interagissant sont étendues. Or, de nombreuses plantes transgéniques, y
compris celles récemment autorisées à la culture en France, résultent de l'acquisition, par électrotransformation
(application d'un champ électrique) ou par biolistique (bombardement des cellules avec des microbilles
recouvertes du transgène), non seulement du gène de résistance aux antibiotiques mais également de larges
régions flanquantes d'ADN bactérien, voire de la quasi-totalité du plasmide de départ. Il s'agit donc de
constructions non seulement " inesthétiques(3) ", mais " génétiquement incorrectes " car résultant d'approches
très grossières. Lors de sa stabilisation, le gène peut s'intégrer soit dans le chromosome - il fait alors partie du
génome de la bactérie et est transmis de façon stable à sa progénie -, soit, et de façon plus préoccupante, dans un
élément génétique mobile(2), tel un plasmide ou un transposon : il sera alors transmis non seulement
verticalement mais également horizontalement, de bactérie à bactérie, par conjugaison, mobilisation ou
transformation.
La troisième et dernière étape nécessaire au transfert consiste en l'expression du gène de résistance chez la
bactérie hôte. Pour les gènes de résistance à l'ampicilline, à la streptomycine et à la spectinomycine, restés dans
les constructions sous contrôle d'un promoteur* bactérien, l'expression sera totale et immédiate chez les bactéries
à Gram négatif. En ce qui concerne le gène de résistance à la kanamycine, la situation est plus complexe dans la
mesure où son expression est liée à son intégration en aval d'un promoteur bactérien. Ceci est dû au fait que les
constructions génétiques ont placé ce gène sous contrôle d'un promoteur eucaryote qui est a priori non
fonctionnel chez les bactéries. La probabilité d'expression du gène de résistance à la kanamycine y est donc
beaucoup plus faible que celle des autres gènes de résistance.
Quand bien même l'efficacité de transfert horizontal de gènes des plantes aux bactéries est, très
vraisemblablement, sans commune mesure avec celle des systèmes d'échanges génétiques développés par les
bactéries, il reste à s'interroger.
Est-il opportun de laisser subsister dans les plantes transgéniques des gènes qui leur sont inutiles et qui confèrent
la résistance à des familles majeures d'antibiotiques ou à des antibiotiques qui connaissent un regain d'indications
? De laisser des gènes qui font partie de constructions génétiques bâclées qui accumulent les structures
favorables à un retour éventuel vers les bactéries ? Et ce, alors même que l'on dispose de techniques autorisant
des constructions « génétiquement correctes » , parfaitement définies et faisant l'économie de ces gènes de
résistance.
Est-il opportun de ne pas appliquer le principe de précaution en autori- sant la dissémination de constructions «
de première génération » , peut-être utiles à l'avancement des techniques de transgenèse, mais impropres à
l'utilisation sur le terrain ? Et ce alors même que le « système de biovigilance » sera dans l'impossibilité d'évaluer
l'impact de ces constructions sur la dissémination de la résistance aux antibiotiques, l'origine d'un gène non «
marqué » étant totalement intraçable dans les conditions naturelles(II) ?
Est-il opportun de créer un précédent susceptible d'inciter les producteurs de semences à négliger les précautions
les plus élémentaires ?
Tout ceci est-il opportun, alors que depuis plus de vingt ans aucune nouvelle famille d'antibiotiques n'a été
introduite en clinique ?
BACTÉRIOLOGIE