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CONSTRUCTION D’UN ORGANISME, MISE EN PLACE D’UN PLAN D’ORGANISATION (32 HEURES) Mise en place du plan d’organisation chez les Vertébrés Acquisition du plan d’organisation de la grenouille et quelques modalités du développement des animaux (17 heures) INTRO - Présentation du contexte dans la progression pédagogique : dev des organismes - Présentation des consignes du programme Il s’agit de présenter les grandes étapes qui marquent le développement d’un organisme animal. - On insiste dans un premier temps sur les principales acquisitions - morphologiques, - anatomiques et - histologiques qui caractérisent les développements embryonnaires et post-embryonnaires. - Les mécanismes cellulaires, - moléculaires - voire génétiques de certaines de ces étapes sont ensuite étudiés. L’étude des différentes étapes du développement embryonnaire est l’occasion de présenter : - l’acquisition du caractère pluricellulaire, - les manifestations de la symétrisation et - des polarités, - la mise en place des feuillets - induction et structuration du mésoblaste, aboutissant au - plan d’organisation commun aux Vertébrés (stade bourgeon caudal). - régionalisation des somites, La régionalisation des somites est l’occasion de présenter l’expression des gènes homéotiques. - différenciation de la cellule musculaire squelettique, - croissance d’un os long de Mammifère, - Modèles de laboratoire : nématode, drosophile, amphibien (xenopus), poulet, souris - cas particulier des amphibiens : 1930 greffe de territoires embryonnaires et inductions primaires sur Tritus (n=12K) - Remplacement progressif par urodèles plus résistants à la captivité (Pleurodeles, Ambystoma) : compétence et détermination et régénération des tissus - 1952 sur anoures : premieres transplantations de noyau (R. Briggs et T. Kings) - 1962 Gurdon sur Xenopus (n=18K) : résistant, gd nbr d'embryons de même stade en m^me temps, marqueurs génétiques, 1996 technique des embryons transgéniques ds lesquels on introduit et fait exprimer un gène - ICI : on traite indifféremment de la grenouille (amphibien anoure) que de xenopus (idem) ou triton et ambystomes(urodèle) - Méthodes : - début XXeme : expérimentation (micorgreffes, ablation etc.) et mee des inductions, - microscope optique, électronqiue, et analyse cellulaire - 1970 bon en avant de la génétique du dev : criblage massif de drosophiles Dernière modification : 18/04/17 1 - biologie moléculaire independantes en 1970 : introduire de nouveaux gènes dans l'embryon ou une lignée de cellules, activer un gène spécifique, supprimer le produit d'expression d'un gène (par hybridation) à tout moment du dev, identifier une séquence d'ADN (génomique fonctionnelle de la seq d'ADN à la molécule), combiné à - biochimie : on sait repérer et analyser la fontion d'une seule molécule exprimée par un groupe de cellules : approche moléculaire du dev - Les principaux processus de dev ubiquite (du nématode à l'Homme) reposent sur qq gd types d'activité cellulaire : - prolifération - communication, - information de position - changement de forme - déplacements - différentiation - apoptose - coordination précise dans l'espace et le temps par gènes de contrôle PLAN : on divise pratiquement en 5 étapes majeures avec émergence à chaque stade d'une activité cellulaire nouvelle qui ne peut avoir que si les étapes précedentes se sont correctement déroulées - Fécondation : structure de l'oeuf, pole D/V, modifiée et acquisation d'un plan de symétrie - Segmentation : structure pluricellulaire - Gastrulation et Neurulation : 3 feuillets + allongement A/P et aplatissement D/V + ébauche syst nerveux dorsal - Organogenèse : à partir d'un plan d'orga primaire commun à tous les VERTEBRES, différentiation des tissus et organes coordonnées pour un fonctionnement autonome I. La fécondation de la cellule oeuf polarisée : acquisition d'un plan de symétrie 1- Les réserves de l'ovocyte II en font une cellule polarisée et autonome a) Une cellule oeuf protégée par 2 enveloppes - enveloppe vitelline : - structure : feutrage transparent de 4 à 7 nm - nature : glycoprotéines (?) ponctuée de pores - origine : élaborée par cellules folliculaires de l'ovaire - gangue : - structure gangue s.s externe + coque interne - nature : dépôts concentriques de protéines - origine : déposé par cellules de l'oviducte lors de l'ovulation b) Des réserves assurant l'autonomie de cet oeuf hétérolécithe - Rappel de nomenclature des réserves des oeufs : oligo (échino), alécithe (mammifères), télo (reptiles oiseaux) ou centrolécithe (arthropodes) - Rappels de l'ovogenèse : cellules germinales primordiales - ovogonie - ovocyte I (bloque au stade diplotène de première division de méiose, lieu de la vitellogenèse) - ovocyte II Dernière modification : 18/04/17 2 - Les étapes de la vitellogenèse : prévitellogenèse de 2 à 3 ans puis vitellogenèse s.s de 3 mois environ - Les Réserves endogènes : Nature - aa, glucides, phosphore, vit, glycogène, ribosomes, liposomes, mito, ret endo, granules pigmentaires et corticaux (dérivé golgien dense aux e- à glycoprot, mucopolysacch et prot inactives) - protéines (de strut, enz et précusrseurs, fact de transcription, de croissance) - ARN t, m, r (formant organisateur nucléolaire : 500 copies, répliqué au stade pachytène de méiose et activement dupliqué donnant 2000 copies d'ARN 40 primaire donnant , 28, 18, 5,8S sous forme d'ADN circulaire extranucléaire qui s'accumule à un pôle du noyau formant cape nucléaire) - Les Réserves exogènes : le vitellus - mises en place au cours de la phase de vitellogenèse sous l'influence d'oestrogènes produits par cellules folliculaires déclanchant transcription de ARNm de vitellogenine des hépatocytes maternels. Endosecrétion de vitellogenine (470 KDa)dans le sang et passage intercellulaire jusqu'à membrane plasmique de l'ovocyte. Récepteur membranaire type Very Low LipoProt et endocytose à récepteur donne endosome puis fusion avec lysosomes. Clivage de la vitellogenine en phosvitine et lipovitelline puis concentration et deshydratation + cathepsineD (enz des lisosomes) - représente 80 % des réserves de la cellule oeuf - au final : 52% d'eau, 34.5 % de prot, 7.5 % lip, 3 % glucides 2% acides nucléiques c) Une distribution hétérogène des réserves - Notion de déterminant cytoplasmique : - substance ou groupe de substances localisées dans le cytoplasme dans une région particulière ou non de l'embryon ou d'une cellule. - Il garantit l'acquisition d'un état d'engagement dans telle ou telle voie de différentiation aux cellules qui en hériteront lors des divisions. En général associé au cytosquelette (moteur dynamique de la répartion différentielle) - Contribue à l'élaboration de divisions asymétriques engendrant deux cellules filles de taille inégale et/ou de prorpiéts différentes dans un meme environement. Générateur de diversité cellulaire! - Exemple de répartition asymétrique : - An1, an2, an3, Xlan4 au Pole animal (PA) - Vg1, Xwnt11 (les deux d'abord dans toute la cellule puis transportés vers PV grace aux microtubules pour Vg1 associé à Vera en 3' et VegT mais pas pour Xwnt11 qui n'est pas sensible à cochicine ou nocodazole et serait plutot transporté en meme temps que le smitochondries pdt ovogenèse) VegT, Xcat2 (code pour une prot qui se lie aux ARN), Xcat3, Xdazl (impliqué dans différentiation des cellules germinales), Xlsirt (ARN non traduit qui asure ancrage entre Vg1+Vera et acitne assurant ancrage dans le cortex) sont au pole végétatif (PV) BILAN - La cellule fécondable possède : - une symétrie radiaire (futur axe Antéro/Postérieur), - polarité structurale (PA pigmenté, PV non pigmenté + vitellus + RNP) et - une polarité moléculaire (ARNm = déterminants cytoplasmiques) Dernière modification : 18/04/17 3 2- La fécondation modifie la structure de l'oeuf : réorganise le cytoplasme : réactions d'activation, rotation du cortex et acquisition d'un plan de symétrie a) Modalités de la fécondation - fécondation pseudo-externe chez le urodèle : spermatozoïdes captés par la femelle et stockés dans le cloaque - fécondation externe chez les anoures : spermatozoïde entre en contact avec cordon gélatineux de la gangue puis enveloppe vitelline assure capacitation spécifique de l'espèce (limite fécondations croisées) - Le spermatozoïde est mobile et à structure classique L=28 m - reconnaissance ovocyte/spermatozoïde - fusion membranaire - pénétration du centriole proximal et du noyau haploïde mâle - donne spermaster dont microtubules s'associent à ceux du cortex promouvant le déplacement des nucleii male et femelle vers région centrale de l'hémisphère animal ou ils fusionnent Cascades de réactions membranaires, cytoplasmiques et nucléaires Conduit à : - activation du métabolisme, - blocage de la polyspermie (sauf cas physologiques comme chez l'axotl qui donnera à partir de 6 spermatozooide max mais un seul participe à l'amphimixie), - initiation du programme de dev b) Réactions d'activation : des barrières à deux niveaux - Première barrière ionique : dépolarisation très rapide suivie d'une repolarisation en qq min. - Deuxième barrière physique : - modalités : Libération du Ca2+, contration du cortex, expulsion des granules corticaux à partir du point d'impact et se propage rapidement à toute la surface - Conséquences : création de l'espace périvitellin (hydratation des mucopolysaccharide et constitution d'un gel avec afflux de liquide + hydrolyse enzymatique des intraction entre enveloppe vitelline et membrane plasmique)+ Formation de la membrane de fécondation (= chorion, par polymérisation des glycoprot des granules qui ont traversé l'espace périvitellin) - Rotation d'équilibration (=orientation) : - 30 min ap fécondation - rotation libre selon gravité : PA en haut (grad vitellin alourdit PV) - Reprise de méiose : émission du 2eme globule polaire et disparition du fuseau achromatique - Disparition de la tache achromatique c) Rotation corticale et mise en place de l'axe dorso-ventral - 1h30 ap fécondation - rotation de 30° du cyto superficel en direction du point de pénétration du spz - Mee de l'intervention du cytosquelette : - on observe réseau de microtubules contrôlé par le centriole provenant du spz, sur 5 m d'épaisseur, orienté parallèle à la rotation au PV - colchicine, choc hyperthermique ou traitement UV perturbent rotation - microbilles fluo associée (par ac carboxilique) à tubuline injecté au PV montrent transport de tubuline vers équateur - Conséquence de la rotation corticale : - déplacement des pigments et apparition d'un croissant dépigmenté côté opposé à pénétration du spz Dernière modification : 18/04/17 4 - coïncide avec future région dorsale - DONC : mise en place d'un axe de symétrie D/V d) Redistribution des déterminants cytoplasmiques - Les vésicules du PV contenant Dishevelled : - glissent vers le PA au cours de la rotation (associées aux microtubules) puis libération des prot qui diffusent dans le 1/3 dorsal - Dsh bloque l'activité de Glucose Synthétase Kinase3 (GSK3) qui ne phosphoryle plus la caténine (facteur nucléaire de transcription et assure ancrage cadhérine/cytosquelette) qui ne sera ainsi plus dégradée dans le protéasome mais s'accumule au pôle végétatif - Ilots du plasme germinal libérés de leur contact avec mito et plaques vitellines : se regroupent au PV et fusionnnent en un plasme germinal s.s - déplacement de pronucléii et trainée spermatique derrière le pronucleus male. - fusion des pronucléii (amphimixie = syngamie) Libération du Ca2+ conduit à pH qui active le métabolisme : conso O2 II. La segmentation : acquisition de l'état pluricellulaire diblastique 1- La MORULA : acquisition de l’état pluricellulaire (stade 16 cellules) a) Segmentation totale (holoblastique) - Par opposition à méroblastique - D'abord égale (première et deuxièmes perpendiculaires et méridiennes) puis inégale (horizontale : 4 micromères PA et 4 macromères PV) - Première division initiée au PA, se prolonge à v=1 mm/min dans le plan et passe par le croissant gris ds 50% des cas; vers PV à v= 0,003 mm/min - Le plasme germinal remonte le long du premier sillon puis forme 4 amas au PV qui seront localisés ds un petit nbr de macromères - premières divisions rapides (35 min. chez anoures, 70 min chez urodèles) - contrôle des cycles de div par MPF (maturation ou méiosis ou mitosis promoting factor) - formation des membranes d'origine mixte (héritée + néoformé : mee par marquage radioactif) b) Asymétrie du dev mais symétrie des noyaux - Exp de Speeman (1903 1938) - séparation des bastomères : - ss croissant gris donne masses de cellules épidermiques, mésenchymateuses et endodermiques - avec croissant gris (tt ou partie) : l'embryon se dev normalement c) La transition blastuléenne - désynchronisation des divisions après la 10-12eme (4096 cellules) du à vitellus - reprise de transcription 2- La BLASTULA : une structure diblastique - Rappels structure de la blastula : micromères et macromère diblastique (microvillosité ext, Sphérique. Environ 10 000 cellules a) Importace des Jonctions intercellulaires et molécules d'adhérence - Gap junction : mee du rôle ds le dev : injection d'anticorps anti connexines : obtention d'embryon anormaux ss oeil coté de l'injection - cadhérines Dernière modification : 18/04/17 5 b) Importance des interaction Matrice ExtraCellulaire / cellule - Mise en place de la MEC : - feutrage face basale du toit du blastocoele : FN et laminine - Interactions via intégrines (domaine RGDS) avec cytosquelette 3- Induction du troisième feuillet : le mésoderme a) La blastula contient déjà les cellules fondatrices des trois futurs feuillets (l'ecto / méso / endoderme) - Exp de Nieuwkoop 1969 : section horizontale séparant territoires et culture qq jrs en solution saline - calotte animale donne ECTO - zone marginale donne ECTO + MESO - hémisphère végétatif donne ENDO - Etablissement de la carte des territoires présomptifs : - méthode : injection ds un blastomère de RLDx [Dextrane (PM élevé donc ne diffuse pas entre blastomères) associé à marqueur fluo (Rhodamine Luminescent)] : les blastomères d'une mm lignée en héritent (observation in toto ou en coupe, sous irradiation UV) b) Les processus d'induction (spécifiant la destinée des cellules) - Quelques notions : - Notion d'induction : commutation d'une voie de différentiation à une autre sous le contrôle d'une cellule, d'un groupe ou d'un tissu - Notion de signal inducteur : molécule diffusible émise par la cellule inductrice et qui doit interagir avec la cellule cible - Notion de compétence de la cellule cible : 1932 Conrad Hal Waddington passe par fonctionnement des molécules participant à réception + transduction + traduction Ds le cas de la zone marginale : acquisition entre les stades 32 et 128 cellules de la capacité à donner du mésoderme - Identification des tissus inducteurs : - exp de Dale et Slake 1987 : culture de tissus à partir de blastomère de PA associés à macromère de l'hémisphère végétatif : selon position D/V donne tissus différents - centre de Nieuwkoop dorsovégétatif : exp de Gimlich Gerhart 1984-1986 in vivo avec greffe de macromère dorsal sur cellule oeuf traitée ou pas auxUV (bloque rotation) - Des marquages fluo sur macromère greffé montrent que le méso n'est issu que de l'hôte - signal diffusible à travers une grille et agissant jusqu'à 80m (5 diamètres cellulaires) - qq chiffres : 2h pr induire cellules musculaires et ap 12h début de transcription des gènes muscu - Il existe effet de groupe (quantitatif) - Identification des substances inductrices - Méthodologie : - deux approches différentes : - bioch + biocell : tester la nature inductrice de molécules déjà connues pour cela - bio mol - critères d'une substance inductrice : - distribution au bon endroit au bon moment (avant Transition Blastuléenne) - in vitro induit MESO en présence de cell du PA - in vivo injection ds blastomère végétatif ventral : induit MUSCU + CHORDE - in vivo restaure formation d'un axe de sym sur embryon irradié UV Dernière modification : 18/04/17 6 - si l'action de l'inducteur est bloquée (technique du dominant négatif : ex = expression d'une protéines mutée de son domaine à activité), la réaction n'a pas lieu - Les molécules inductrices : - FGF : Fibroblast Growth Factor 17 à 34 KDa transduit par récepteur à activité tyr kinase dimérisé assure changement de forme et d'adhésivité. Transduction par voie de la MAPKinase. - Suffisant pour déclencher différentiation de cell du PA en MESO! - Technique du dominant négatif : injection d'ARN codant pour récepteur à FGF délété du domaine cyto montre que région troncales et post sont absentes. - Bon condidat mais on pense qu'il assure plutot le maintien de l'induction - desTGF: Transforming Growth Factor dont les ss familles st activine, Vg1 et Nodal - méca d'action : Récepteurs type I/II ser thréo kinase (dimere type II recrute monomère type I) ce qui phosphoryle Smad prot qui transloquent ds le noyau comme fact de transcription - Les activines A et B : 1987 Jim Smith à faible dose provoque EPI à partir de PA et à forte dose provoque MESO , CHORDE. Mais en fait n'apparaît qu'après TB et ne restaure pas l'axe sur embryon irradié - Vg1 : 1987 Doug Melton montre activation de la protéine suite à réaction corticale par une protéase, surtout coté dorsal; et répond à tous les critères - Nodal : gradient de concentration à partir du centre de Nieuwkoop. Agius 2000 injecte ARN de prot inhibitrice (fragment de cerbérus) ds blastomère végétatif au début du dev puis ap segmentation isole ces blastomères et les me en contact avec PA : pas d'induction MESO. Idem mais surexpression de Nodal : faible dose donne MESO Ventral forte dose donne MESO dorsal DONC nécessaire et suffisant pour induire MESO dorsal et ventral - Des ARNm codant pour des facteurs de transcription : - siamois détecté juste pdt TB (pas d'origine maternelle) et localisation végétatif dorsale, n'apparait pas si pas de rotation corticale ; répond à tous les critères. Transcrit sous contrôle du complexe caténine/Tcf3 - ARNm de VegT : si on empêche sa transcription, plus d'ENDO! - Dsh + GSK3+bêta caténine : si on bloque GSK3 embryon hypercéphalique ss struct ventrale c) Bilan : modélisation des interactions induisant le mésoderme au niveau du centre de Nieuwkoop cf. p70 du "Intro à la bio du dev" Thierry Darribère Belin Sup III. La gastrulation : acquisition de l'état triblastique 1- Mise en évidence de mouvements morphogénétiques a) Colorations vitales de Vogt (1929) - Matériel et méthode historiques originaux : fragments d'agar contenant colorants vitaux (bleu de nil et rouge neutre) à la surface d'embryons d'urodèles. - Matériel et méthodes actuels : greffes embryonnaires, traceurs radioactifs, enzymatiques ou fluorescents, microcinématographie et microscope électronique à balayage. - Observation des marques colorées Dernière modification : 18/04/17 7 - déposées par rapport à l'encoche du blastopore (sous l'équateur, dans la région dorsale de l'embryon et perpendiculaire au plan de symétrie; limité vers le pôle animal par lèvre dorsale du blastopore) - Observation macroscopiques et à la loupe bino en surface et en coupe - Résultats : réalisation de carte des territoires présomptifs b) 5 phénomènes fondamentaux mis en évidence : - épibolie des cellules de l'hémisphère animal (marque n°1), fondatrices de l'ectoderme - déclenchement de la gastrulation par invagination autonome de certaines cellules - rotation de l'endoderme qui positionne l'endoderme pharyngien et prolonge, amplifie et oriente l'invagination du mésoderme (marque n°2) - extension convergente des cellules de la zone marginale (marques n°3) associée à l'intercalation en profondeur et en superficie des blastomères de cette région. - migration active des cellules fondatrices du mésoderme sur la face interne des cellules du toit du blastocoele. c) Diversité selon les espèces - origine du mésoderme : - superficiel et profond chez urodèles et qq anoures; - profond seulement chez xénope et anoures en général - moteur de migration : - migration des cellules chez urodèles, - extension convergente chez xénopes et anoures en général - Exp De Rudolph Winklbauer (1999) sur xénope : mvt global de rotation de l'endoderme dans la région dorsale de la gastrula (par méthodes de greffes homotopiques, microcinématographie et marquages cellulaires) qui assure : - prolonge invagination des cellules en bouteille - positionne l'endoderme pharyngien en avant du mésoderme et contre le toit du blatocoele - Entraîne les cellules du mésoderme céphalique puis chordal vers l'int de l'embryon - maintien ces cellules contre le toit du blastocoele 2- Mécanismes moléculaires et cellulaires des mvmts morphogénétiques a) L'épibolie : modif des interactions Cell/Cell/ MEC à la surface et mise en place de l'ébauche d'épiderme - Définition: processus qui touche les cellules de l'hémisphère animal en surface, tendant à le recouvrir pour donner cellules fondatrices de l'ectoderme - Conséquences : - réalisation de 2 couches de cellules (ou 1 chez urodèles) - recouvrement vers le blastopore par cellules de l'hémisphère animal - 2 Mécanismes cellulaires : - en surface (chez xénope, absent chez urodèles) : division orientées par axe du fuseau achromatique tangent à la surface. - en profondeur (au moins 2 couches de cellules chez xénope) : changements de forme des cellules qui émettent interdigitations qui permettent leur intercalation radiaire -2 Mécanismes moléculaires - Rôle des cadhérines dans les intercations cell/cell : injection d'ARNm de E-cadhérine non fonctionnelle (sans domaine cytoplasmique donc pas d'interaction avec cytosquelette, alors que l'interaction homophilique est conservée) dans les blastomères, graves modifications (trous ds la couche externe) Dernière modification : 18/04/17 8 - Rôles de la FN dans les interactions : - 1984 Boucault et coll greffe toit du blastocoele à l'envers : les cellules de zone marginale contournenet cette zone - injection d'Ac anti-FN dans blastocoele provoque épaississement du toit (replis par épibolie sans migration) - Blocage des intégrines alpha 5 + bêta1 par anti corps : idem - injection de peptides RGDS : idem! - Conséquences : désorganisation de l'orientation des fuseaux - 1989 Shi et coll mettent en culture explant de toit de blastocoele de jeune gastrula sur du plastique puis laissent qq heures puis retirent les cellules mais laissent MEC puis mettent explant d'une autre gastrula mais perpendiculaire : la croissance des cellules mésodermique retrouve l'orientation des premiers tissus mis en culture : la MEC donne des signaux de direction - Travaux récents Marsden et DeSimone (2001) avec RLDx et microcinématographie montrent que in vitro des cellules profondes marquées déposées sur couche de FN ne se détachent pas (alors que ça ne marche pas pour laminine, collagène, albumine sérique ou platique seul) et permettent épibolie des couches superficielle donc FN participe à épibolie indirectement b) Mouvements d'extension convergente radiaires de la zone marginale : commandés par Wnt - Nomenclature Wingless de drosophile et Integration site n°1 de souris (protooncogène) - 16 types de Prot glycosylées de 39 à 46 kDa, riches en cystéine (23 à 24 résidus) et secrétées - interagissent avec Récepteur LowDensityLipoprot Récepteur Prt (LRP) et Frizzled (Récepteur 7TM de 7 types différents) - Deux voies principales : - on ne traite pas voie calcique mal connue - voie de bêta caténine : active Dsh qui bloque GSK3 - voie de polarité planaire (gènes cible = gènes d'adhérence, de dynamique du cytosquelette et de polarisation des cellules : par Dsh, Cdc42 (GTPase) qui agit sur cascade de JNK - Confirmation : - localisation de Xwnt maternel dans cortex puis PV puis zone marginale dorsale - injection dans embryon irradiée : donne bien somites et tube neural mais pas les yeux c) Mouvement d'invagination de la zone marginale et mise en place du troisième feuillet : imp de la MEC - Apparition de cellules en bouteille - Première observation en 1907 par Angello Ruffini sur Triton - formation provoqué artificiellement au toit du blastocoele par injection d'ARNm d'activine, Nodal, Vg1 et VegT (facteur de transcription) au pôle animal avant fécondation. Effet / dose - Conséquences premières : traction de l'épithélium et courbure puis formation de la lèvre dorsale du blastopore - Etapes suivantes : - involution de la zone marginale (changement de forme) du à traction par cellules en bouteille de lèvre blastoporale et acquisition d'un phénotype migratoire (motilité possible in vitro dès transition blastuléenne) des cellules de la zone marginale (lobopode à activité rotatoire qui permet si contact cellulaire l'agrégation ou lamellipodes + filopodes si contact avec MEC - élongation de l'invagination du mésoderme au toit du blastocoele Dernière modification : 18/04/17 9 3- Bilan fin gastrulation a) Organisation de populations cellulaires en trois feuilles distincts et superposés b) Mise en places de cellules fondatrices du mésoderme en particulier dorsalement avec mise en place de la chorde c) apparition d'une nouvelle cavité qui préfigure lumière du Tube Digestif : archentéron d) Les mouvements morphogénétiques rapprochent des cellules qui étaient éloignées : possibilité de nouvelles inductions IV. La neurulation : acquisition du plan d'organisation primaire de l'embryon 1- Modifications morphologiques de la région dorsale a) Bourrelet, gouttière, sillon puis soudure neurale et dilatation des vésicules céphaliques primaires - Pro/mes/rhombencéphale et moelle épinière postérieure b) Coelome et archentéron - repli dorsal de l'endo ferme dorsalement archentéron qui était initialement mésodermique - creusement de meso latéral qui préfigure cavité générale de l'adulte - lames latérales creuses (coelome) se rejoignent ventralement : leur point de rencontre antérieur donnera coeur 2- Mécanismes cellulaires: changements de formes et d'adhésivité a) Changements de forme - allongement par microtubule (colchicine bloque épaississement plaque neurale) - enroulement de la plaque neurale par constriction d'un anneau d'actine - soulèvement des crêtes neurales impliquerait acides hyaluroniques, par gonflement - fusion des bourrelets : méca inconnus (cadh?) - recouvrement par épiderme? - allongement antéro postérieur : intercalation longitudinale et div cell b) Adhésivité sélective - apparition de Ncadhérines et NCAM apparaissent tandis que ECAM disparaisset de plaque neurale - Mise en évidence d'une affinité sélective des trois feuillets: par désaggrégation des cellules de neurula (après formation du Tube Neural) par pH alcalin puis réassociation à pH physiologique de neurulas de 2 phénotypes différents (plaque neurale pigmentée réassocié à région épidermique ventral non pigmenté) : on observe formation d'un TN pigmenté au coeur et d'un épiderme non pigmenté autours - exp de Boucault 1974 par marquage radioactif d'une gastrula donneuse puis injection dans le blastocoele d'une gastrula receveuse : chaque cellules d'origine rejoint son feuillet et s'y multiplie mais plus ap le stade neurula (rejoint toujours l'endoderme et y forme un amas) Dernière modification : 18/04/17 10 3- Induction du tube neural (TN) par lèvre dorsale du blastopore (centre de Speemann) a) Exp de Speemann et Mangold 1924 - Réalisation d'un témoin = mise en culture de cellules de la lèvre dorsale du blastopore (seules) : forment MESO Dorsal mais ne forment pas de dérivés du TN; mais mise en culture avec micromère PA donnent dérivés EPI, TN et MESO chorde - greffe de Lèvre Dorsale de Blastopore isochronique (entre deux stades équivalents ici début de gastrula) ectopique (en un lieu différent du lieu physiologique ici ventral au lieu de dorsal) - Résultats : - Obtention d'un embryon double (au lieu d'apparition de cellules de chorde attendues!) - les cellules greffées n'interviennent pratiquement pas : pas dans tube neural ni dérivés mésodermiques = recrute (forme chorde, partie des somites et du toit de l'archentéron) - CONCLU : lèvre dorsale du blastopore = centre inducteur organisateur (dit de "Speemann") b) Induction du mésoderme dorsal et ventral par des prot secrétées et des facteurs de transcriptions (prot. nucléaires ) - goosecoid : ARN présent dès segmentation et transcrit ds cell préchordales (les premières cell du méso qui migrent sur le du toit du blastocoele) - son injection ds blastomère ventro-végétatif stade 4 cell conduit ds 75 % des cas à 2eme axe A/P - son expression est régulée Vg1 et/ou activines (rappel des méca d'action : Récepteurs type I/II ser thréo kinase qui phosphorylent Smad prot qui transloquent ds le noyau et agissent comme fact de transcription; les activines A et B ont une action effet/dose = à faible dose provoque EPI à partir de PA et à forte dose provoque MESO , CHORDE. Mais en fait n'apparaît qu'après TB et ne restaure pas l'axe sur embryon irradié) - Noggin : prot 32 kDa sécrété (peptide signal), ARN maternel, capable d'induire du meso dorsal (somite mais pas chorde) dans du dérivé meso ventral - chordin : prot de 120 kDa; son injection dans embryon irradié restaure un axe A/P et D/V complet - BMP4 (Bone Morphogenetic Prot) de 400 à 500 aa; secrétée (propeptide et seq hydrophobe N terminale + seq active C terminale); absent du centre de Speemann et inhibé par chordin et noggin (par liaison). - ARN présent ds blastula. - Si Injection ds oeuf avt première div : tt le MESO sera Ventro Lat. - Si injection ds blasto dorsal stade 4 cell, tt le meso dorsal sera ventralisé - Si inhibition ds région ventrale : provoque second axe V/D - CONCLU : Induirait meso Val et Latéral - Frizbee secrétée bloque Xwnt8 c) nécessité d'un contact du chordomésoderme (centre de speemann) avec ectoderme pour l'induction du TN : Expériences de Holtfreter et Hamburger 1955 - chez urodèles : culture de blastula en milieu hypotonique : exogastrula ss TN (PA ecto + blastocoele; PV : endoderme périphérique + chorde et somites et structures mésocéphaliques) : la migration des cellules sur MEC sont abolis - Idem si injection de peptides RGDS - N.B : chez xénope il existe TN réduit au contact ecto/endo : l'ectoderme possède une une capacité autonome à se neuraliser d) L'induction neurale est régionalisée en fonction du temps - Exp de Mangold 1933 : dissection de mésoderme dorsal d'une jeune neurula (ouverture de l'ectoderme) selon l'axe A/P puis greffe dans blastocoele d'une jeune gastrula au pôle opposé à lèvre blastoporale pour ne pas perturber mvt invagination : on observe qu'un greffon antérieur donne naissance à structures Dernière modification : 18/04/17 11 neurale antérieures (vésicules otiques, optiques en encéphale) ; méso troncal donne cerveau postérieur et moelle épinière; meso postérieur n'induit que moelle épinière - Exp. de Holtfreter 1936 : dissection de lèvre dosale du blasopore au début et fin de gastrulation et mise en culture dans sandwich de cellules du toit du blastocoele de gastrula : les explants prélevés au début induisent des structures neurales antérieures et celles prélevées tardivement des structures neurales postérieures - Hypothèses consernant les inducteurs possibles : soit deux (D+V) soit un (Gradient D/V) - Modèle de Nieuwkoop 1952 : signal vertical émis par mésoderme vers ectoderme et signal tangentiel (acide rétinoïque, Wnt et FGF) émis dans plan de l'ectoderme par lèvre blastoporale : - signal tangentiel : - bcp d'acide rétinoïque empêche le dev des structures neurales antérieures - surexpression de Wnt3 postériorise le dev des structures neurales antérieures - FGF favorise présence de structures neurales postérieures (exp de culture de d'ecto dorsale + noggin, chordin ou follistatin donne neuralisation ant mais ave c FGF donne neuralisation post) - signal vertical : - ARN de follistatine présents ds blastula puis centre Nieuwkoop se complexe avec activine qui, sur l'ectoderme, se lie à récepteurs qui, sinon, empêchent différentiation en TN donc là ça permet formation du TN - ARN de noggin bloque BMP4 - chordin induit méso dorsal et participe à induction neurale - Cerberus secrété bloque Xwnt8, Nodal et BMP et donc induit tête (centre organisateur de la tête complémentaire du centre de Speemann organisateur postérieur et du tronc) e) BILAN (schéma cf p112) Dernière modification : 18/04/17 12 V. L'organogenèse : différentiation des tissus vers un organisme autonome 1- Généralités sur les contrôles exercés par les gènes type homéotiques - 1894 Wiliam Bateson : notion de mutant homéotique : chez Drosophila melanogaster transformant une partie du corps en une autre - 1950 Lewis montre que mutation sur un seul gène suffit à provoquer ses changements. Ex. bithorax fait apparaitre seconde paire d'aile sur 3eme segment thoracique ou antennapedia (porte une paire de patte à laplace des antennes!) - 1980 : structure des gènes homéotiques (appelés Hox chez Xénopes et tous les Vertébrés : 180 pb codant pour domaine de 60 aa capable de se fixer à l'ADN), organisés en complexes qui s'expriment dans l'ordre ds lequel ils sont positionnés et à l'ordre anatomique des segments où ils s'expriment (dominance postéieure) - Controle par FGF, BMP - Info à tt moment et en tt point de l'axe A/P, V/D et proximo/distal - l'association de cellules en tissus et de tissus en organes repose sur l'expression spatio-temporelle de moléculesd'adhérence et de signalisation 2- Organognèse de l'ectoderme : épiderme et système nerveux a) Epiderme et dérivés - Rappel : ectoblaste donne epiblaste + neuroblaste - l'Epiderme unistratifié se dédouble : périderme superficiel + couche germinative siège de nombreuses mitoses donnant épithélium pluristratifié pdt métamorphose - Invaginations de l'épiderme donnent glandes acineuses (mucopolysaccharides ou prot venin) - Epaississements locaux ne touchant pas périderme donnent placodes : - placodes adénohypophysaires, - olfactives, - cristallinienne et otiques - et du système latéral (s'allongent sur ligne médiane chez Vertébrés aquatiques donnant neuromastes = neurones + cellules de soutient + cellules sensorielles ciliées, sensibles aux variations de pression) b) Système nerveux central et cellules dérivées des crêtes neurales - Vésicules céphaliques primaires et secondaires commandées par gènes homéotiques - PROSencéphale donne TEL + DIencéphale - TEL donne hémisphères et Bulbe olfactif. Creusé des ventricules I et II - DI creusé du ventricule III possède toit membraneux richement vascularisé et plancher épaissi donnant Hypothalamus et thalamus + latéralement vésicules optiques - MESencéphale s'épaissi donc pas de ventricule mais juste un canal. Les neurones innervent ap resp + digestif + vasculaire - METencéphale dont le toit est le cervelet creusé du IV ventricule - MYELencéphale = BULBE rachidien creusé de rhombomères transitoires : dans les pairs se connectent neurones aux ganglions sensoriels craniaux et dans les impairs sortent motoneurones. Contrôle des rhombomères par gènes homéotiques Hox donnant info de position A/P - Mitoses du neuroépithélium le plus proche de l'épendyme ou des ventricules; migration des cellules vers la périphérie (pour les centres, formant cortex) ou ventrolétéralemetn (pour la ME) et différentiation en motoneurones sous l'action inductrice de la chorde; différentition des deux poles dendritiques et axonale avec cône de croissance guidé par NGF + laminine Dernière modification : 18/04/17 13 - cellules de cretes neurales : - début de migration déclenché par perte de Ncadhérines + tenascine inhibe + acide hyaluronique élargit les espaces intercellulaires facilitant les passages. La réaggrégation passe par réapparition des Ncadh - les cellules migrent en formant un cordon puis, une fois à destination, s'aggrègent - Prot à activité adhésive, protéolytique, signalisatrice et de fusion : ADAM13 remodèle fibronectine grace à activité metalloprotéase qui clive FN Une mutation sur ce domaine MP d'ADM 13 chez Xenope bloque migration cell crete neurales c) Organogenèse de l'Oeil : une cascade d'inductions - Induction du cristallin : Exp de Spemann 1901 (destruction champ morphogénétique de rétine sans léser champ du cristallin),et Lewis 1904 (greffe de Vésicules optique sur epiderme céphalique donne qqch proche d'un cristallin) complété par études de Grainger 1990 sur cristallin par marqueurs fluo + Ac anticristallines + greffes de gastrula ou neurula montrent qu'il existe trois phases : - Compétence : stade gastrula moyenne - Prédisposition : stade neurula où l'ecto présomptif de cristallin est induit par plaque neurale et endoderme antérieur - Détermination par vésicule optique : cristallin au bon moment au bon endroit et bonne taille - Différenciatin du cristallin : - cellules de la partie postérieure de la vésicule cristallinienne forment un épithélium monostratifié a forte activité mitotique s'étire et se différencie en synthétisant cristallines qui extrudent le noyau. - cellules de la partie antérieure se multiplient et se déplacent vers l'arrière formant couche germinative qui synthétise fibres secondaires de cristalline. Dure toute la vie; FGF inhiberait un facteur mitotique inconnu - La formation de la cornée par le cristallin - épithélium de la cornée synthétise 20 couches de collagène formanat stroma primaire. Cell venant de capillaire s'insinuent et secrètesnt ac hyaluroniques fait gonfler l'espace ds lequel les cellules des cretesneurales s'insinuent et secrètent hyaluronidase qui fait dégonfler. Se forme le stroma secondaire par tyroxine qui deshydrate. matrice de colagène devient transparente et forme cornée 3- Organogenèse de l'endoderme : appareil digestif et respiratoire - différentiation d'un épithélium endodermique antérieur respiratoire et d'un épithélium postérieur digestif - puis différenciation en région pharyngienne oesophagienne gastrique (pdt métamorphose seulement) et intestinale - lames latérales donnent splanchnopleure donne cellules mésenchymateuses associées à l'épithélium se différencie en muscles lisses longitudinaux et transverses (mvt péristaltiques) - 5 paires de poches pharyngiennes donnent : oreilles moyennes en communication par trompe d'Eustache, 3 paires s'ouvrent donnant fentes viscérales et vascularisation des parois donnant branchies, autre poche donne thymus, parathyroide, corps ultimobranchiaux - oesophage (estomac pdt métamorphose seulement) - 4 bourgeons épithélium endodermiques donnent 3 glandes pancréas, foie, vésicules biliaire (fusion de 2 pour pancréas) Dernière modification : 18/04/17 14 4- Organognèse du mésoderme : chorde, somites et cellules germinales MESO céphalique / chordal / Feuillet moyen (somites + pieces intermédiaires + lames latérales) a) chordes - cellules à grosse vacuole et cyto périphérique - sécrétion d'une gaine spéciale de matrice extracellulaire formée de collagène et glycosaminoglycanes en une couche interne, doublée d'une couche élastique à la périphérie - Mise en place de polarité dorso/ventrale du Tube Neural par chordin + Noggin + follistatin inhibant BMP4, polarité qui serait maintenue par "SONIC HEDGEHOG" b) gonades - un gène porté par le chromosome Y inhiberait un gène porté par un chromosome autosomique (gène A) - la différenciation des gonades est d'orogine mixte : - cretes génitales formées par épaississement, creusement et élongtion dorsoventrale du MESO intermédiaire - l'épithélium des ses crètes = CORTEX; se multiplie formant des cordons de cellules qui s'insinuent dans le mésenchyme et forment + MEDULLA - colonnisation (3 divisions au cours de la migration) par une trentaine de cellules germinales (qui donneront les gamètes) provenant du TD dorsal et postérieur (concentration de plasme germinal! Pas chez urodèles) et passant par mésentère dorsal - différenciation du sexe : - chez le mâle : les cordons cellulaires entourent les cellules germinales et se détachent du CORTEX. Synthèse d'une épaisse matrice extracelulaire albuginée donc gamètes profonds ds testicules - chez la femelle : les cellules germinales se placent près du cortex, les cordonscellulaires dégénérent puis des cordons secondaires se mettent en place à partir du cortex qui restent en périphérie de chaque gamète formant thèque c) somites c1) fragmentation du MESO paraxial depuis le pole antérieur vers le pole postérieur formant SOMITE (pleine chez anoures, creuse chez urodèles : somitocoele et structure en rosette + qq cel mésenchyme). Entre chaque somite, cloisons conjonctives. En périphérie, dans le derme, le tissu conjonctif est fibreux (collagène) puis plus en profondeur se trouvent les fibroblastes et mélanophores - chaque somite se différencie de façon autonome - SCLEROTOME profond (vertebres + cotes) + MYOTOME (muscles) moyen + DERMATOME (derme) externe - somitogenèse controlée par modif d'adhésivité à la MEC : FN ds espaces devant somite, Ncadh à la surface des cellules cote antérieur du somite en formation c2) cell profondes du SCLEROTOME - Par Induction par chorde + TN + MEC : se dispersent et migrent vers chorde et TN formant manchon de chondrocytes - Le tissu conjonctif dense (contrairement au conjonctif lâche des nageoires) compose le tissu squelettogène qui entoure la moelle épinoiere, la chorde et l'artère caudale - secrète glycosaminoglycanes, se chondrifient et s'ossifient formant squelette axial (vertèbres) et cotes - ostéogenése : 2 voies: ossification de membrane (os directement) et ossificationendochondrale (via cartilage) par BMP (famille des TGFbeta de 30kD dimériques)) - Ossification endochondrales : Dernière modification : 18/04/17 15 c3) Puis celle du MYOTOME s'isolent formant myoblastes précurseur de muscu vertébrale, strié squelette troncal et caudal et des membres - Migration puis différenciation (plus de récepteur aux FGF, synthèse de FN interaction avec intégrine alpha5beta1, induit par MyoD et Myf activant actine ,créatine phosphokinase, et myogénine (Facteur de transcription propre aux cellules musculaires). Fusion en myotube plurinuclée et synthèse des prot (actine myosine desmine vimentine) myofilament myofibrilles contractiles La cellule musculaire : une fibre allongée striée Notion de fibre - Longue cellule (L=10cm; Ø=100m) plurinuclée = syncitium (? cellules musculaires lisses ou cardiaques) - Centaines de noyaux par cellule - Noyaux repoussés en périphérie - Association avec quelques cellules à caractère embryonnaire : (assure renouvellement cellulaire en cas de destruction des cellules spécialisées) La striation : une organisation répétitive du cytosquelette - Les myofibrilles : des éléments du cytosquelette allongés - Le sarcomère : unité répétitive des myofibrilles - Qualitativement, les myofilaments des cellules musculaires striées diffèrent de ceux des autres cellules; principalement par leur organisation : - Myofilaments d'actine F : (SIV d'actine G) de la cellule musculaire sont les seuls à contenir de la troponine, mélange de 3 polypeptides (troponine T avec site de fixation à tropomyosine,troponine I qui empêche la fixation du Ca2+ et troponine C qui lève cette inhibition) (alors que l'actine fibrillaire est ubiquite) (= favorise le décrochage brutal de toutes les molécules en même temps) - Ces myofilaments d'actine (A) sont liés entre eux par des actines qui constituent les stries Z - Les myofilaments d'actine sont reliés à la membrane plasmique par des desmines (51 kDa, structure proche de la vimentine) - Myofilaments de myosine : n'existent pas à l'état permanent dans les autres cellules (même dans les cellules musculaires lisses) (Myosine + actine pure Ô activité ATPasique de la myosine est activée = leur contraction ne dépend pas du Ca2+) - Les myofilaments de myosine (M) sont liés entre eux par les protéines M qui matérialisent le milieu de la bande H du sarcomère - Bandes claires (I) et bandes sombres (A) - Isotropes à la lumière : filaments d'actine seuls - Anisotropes : filaments de Myosine et d'Actine + associés - Les filaments annexes : (actine , desmine...) sont très structurés par rapport aux autres cellules - Quantitativement : les myofilaments sont très abondants - 50% des protéines cellulaires Les autres organites s’organisent autours des sarcomères - Le système en T : la membrane plasmique s'invagine profondémént au niveau des stries Z - Le réticulum lisse sarcoplasmique : des citernes à Ca2+ qui enrobent les myofibrilles Dernière modification : 18/04/17 16 - Formation de triades - Pieds jonctionnels = prot assurant transmission de ddp de membranen à sarcoplasme - Pompes calciques transmembranaires sur sarcoplasme - Rôle du relargage du Ca2+ dans le déclenchement de la contraction : associassion avec Troponine, qui démasquent sur actine les sites de fixation de myosine - Les mitochondries encadrent les triades : ravitaillement énergétique Dans la queue, les fibres périphériques de faible diamètre (25 m) ont un sarcoplasme développé riche en mito et se contractent rapidement = équivalent de muscle rouge; les fibres centrales plus grosses (70 mm) se contractent plus lentement et forment le muscle blanc, pauvre en mitochondries. Interactions entre éléments du cytosquelette et contraction - Changements actifs de conformation des myosines et raccourcissement des sarcomères - Fixation de Ca2+ sur troponine et interaction actine/myosine - Suite à une excitation, du Ca2+ se fixe sur les 4 sites fixateurs de la troponine - Les tropomyosines glissent ce qui démasque des sites actifs sur les actines - Les têtes de myosines se fixent sur les sites d'actine (fonctionnement de la charnière n°1) -Glissement des têtes de myosines le long des actines : activité ATPasique à répétition des tetes de myosine - Par contact et déformation des têtes de myosine Ô elles expulsent ADP+P Ô déforme têtes de myosine Ô pivotent Ô le pivotement les détache Ô retour à leur position initiale Ô pénétration d'ATP transformé en ADP+P = activité ATPasique des têtes de myosine etc. - Utilisation des réserves hyaloplasmiques - Réserves énergétiques - ATP donne ADP - Créatine-Phosphate, - forme de stockage de l'énergie de l'ATP produit par les mitochondries - A libération rapide d’énergie : permet de rephosphoryler ADP - Glycogène très abondant dans les fibres de la queue, - réservoir de glucose (glycolyse dans les mitochondries fournira ATP) - Lipides = triglycérides. Dégagement de chaleur - Commande coordonnée de la contraction des sarcomères - L'excitation du nerf (propagation d'un influx nerveux) déclenche un potentiel d'action dans la membrane plasmique de la cellule musculaire qui se propage le long de la membrane du système en T et arrive en qq ms? à toutes les stries Z de la cellule musculaire 2+ Ô le signal électrique est transmis (Pieds jonctionnels, Canaux Ca voltage dépéndant pour le Ca2+, des pompes à Ca2+s) au réticulum sarcoplasmique 2+ 2+ Ô libération dans le cytoplasme d'une grande quantité de Ca stockée dans la lumière du réticulum [Ca ] = au lieu de Ô les sarcomères d'une même cellule se contractent en même temps : raccourcissement de plusieurs centimètres Dernière modification : 18/04/17 17 c4)- Puis migration de DERMATOME donne mésenchyme qui donne fibroblastes et muscle lisse du derme VI. La métamorphose : une seconde embryogenèse ; acquisition du plan d'organisation des Amphibiens 1- Les étapes de la métamorphose : un climax longuement préparé a) Rappel des ppales étapes de DE chez Amphibiens - bourgeon caudal se libère de ses enveloppes (membrane e fec = chorion) et devient libre, apte à la nage et prise de nourriture : stade tétard - Possibilité de métamorphose donnant JUVENIL immature sexuellement. L'adulte occupe une nouvelle niche écologique et colonise un nouvel habitat. Pas de quiescence (pas d'entrée en vie ralentie) : phénomènes continus impliquant phénomènes cellulaires tels que apoptose, histolyse, changement de métabolisme, expression de nouvelles molécules - Principales modifications : - destruction des structures spécifiques du tétard : queue, branchies - remodelage de certains organes : locomoteur, circulatoire, digestif - dev de structures nouvelles : appareil respiratoire - Contrôle hormonal de la métamorphose : - c'est le taux de prolactine qui maintien la vie larvaire - sécrétion d'hormone hypothalamique à cible adénohypophysaire qui secréte alors TSH (Thyroïd stimulating Hormone) qui secrète alors T3 dont les tissus cibles vont s'engager suite à transduction du signal ds une nouvelle voie de différentiation b) La PREmétamorphose Peu de transformations juste après l'éclosion - Peu durer de un mois à un an suivant température et photopériode notamment) c) La PROmétamorphose - Ralentissement de la croissance du têtard - Durée : 2 à 8 semaines à 20°C d) Climax - dure moins de 2 semaines à 20°C e) acquisition de la maturité sexuelle Cas de Néoténie accidentelle (géographique) ou, facultative (Ambystoma mexicanum = Axolotl ou obligatoire (Necture = chien de vase des grands lacs nord américains) avec possibilité de maturité sexuelle chez les urodèles 2- Destruction des tissus spécifiques de la larve : queue, branchies a) Régression de la queue chez les têtards d'anoures en métamorphose - Premiers signes morphologiques : amenuisement et noircissement de l'extrémité (accumulation de mélanophores) - Etudes cytologique : - Désorganisation précoce et oblitération des vaisseaux par plissement des parois Dernière modification : 18/04/17 18 - individualisation et rétraction des fibres musculaires non simultanées (d'où déformation de la queue) qui se fragmentent en petites sphères = sarcolytes - Caractères microscopiques de la dégénérecence des fibres : 1- dilatation des mito 2- raréfication des grains de glycogène 3- dépolymérisation rapides des filaments d'actine 4- destruction des stries Z et desorientation des myofilaments des myofibrilles 5- libération dans l'espace intercellulaire du contenu des sarcolytes 6- deshydratation et diminution de volume (apoptose) - dégénerescence de la chorde de l'arrière vers l'avant : 1- cytoplasme de plus en plus chromophile, 2- apparition de nombreuses vacuoles autophagiques, 3- gonflement puis plissement des gaines fibreuses et élastiques puis rupture - dégénérescence tardive des cellules de la moelle épinière en deux temps : 1- petites aires de nécrose dans le cytoplasme séquestrées dans vacuoles autophagiques qui se transforment en corps résiduels granuleux et/ou riches en tourbillons membranaires 2- généralisation de l'autolyse et mort cellulaire 3- Involution des 2 neurones géants latéraux de Mauthner et des 250 neurones géants latéraux de Rohon-Beard sensitifs - Phagocytose du matériel en cours de nécrose par des cellules issues des fibroblastes mésenchymateux : 1- s'insinuent précocément entre les fibres, 2- émettent des expansions et secrétent des hyaluronidases qui facilitent leur progression et diminue cohésion des fibres de collagène du derme et du tissu squelettogène 3- séquestrent du collagène, des pigments et débris cellulaires dans des vacuoles hétérophagiques dans lesquelles se concentrent des hydrolases issues de lysososmes primaires voisins -Activité lysosomiale à pH=5 des enzymes différentes vacuoles auto et hétérophagiques : X 20 pdt climax - ex de la cathepsine (qui hvdrolyse expérimentalement caséine) et de la phosphatase acide (qui hydrolyse artificiellement paranitrophénylphosphate de Na). Attention : pas d'activité hydrolytique directement dans les fibres mais possibilité d'intervention d'enzymes extralysosomiales (actinase, myosinase) stimulée par Ca2+ et actif à pH neutre ou basique - Devenir du matériel protéique nécrosé (acides aminés et polypetides) : - récupérés par vaisseaux lymphatiques dans circulation générale - pris en charge par phagocytes lors de leur migration abdominale - participe à reconstruction des autres tissus (estomac, épithélium secondaire etc) : le tétard ne s'alimente plus pdt métamorphose - seul l'épiderme nécrosé desquame et est rejeté à l'extérieur Dernière modification : 18/04/17 19 b) Régression des branchies - Rappel : l'appareil respiratoire = branchie, poumon, peau - Diversité de modalités : - chez Protée et Necture par ex, pas de métamorphose donc branchies conservées - Les apodes et urodèles n'ont qu'une seule génération de branchies (3 en général) - Mise en place des branchies chez anoures : 2 générations de branchies externes - première génération de branchies : peu nombreuses (moins de 3) analogues à celles des urodèles = plumeuse, nées d'un bourgeon épiblastique latéral qui s'allonge puis développe digitations latérales = filaments branchiaux. vascularisation par arc branchial , très transitoire (au moment de l'éclosion) - recouvrement par repli operculaire ouvert par spiracle à gauche - dégénérescence de plus en plus rapide des branchies de première génération et construction des branchies de deuxième génération - branchies de deuxième génération : sur arcs branchiaux 1 à 4, une (arc 4) ou 2 (arc 1 à 3) rangées d'une dizaine de bourgeons dont l'axe = rachis porte ramifications qui portent filaments. Epithélium de recouvrement simple et aplati au niveau des capillaires - Dégénerescence par autolyse diffuse puis vacuoles autophagiques, corps résiduels, phagocytose puis vacuoles hétérophagiques. Les restes des filaments branchiaux obturent les fentes branchiales. Régression totale (ou participation à organes lymphomyeloïdes). 3- Remaniement de certains organes : circulatoire, locomoteur, nerveux, digestif a) Modifications du coeur et du système sanguin (artériel, veineux et Hb) - Le coeur est modifié très précocement et n'évolue pas à la métamorphose - Tube en S : sinus, atrium, ventricule et bulbe - Après l'éclosion : - atrium scindé en 2 oreillettes (droite en communication avec sinus et gauche qui reçoit veines pulmonaires) - ventricule ne se divise pas - bulbe partiellement divisé par valvule spirale communiquant : - avec arc V et VI pour la rampe dorsale - avec arcs III et IV pour rampe ventrale - le système artériel : - régression des artères branchiales afférentes et efférentes (comme artère ventrale avec dorsale directe par arc branchial) - Remaniement de la topographie des arcs branchiaux : - arc embryonnaire III (premier larvaire) : carotides - arc IV : crosses aortiques réunies en aorte dorsale - arc V : dégénère - arc VI : fermeture dorsalement du canal artériel de Botal (ligament fibreux) et forme tronc pulmocutané ventralement. - système veineux : fusion des veines latérales en veine ventrale; canaux de cuvier = veines caves antérieures - hémoglobines : chromato et électrophorèses montrent 5 Hb embryonnaires (a, b, c, d, e) qui s'amenuisent en général et donnent 4 Hb adultes (A, B, C, D) Dernière modification : 18/04/17 20 b) Modifications du squelette - Ossification colonne vertébrale (qui passe de 12 à 9 ou 10 plus urostyle, ossifié tardivement : en phase juvénile), ceintures pectorale et pelvienne (ossification commencée dès pré-métamorphose), membres et crâne - Os spongieux (des os longs) et os compact - Origine du calcium : concrétions d'aragonite sacs crayeux et endolymphatiques de l'oreille interne (qui s'étendent énormément à la métamorphose) accumulé par branchies (pour 70%), tégument (25%) et intestinal (5%) - contrôle hormonal de l'ossification : par thyroïde (injection accèlère ossification ) et corps ultimobranchiaux c) Maturation du système nerveux - Dans les centres : peu de modif ; augmentation de l'épaisseur de la paroi de l'encéphale et diminution de volume des cavités - Apparition, migration et différentiation de nouveaux neurones, dégénérescence d'autres (technique d'imprégnation à l'or ou détection d'enzymes exogènes migrant comme peroxydase du raifort) - Remodelage du cervelet en rapport avec coordination motrice et comportement prédateur (épaississement, cellules de Purkinje à forte arborisation et en couches périphériques) - Remodelage du toit optique et du thalamus suite à modification des capacités visuelles - croissance de la rétine par multiplication des neurones multipolaires de 10000 à 30000 et régression partielle des segments externes des bâtonnets, qui fait que la larve se cache immobile dans la vase) - acquisition de la vision binoculaire - hypothalamus présente sécrétion de neurohormones plus efficace - innervation des membres. L'amplitude des PA augmente pdt métamorphose et cessent d'être synchrones G/D lors de l'acquisition de la marche - myélinisation - Conséquences de cette maturation : affinement des systèmes sensoriels (audition : cavité tympanique, vision des couleurs, cavum olfactif donne bulbe olfactif, papilles gustatives ds la partie antérieure de la langue donnent papilles fongiformes puis bourgeons gustatifs sur surface dorsale de la langue) meilleure coordination, acquisition de comportement social (chant), aptitude au dressage; apparition du réflexe cornéen (influx sensitif nerf crânien trijumeau n°5, influx moteur sur muscle rétracteur nerf n°6) d) Diversification du Tube digestif et de ses annexes - Rappel : dents cornéennes et bec corné + fente branchiale en communication avec cavité branchiale + velum (= palais) - Oesophage + estomac + foie en deux lobes + pancréas bien délimité Ant + Post et assez volumineux - Dans la bouche : modif de la machoire (mastication) et agrandissement de la cavité qui acquière véritables dents (et apparition de glandes palatine et intermaxillaire) - réduction de pharynx et disparition de l'appareil filtrant - disparition de l'épithélium gastrique cilié pour devenir glandulaire - Raccourcissement et réduction de diamètre de l'intestin qui se déspiralise; dégénérescence de l'épithélium primaire (résidus dans la lumière du TD) et apparition d'un épithélium villeux secondaire (à partir d'îlots à forte activité mitogène) - hyperplasie du foie en début de métamorphose puis qq aires de nécrose et à nouveau dev en phase juvénile du foie - réduction de 80% en volume du pancréas par apoptose - BILAN : changement de mode alimentaire : de microphage (planton par courant d'eau et app filtrant) à insectivore ou carnivore. Pas de prise de nourriture pdt métamorphose Dernière modification : 18/04/17 21 4- Apparition de structures spécifiques de l'adulte : appareil respiratoire - septation chez Rana esculenta pdt formaton des membres - sinon, apparition tardive et septation continue chez l'adulte (surface X4 à X8 chez Rana) 5- Un processus encore mal connu : la régénération a) Evolution de la capacité de régénération - Chez les larves (anoures) et chez adulte aussi (urodèles) : capacité de régénérer un membre - Possible chez Xenope (régénération incomplète: membre en pointe et sans doigt) mais pas chez rainette, grenouilles ni crapaud b) Déroulement de la régénération - Apoptose des cellules osseuses et cartilagineuses - Migration des cellules épidermiques et formation d'une assise cellulaire protectrice - Dédifférentiation des cellules du derme, muscle, cartilage, mésenchyme en fibroblastes ou mésenchyme qui s'accumule en blastème de régénération c) Contrôle de la régénération - Patron modifié expérimentalement par acide rétinoïque qui commande homéogènes et CAM - Multiplication des cellules du blastème par facteur de croissance épidermique (EGF) puis formation du nouveau membre sous contrôle des cellules nerveuses (par Glial Growth Factor) - Mise en place d'abord des structures distales avec axe proximodistal puis régulation fine (pas d'organe surnuméraire) Dernière modification : 18/04/17 22 L’étude de la métamorphose conduit à : - identifier les principales transformations histologiques - et anatomiques - conduisant au plan d’organisation de l’adulte. Les caractéristiques de la métamorphose, perçue comme une transition écologique, ne s’inscrivent pas dans les objectifs de cette étude. Mécanismes d’histolyse, histogénèse et remaniement au cours de la métamorphose. L’étude de ces mécanismes est fondée autant que possible sur l’exploitation de données expérimentales. Les exemples retenus peuvent être choisis chez différents Vertébrés (Amphibiens, Oiseaux, Mammifères). Dernière modification : 18/04/17 23
