La Biotypie

La Biotypie
La biotypie est le typage d’une souche bactérienne à partir de ses caractères biochimiques. C’est la méthode la
plus couramment employée dans les laboratoires du monde entier. Elle est basée sur la culture de la bactérie sur
différents milieux permettant de lire un ou plusieurs caractères. Afin d’établir un profil biochimique de la
souche, on utilise une série de tests qui sont standardisés : la galerie d’identification.
Il existe des galeries d’identification pour tous les groupes bactériens et le nombre de tests varie d’une galerie a
l’autre ; On peut citer la galerie d’identification pour Entérobactéries, Staphylococcus, Streptococcus, etc…
Les galeries bichimiques sont basées sur la recherche de certains caractères (biochimique, enzymatique,
métabolique) et on peut classer les tests en trois grands groupes :
-
Les réactions de fermentation : Il y a métabolisation du substrat (souvent une grande quantité) afin
d’en tirer de l’énergie (souvent trés peu). Il s’agit, en général, d’hydrates de carbone, parfois des
peptones. On y inclut également les tests Urée et Nitrate.
-
Les réactions d’assimilation : C’est l’utilisation d’une molécule comme seule source de carbone. Le
test le plus fréquent est l’assimilation du citrate mais on peut utiliser n’importe quelle source de carbone
(en général les sucres  auxanogramme du carbone)
-
Les réactions de transformation : Dans ces tests, le substrat subit une petite modification au niveau
moléculaire sans production d’énergie (désamination, décarboxylation, hydrolyse …) Quelques tests
de ce type sont très régulièrement utilisés au laboratoire : Indol, Gélatine, TDA etc….
Traditionnellement, la galerie d’identification se présente sous forme d’une série de tubes :
Cependant, la forte croissance de la demande en analyses bactériologiques dans les années 1970-1980 a conduit
les fabricants à concevoir des outils d’identification mieux adaptés à la routine que les galeries de milieux
traditionnels. L’évolution du matériel proposé aux laboratoires a porté en premier lieu sur la miniaturisation.
C’est ainsi que sont nées les micro galeries d’identification de plusieurs fabricants. L’emploi d’une galerie
miniaturisée présente des avantages évidents :
-
étude systématique d’une série de caractères devenant une sorte de standard avec application de
règles taxonomiques numériques
-
encombrement réduit donc stockage facilité, gain de place à l’étuve ;
-
ensemencement plus rapide donc gain de temps ;
-
diminution sensible de la manutention car les besoins en verrerie stérile sont limités au strict
minimum, ce qui présente l’avantage de réduire le travail de préparation et de décontamination.
Les galeries les plus connues sont les galeries API© de chez Biomérieux® et ce sont les galeries que vous
utiliserez en travaux pratiques.
Le système de base se présente généralement sous la forme d’une plaque rectangulaire de vingt cupules. Ces
cupules en plastique ont une forme de sabot permettant de ménager une partie aérobie et une partie anaérobie.
Chaque cupule contient, sous forme déshydratée, des substrats et éventuellement un réactif permettant de révéler
l’activité recherchée. La nature des tests pratiqués dépend de la bactérie étudiée, les tests devant être les plus
discriminants possible. Au moment de l’ensemencement, les cupules sont réhydratées par la suspension en
milieu approprié de la bactérie.
Après incubation et ajouts d’éventuels réactifs, la lecture permet une identification « probabiliste » de l’espèce
bactérienne. Cette identification peut se faire par trois méthodes :
-
comparaison du profil biochimique avec des tables de références. Cette méthode, laborieuse, est
quasiment abandonnée…
-
Utilisation d’un système de « points » pour chaque caractère. Un caractère positif obtient un certain
nombre de points. Un test négatif obtient la note zéro. La somme des caractères, groupés par trois,
donne un code chiffré correspondant à une probabilité d’une espèce bactérienne. Prenons un
exemple :
l’utilisation du catalogue d’identification donne le résultat suivant : Salmonella sp. à 60.4%
-
L’encodage des résultats dans un logiciel d’identification automatique donnant l’espèce la plus
probable.
Vous utiliserez cette dernière méthode aux travaux pratiques.
Parmis les tests complémentaires important pour vos travaux pratiques, nous allons détailler les tests UREE ET
INDOL :
Le test de l'uréase
Par ce test, on voit si la bactérie étudiée possède ou non l'enzyme nécessaire à la dégradation de l'urée: l'uréase.
Cette dégradation peut se résumer à l'équation bilan suivante:
Il y a production de produits à caractère basique que l'on peut donc mettre en évidence par un indicateur de pH
(ici le rouge de phénol)
L'enzyme peut être exprimée de manière constitutive, c'est-à-dire présente dans la bactérie indépendamment de
celle de l'urée: la réaction sera donc très rapide (quelques minutes à 2 heures). Pour d'autres bactéries, la synthèse
est induite par l'urée et la révélation peut donc demander plus de temps (plusieurs heures).
Lecture et interprétation:
coloration orange donc pas d'alcalinisation du milieu donc l'urée n'a pas été hydrolysée : UREASE –
coloration rose fuschia donc il y a eu libération d'ammoniac due à l'hydrolyse de l'urée : UREASE +
Le test de l'indol
Le test de l'indol permet de mettre en évidence un complexe multienzymatique qui assure à la bactérie
l'hydrolyse du tryptophane: la tryptophanase.
Lors de cette réaction, il y a libération d'indol, d'acide pyruvique et d'ammoniac selon la réaction:
Or l'indol est un composé qui réagit avec le réactif de Kovaks (diméthyl-amino-4-benzaldhéhyde (DMAB)) pour
donner un composé rouge. On peut donc facilement le mettre en évidence.
Lecture et interprétation:
Le tube de gauche présente un anneau incolore: absence d'indol donc la souche ne possède pas la tryptophanase
(INDOL -)
Le tube de droite présente un anneau rouge: présence d'indol donc la souche possède la tryptophanase
(INDOL+)