CH1 : du génotype au phénotype introduction : Les individus sont i

CH1 : DU GENOTYPE AU PHENOTYPE
I N T R O D U C T I O N : Les individus sont identifiés par leurs caractères constituant le phénotype.
Or, si les individus d’une espèce ont même caryotype et même génome, ils sont toutefois tous différents.
Comment expliquer le phénotype d’un individu à partir de son équipement génétique et de l’environnement ?
Plan
I.
II.
III.
IV.
V.
NIVEAUX DE PHENOTYPE
SYNTHESE DES PROTEINES
PROTEINES ENZYMATIQUES
RELATION GENE - PROTEINE - ENVIRONNEMENT
CONCLUSION
I : LES NIVE AUX DE PHENOTYPES
plan
A.
PHENOTYPE MACROSCOPIQUE : 1 caractère (sens restreint) ou plusieurs caractères (sens large), accessibles a l’œil nu, d’un
individu.
Exemple mucoviscidose : bronches obstruées par du mucus, respiration diminuée, infections à répétition.
B.
PHENOTYPE CELLULAIRE (= MICROSCOPIQUE) : (la) les caractéristiques des cellules : fonctionnement, composition, forme.
Exemple mucoviscidose : les cils des cellules bronchiques n’évacuent pas le mucus visqueux. Les cellules immunitaires détruisent
les bactéries mais aussi les cellules bronchiques.
C.
PHENOTYPE MOLECULAIRE : Le phénotype cellulaire dépend du fonctionnement des protéines produites par les cellules.
Exemple Mucoviscidose : le dysfonctionnement de la protéine CFTR provoque la formation d’un mucus visqueux.
Le fonctionnement d’une protéine dépend de sa forme : Suivant sa forme (canal, corbeille, bosse…), une protéine peut modifier
d’autres molécules (déplacer, lier, couper…)
Exemple Mucoviscidose : la protéine CFTR forme un canal dans la membrane cellulaire ; s’il est déformé, il ne permet plus le
passage du chlore nécessaire à la fluidité du mucus.
1. La forme d’une protéine dépend de sa séquence d’acides aminés : Une protéine est une chaîne d’acides aminés se repliant sur
elle-même. Ces replis donnent le volume à la molécule (canal, corbeille, bosses…), appelé structure spatiale. La modification d’un
acide aminé modifie cette structure : 2 séquences différentes provoquent 2 repliements différents aboutissant à 2 activités
moléculaires différentes
Exemple Mucoviscidose : protéine CFTR = 1480 AA ; la perte de l’acide aminé PHE en position 508 provoque la déformation de la
protéine et l’obstruction du canal.
Les acides aminés hydrophobes de la protéine CFTR s’intègrent dans la membrane ; leur repliement en forme de canal permet le
passage du chlore entre le cytoplasme et le milieu extracellulaire. Le changement d’un acide aminé dans cette portion de molécule
empêche la bonne intégration de la protéine dans la membrane et provoque la maladie.
Milieu extracellulaire = zone d’eau
acides aminés hydrophile
Membrane = zone de lipide
acides aminés hydrophobes attirés
Milieu intracellulaire = zone d’eau
acides aminés hydrophile
canal membranaire
Cette succession déterminée par le nombre et la position des acides aminés est appelée séquence d’acides aminés.
Position :
AA :
1°
2°
TRY
PHE
3°
4°
5°
GLU
ALA
THR
6°
7°
ARG
MET
8° …
etc … : séquence d’A
SER
Il existe 20 acides aminés différents, chacun possédant une fonction acide (COOH), une fonction amine (NH2) et une partie variable
(parmi 20 possibles) : 2 acides aminés successifs peuvent se lier par une liaison peptide, associant la fonction amine de l’un et la
fonction acide de l’autre. (Immense diversité : pour des chaînes de 100 AA : 20100 possibilités = 10120 protéines différentes)
Radical
COOH : fonction acide
AA1
Liaison peptide entre 2 AA
R
AA2
NH2 : fonction amine
CARACTERE
MACROSCOPIQUE
CARACTERE CELLULAIRE
CARACTERE MOLECULAIRE
Bronche dégagée
Les cils évacuent le mucus car La séquence des 1500 AA permet le bon fonctionnement de la protéine CFTR
il est fluide
Le passage de chlore par le canal membranaire rend le mucus fluide.
Bronche obstruée
Les cils n’évacuent pas le
mucus car il est visqueux
Le changement de l’acide aminé 508 déforme le canal de la protéine CFTR, ce
qui empêche le passage du chlore et rend le mucus visqueux.
L’obstruction des bronches dépend
de la viscosité du mucus
La viscosité du mucus dépend du fonctionnement du canal chlore
résultant de la séquence d’acides aminés de la protéine CFTR
Animation et exercice en ligne sur la drépanocytose : http://www.ac-nice.fr/svt/productions/2ao/drepano/bd/lirebd.htm
BILAN : Le phénotype se définit aux niveaux des organes, des cellules et des molécules ; il dépend de la séquence d’acides
aminés constituant la structure de la protéine.
II : SYNTHESE DES PROTEINES
plan
On sait que l’insertion d’un gène supplémentaire lors d’une transgénèse, provoque l’apparition d’une protéine supplémentaire dans la
cellule et d’une nouvelle fonction cellulaire.
Quel rapport existe-t-il entre les gènes et les protéines ? Comment une protéine se construit-elle ? Quel est le rôle des gènes ?
A.
RELATION GÈNE / PROTÉINE
1.
Ressemblance gène/protéine : Les deux molécules sont des macromolécules séquencées
Macromolécules : molécules composées d’un très grand nombre unités moléculaires.
Séquencées = formées d’une succession ordonnée d’unités moléculaires.
Leur ressemblance de composition laisse penser à une même origine ou à lien dans leur formation.
2.
Différence gène/protéine : Leurs unités diffèrent : 4 nucléotides (A, T, C, G) pour l’ADN, 20 acides aminés (Alanine, Acide
Glutamique, Valine, Leucine…) pour les protéines.
Leur localisation diffère : noyau pour l’ADN et cytoplasme pour les protéines.
Les mécanismes de fabrication des protéines doivent tenir compte de ces compositions et localisations différentes.
B.
TRANSCRIPTION DE L’ADN EN ARNm
Les analyses montrent que le noyau produit un autre acide nucléique : l’ARNm, représentant une copie d’un gène.
La transcription est la formation d’ARNm dans le noyau à partir d’un gène
1)
2)






Caractéristiques ARNm : il est formé d’un seul brin (= chaîne) de nucléotides
se compose de 4 nucléotides différents : C, G, A, U. U à la place de T dans l’ADN
le sucre des nucléotides est le ribose, au lieu du désoxyribose de l’ADN
son information génétique est sa séquence de nucléotides comme pour l’ADN.
la chaîne d’ARNm est courte (l’ADN est très long) et sa vie brève (minute)
Mécanisme de transcription
L’ARNp (ARN-polymérase, enzyme du noyau) se fixe sur l’ADN, au niveau d’une séquence « signal de début ».
Elle sépare les deux brins d’ADN, associe les ribonucléotides libres du noyau en complémentarité avec ceux de l’ADN, dans
l’ordre imposé par la séquence du brin transcrit, puis relie ces ribonucléotides entre eux.
L’ARNp se déplace en sens unique sur l’ADN, jusqu’à la séquence « signal de fin » du brin transcrit.
Plusieurs ARNp se succèdent rapidement sur le même brin transcrit : donc plusieurs ARNm se construisent successivement sur la
même séquence (chromosome en écouvillon).
Grâce à la complémentarité des nucléotides (A/U, T/A, C/G, G/C), grâce aux séquences d’ADN de début et de fin de
transcription et grâce au déplacement en sens unique de l’ARNp, une séquence d’ADN n’est traduite que par une seule
séquence d’ARNm. La séquence d’ARNm équivaut à la séquence du brin non transcrit, l’Uracyle remplaçant la Thymine.
Une fois libérés dans le nucléoplasme, les ARNm traversent la membrane nucléaire par les pores nucléaires et rejoignent le
cytoplasme.
Animation sur la transcription
Bilan : la transcription permet la fabrication d’ARNm, « copie de l’information génétique », dans le noyau. Cette séquence de
ribonucléotides passe dans le cytoplasme où elle est traduite en séquence d’acides aminés composant la protéine.
C.
1)
2)
LE CODE GENETIQUE
La correspondance entre ARNm et acides aminés : 3 nucléotides successifs de l’ARNm forment un codon associé à 1 acide
aminé. (Ex : AUG correspond à méthionine). Chacun des 64 codons possibles (4x4x4) ne correspond qu’à un seul des 20 acides
aminés.
La séquence génétique d’ARNm détermine la séquence d’acides aminés de la protéine qui en dépend.
Caractéristiques du code :
●

Il est univoque : chaque triplet ne désigne qu’un seul acide aminé.
3 codons stop signifient l’arrêt de l’assemblage des acides aminés.
 Il est redondant : plusieurs triplets différents peuvent désigner le même AA.
 Il est universel : il est le même pour tous les êtres vivants.
Animation sur le code génétique à télécharger
D.
TRADUCTION DE L’ARNm EN PROTEINE
1)
Lieu de traduction : les ARNm sortent par les pores nucléaires ; la traduction s’effectue dans le cytoplasme
2)
Acteurs de la traduction :
 les molécules d’ARNm libres dans le cytoplasme ;
 les acides aminés fixés sur des adaptateurs munis de nucléotides capables se fixer sur un triplet d’ARNm.
 des ribosomes, molécules creusées de 2 cavités, pouvant adhérer à l’ARNm et assembler 2 acides aminés.
3)
Etapes du mécanisme de traduction



Initiation : le ribosome se fixe sur une séquence signal de l’ARNm ; l’adaptateur de méthionine transportant son acide aminé
méthionine, se fixe sur le codon initiateur (AUG) et se place dans la 1° cavité du ribosome.
Elongation : l’adaptateur du 2° acide aminé se place sur le 2° codon de l’ARNm ; l’acide aminé qu’il porte se place dans la 2°
cavité du ribosome. Le ribosome stimule la liaison peptide entre la méthionine et le 2° acide aminé puis il se déplace sur le codon
suivant (2° et 3° codons), assemble les 2° et 3° acides aminés…etc…
Terminaison : le passage du ribosome sur un codon stop provoque sa dissociation et l’arrêt de la traduction. La chaîne d’acide
aminé est libérée dans le cytoplasme. La méthionine, 1° acide aminé est coupée de la chaine ; la protéine se replie selon sa
séquence et prend sa configuration spatiale.
Grâce aux signaux de début et de fin sur l’ARNm, grâce au déplacement sens unique du ribosome et grâce au code génétique univoque,
une séquence d’ARNm n’est traduite qu’en une seule séquence d’acides aminés. En conséquence, la protéine synthétisée exprime
fidèlement le gène présent dans le noyau.
Plusieurs ribosomes se fixent et traduisent successivement une molécule d’ARNm (polysomes) : chaque ARNm est donc traduit un
grand nombre de fois en protéine : un gène permet la synthèse d’un grand nombre de protéines.
Animation sur la synthèse des protéines
E.
DEVENIR DES PROTEINES SYNTHETISEES
1)
Protéines cytoplasmiques : Elles sont fabriquées directement dans le hyaloplasme ; elles y restent.
2)
Protéines exportées : le REG (Réticulum Endoplasmique Granaire), réseau de tubules membranaires du cytoplasme, reçoit les
protéines libérées par les ribosomes. Par l’intermédiaire de vésicules, les protéines migrent dans l’appareil de Golgi où elles sont
transformées (sucrées, maturées). Par l’intermédiaire de vésicules de sécrétion qui fusionnent avec la membrane
cytoplasmique, les protéines sont sécrétées (insuline) ou fixées en membrane (canal CFTR).
BILAN : L’ARNp transcrit l’information génétique de l’ADN en ARNm, qui migre dans le cytoplasme. Le ribosome fabrique la
séquence d’acides aminés à partir de la séquence de codons d’ARNm, en suivant la correspondance donnée par le code
génétique. 1 gène = 1 séquence de nucléotides d’un brin d’ADN, détermine 1 ARNm, 1 séquence d’acides aminé et 1 protéine
fonctionnelle. Une protéine exprime le gène dans le cytoplasme et permet la réalisation du phénotype moléculaire.
Images des organites de la cellule animale : http://www.ccdmd.qc.ca/ri/cellule/#
Site du CNRS sur les images de la cellule : http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/doscel/accueil2.htm
Comparaison cellule animale et végétale http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/AnVeg/CellAnCellVeg2.html
Retour
III : LES PROTEINES ENZYMATIQUES CONTRIBUENT A L’EXPRESSION DU PHENOTYPE
Les protéines sont représentées essentiellement par les enzymes. Qu’est-ce qu’une enzyme, comment agit-elle ?
A.
L’ENZYME EST UN BIOCATALYSEUR
Catalyseur : molécule accélérant la vitesse d’une réaction chimique sans y participer, agissant à faible dose.
Biocatalyseur : catalyseur protéique produit par les cellules, effectuant des réactions de synthèse (soudure), d’hydrolyse (cassure), de
changement de forme.
EXEMPLE : ENZYME DES GROUPES SANGUINS ABO :
Chaque groupe sanguin est caractérisé par des hématies possédant une molécule membranaire appelée marqueur. Groupe A avec
hématies ayant le marqueur A ; groupe B avec marqueur B ; groupe O avec hématies ayant le marqueur H ou pas de marqueur.
La présence de marqueurs résulte de l’activité d’enzymes cytoplasmiques : L’enzyme 1 relie précurseur et fucose en marqueur H ;
l’enzyme 2A relie H et acétyl en marqueur A ; l’enzyme 2B relie H et galactose en marqueur B.
B.
DOUBLE SPECIFICITE DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE
1.
Spécificité de substrat : elle ne transforme qu’une seule molécule, (nommée substrat).
Enzyme et substrat s’associent temporairement en un ensemble appelé complexe enzyme-substrat (E-S).
Spécificité d’action : le substrat n’est transformé qu’en un seul produit
Une fois associée au substrat, l’enzyme le transforme. Cette transformation du substrat s’effectue par une autre région moléculaire
de l’enzyme appelée site catalytique.
Site de fixation et site catalytique constituent le SITE D’ACTION de l’enzyme.
2.
Complexe enzyme substrat
Acides aminés catalytiques,
transforment le substrat en produits
SUBSTRAT
Liaisons faibles
Acides aminés de reconnaissance,
fixent le substrat
retour
Liaisons faibles
Acides aminés de reconnaissance,
fixent le substrat
ENZYME
3.
Double spécificité conséquence de la séquence d’acides aminés :
retour
La double spécificité du site d’action dépend de la structure spatiale de chaque site, fixation et catalytique. Cette structure spatiale
résulte de la séquence d’acides aminés composant la protéine enzymatique.
Site de reconnaissance
Substrat
Site catalytique
ENZYME
COMPLEXE ENZYME SUBSTRAT
Si une mutation provoque un changement dans la séquence d’acides aminés, la forme du site actif et son fonctionnement sont
aussi modifiés.
C.
MODIFICATION DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE PAR L’ENVIRONNEMENT
retour
Suivant les paramètres physico-chimiques du milieu, l’activité enzymatique se modifie :

Si la température du milieu augmente, l’agitation moléculaire augmente, la formation des complexe ES augmente, la
transformation de S en P augmente. En milieu froid

Si la température du milieu est trop forte, l’agitation moléculaire casse le site actif : il ne fonctionne plus.

Si le PH du milieu augmente, les ions H+ abondants modifient la forme du site actif : Il fonctionne plus.

Si composition du milieu change, certaines molécules peuvent casser le site ou s’y fixer, empêchant la formation du complexe ES.

L’activité enzymatique est maximum (à vitesse maximum : Vmax) lorsque les conditions de température, de PH et de
composition chimique, sont optimales.
BILAN : une enzyme est un biocatalyseur possédant un site actif à double spécificité, de substrat et d’action, découlant sa
séquence d’acides aminés. L’activité enzymatique est modifiée par les paramètres du milieu ou les mutations des gènes.
Remarque : Chaque cellule possède un équipement enzymatique particulier qui lui procure une activité particulière. (4.000 enzymes
différentes par cellule). Les variations d’équipement enzymatique sont à l’origine des variations de fonctionnement entre les cellules, les
organes, les individus, les espèces.
Noyau
Enzymes, gène et phénotype
Cellule
Gène 1
Gène 2 et gène 3
Chaîne d’acides aminés 3
Chaîne d’acides aminés 1
Cytoplasme
Chaîne d’acides aminés 2
Enzyme3
Enzyme 1
Enzyme 2
IV : RELATIONS GENE / PROTEINE / ENVIRONNEMENT
Enzyme modifiée
non fonctionnelle
retour
Le phénotype repose sur les protéines synthétisées à partir des gènes. Or les êtres vivants sont bialléliques, le phénotype peut résulter
de plusieurs protéines, et l’environnement peut modifier l’activité
des protéines.
Activité
Comment génotype et milieu contribuent-ils à déterminer cellulaire
le phénotype ?
A.
CONSEQUENCES DU BIALLELISME SUR LE PHENOTYPE
1. Génotype et phénotype d’un individu
Le noyau de chaque individu contient des paires de chromosomes (maternels et paternels) : les gènes présents sur chaque paire de
chromosome sont en 2 exemplaires : pour chaque gène, il existe donc 2 allèles par cellule.
(Allèle = 1 version d’un gène, marquée par un ou quelques nucléotides différents dans la séquence).
Dans chaque cellule, chaque gène porte 2 allèles différentes ou identiques :
 Gène homozygote = 2 allèles identiques : génotype (A1//A1) ; phénotype [A1]
Chromatide
Chromatide
Centromère
Chromosome maternel
Chromosome paternel
A
(Locus
= lieu,
Locus
du position)
gène G
A
A
A
 Gène hétérozygote = 2 allèles différents : génotype (A1//A2) ; phénotype : [A1, A2]
Chromosome maternel
Chromosome paternel
Chromatide
Chromatide
Centromère
A
A
Locus du gène G
B
B
2. Dominance ou codominance des allèles dans une cellule
Dans un cytoplasme, les 2 allèles s’expriment par 2 protéines. Suivant les allèles, les protéines fonctionnent correctement ou pas. Le
fonctionnement global de la cellule dépend du fonctionnement des protéines fabriquées.
Dans le cas d’un gène hétérozygote, le fonctionnement d’une protéine peut masquer le fonctionnement de l’autre :
 L’allèle dominant est celui qui fabrique la protéine fonctionnelle, contribuant à établir le phénotype.
 L’allèle récessif est celui qui fabrique une protéine dont la présence est masquée par la protéine fonctionnelle.
 Si les 2 allèles fabriquent des protéines fonctionnant ensemble dans la cellule et participant mutuellement au phénotype, elles sont
dites co-dominantes.
B.
PLUSIEURS GENOTYPES POUR 1 MEME PHENOTYPE
1)
Si les caractères sont monogéniques (caractère dépendant d’un seul gène)
Le phénotype dominant résulte de génotype homozygote dominant ou du génotype hétérozygote.
Le phénotype récessif ne peut résulter que du génotype homozygote récessif.
Exemple mucoviscidose : Phénotype sain pour les génotypes homozygote dominant : (CFTR+//CFTR+) et hétérozygote :
(CFTR+//CFTR-). Phénotype malade pour le génotype homozygote récessif : (CFTR-//CFTR-).
2) Si les caractères sont polygéniques (caractères dépendant de plusieurs gènes)
Plusieurs protéines successives (enzymes, hormones / récepteur) afin que le phénotype moléculaire se réalise.
retour
A chaque étape de la chaîne métabolique, chaque gène peut être homozygote récessif, homozygote dominant, hétérozygote :
 Plusieurs génotypes sont possibles pour le phénotype fonctionnel, à partir des génotypes homozygotes dominants et des
génotypes hétérozygotes.
 Plusieurs génotypes sont possibles pour le phénotype non fonctionnel, car si une seule des étapes ne s’effectue pas, le
caractère ne se réalise pas.
Exemple sur les yeux de drosophile, voir livre et TP 1.6
C.
INFLUENCE DU MILIEU SUR LE PHENOTYPE :
retour
EXEMPLE :
Variation du nombre de facettes des yeux de la drosophile en fonction de la température d’élevage des larves
Nb de facettes
1000
Sauvage
600
500
400
300
Infra bar
200
100
Ultra bar
T°C d’élevage des larves
15
20
25
30
1.
Le milieu modifie l’activité des protéines
 T°, PH et molécules de l’environnement peuvent favoriser la formation du complexe ES et l’activité enzymatique ou bien modifier
la forme du site actif voire le casser.
 Le milieu peut aussi corriger l’effet néfaste des protéines non fonctionnelles, soit grâce aux protections mises en place (ex : filtre à
UV), soit en atténuant les conséquences des dysfonctionnements (ex : massage des poumons)
2.
Le milieu modifie l’expression des gènes
retour
Dans une cellule d’organe spécialisée, seuls quelques-gènes sont actifs :
 Le milieu peut activer la transcription et la traduction de certains gènes : (Ex : synthèse de chlorophylle à la lumière – couleur
verte et non blanche)
 Le milieu peut freiner la transcription et la traduction de certains gènes (Ex : en excès d’adénine, la synthèse du premier enzyme
de la chaine métabolique est bloquée).
3.
Le milieu modifie l’ADN d’un gène
Les agents mutagènes : (UV, X, oxydant) modifient un ou quelques nucléotides de la séquence d’un gène qui peut devenir non
fonctionnel.
4.
Les mutations peuvent se transmettre
Si la mutation touche des cellules somatiques (= non sexuelles), elle n’est pas transmissible à la descendance.
Si la mutation touche des cellules germinales (= ovule ou spermatozoïdes), elle est transmissible à la descendance.
Retour
Poumon
Gène muté
Protéine
modifiée
Protéine P53 modifiée
Agent
mutagène
p53
p53
ch.17
ch.17
Sur le chromosome 17, le gène p53 code pour une
protéine qui inhibe le processus de cancérisation ; il est qualifié d’antioncogène. A
l’origine du cancer du poumon, le tabac provoque une mutation de ce gène, entraînant la formation d’une protéine inefficace.
D.
Cellule
du MALADIE
poumon
PREDISPOSITION GENETIQUE
A UNE
:
retour
Une prédisposition génétique est la possession d’allèle rendant sensible aux effets de l’environnement pouvant déclencher la
maladie :
 Avec 1 allèle non fonctionnel, le risque de développer la maladie est faible, car l’autre allèle assure la fonction cellulaire.
 Avec un allèle non fonctionnel, le risque de déclencher la maladie augmente si le 2° allèle est muté et devient non fonctionnel.
 Avec 2 allèles non fonctionnels, le risque de développer la maladie est fort, car la fonction cellulaire n’est pas assurée et
l’environnement déclenche la maladie.
(EX : Xéroderma pigmentosum, risque de fort de taches brunes avec UV)
Toutefois, la prédisposition n’est pas la maladie :
 l’organisme peut se protéger de l’environnement.
 L’absence de prédisposition ne signifie pas l’absence de maladie :
 le milieu à lui seul peut déclencher la maladie.
BILAN : La diversité des génotypes est à l’origine de la diversité des phénotypes, car chaque individu porte deux allèles et les
gènes sont multi-alléliques. Un même phénotype est déterminé par plusieurs génotypes car les gènes sont hétérozygotes ou
homozygotes et un même caractère dépend en général d’une voie métabolique. Le milieu modifie la séquence génétique,
l’expression du gène, ou l’activité des protéines. La prédisposition génétique rend plus sensible à l’environnement et augmente
le risque de maladie.
CONCLUSION
retour
La diversité des phénotypes provient de la diversité des sites actifs des protéines, résultant de la diversité des séquences AA.
Les phénotypes alternatifs entre les individus viennent des petites variations de la protéine.
L’information génétique écrite en séquence de nucléotides, est transcrite en ARNm, puis traduite en protéine au niveau des
ribosomes du cytoplasme pour l’utilisation cellulaire, ou bien au REG pour l’exportation.
Une protéine exprime une information génétique grâce à la complémentarité des nucléotides ADN/ARN et grâce aux codons
univoques par acide aminé.
Les protéines enzymatiques se fixent sur leur substrat et le transforme en produit spécifique, mais modifient leur action
suivant la température, le PH, et les molécules environnantes.
La complexité de la détermination du phénotype résulte de la biallélie, de l’existence de voies métaboliques et de l’influence du
milieu sur l’activité des gènes ou des protéines.
Un gène est un ensemble d’allèles, fragments d’ADN, déterminant la synthèse d’un type d’ARNm et d’un type de protéine,
fonctionnelle ou non, à l’origine d’une transformation moléculaire spécifique dans une voie métabolique.