Colorations usuelles en bactériologie

Colorations usuelles en bactériologie
par Françoise Baledent
Biologiste, Centre hospitalier Robert-Ballanger, Aulnay-sous-Bois.
Le diagnostic bactériologique d'une infection repose sur la mise en évidence et
l'identification du ou des germes responsables.
Plusieurs étapes sont nécessaires pour aboutir à ce diagnostic :
 L'examen direct à l'état frais et après coloration. Cet examen représente une
étape fondamentale puisqu'elle conditionne la suite de l'examen bactériologique.
 La mise en culture, le choix des milieux étant orienté par le résultat de l'examen
direct.
 L'isolement et identification des colonies (coloration, étude des caractères
biochimiques ... ).
L'identification des germes permet alors de choisir les antibiotiques à étudier.
L'étude de la sensibilité aux antibiotiques permet en effet d'adapter au mieux le
traitement.
Les techniques de coloration sont utilisées pour l'examen direct des produits
pathologiques puis pour l'identification des colonies obtenues après mise en culture
de ces produits pathologiques.
La réalisation de frottis de bonne qualité est une condition préalable à toute
coloration.
1. Réalisation des frottis
Ils doivent être réalisés le plus rapidement possible après le prélèvement.
Les frottis doivent être étalés en couche mince et régulière, puis séchés et fixés.
1.1. Etalement
Les lames doivent être parfaitement propres et dégraissées.
Étalement à partir de produits pathologiques
On utilise, selon les cas :
- un écouvillon (figure n° 1) ;
- une pipette ;

- ou une anse de platine (fil de métal fixé à un porte-fil et ayant la forme d'une
boucle d'environ 2 millimètres de diamètre). Dans ce cas, le fil doit être chauffé au
rouge sur une flamme (figure n° 2), puis parfaitement refroidi avant le prélèvement.
L'étalement doit être aussi mince que possible : la dilution des produits épais peut
parfois s'avérer nécessaire.
- Lorsqu'il s'agit d'un liquide (urines, ascite, liquide pleural ... ), on effectue les frottis à
partir de culots de centrifugation.
Étalement à partir de milieux de culture
On étale les gouttes de suspension bactérienne en un film mince et régulier :
- soit par un mouvement régulier et circulaire à l'aide d'une anse de platine, en
décrivant des spirales partant du centre vers l'extérieur, pour obtenir un étalement de
2 à 3 cm de diamètre (figure n° 3) ;
- soit en tirant de façon uniforme l'effilure d'une pipette Pasteur (figure n° 4).
2. Séchage
Le séchage de la lame doit se faire autant que possible à la température du
laboratoire.
- Il peut éventuellement s'effectuer en posant la lame sur une platine chauffante
réglée à 37°, ou en la maintenant dans l'air chaud au-dessus de la veilleuse d'un bec
Bunsen (figure n° 5).

- Il faut éviter un séchage trop brutal, à une température trop élevée (altération de
certains constituants, en particulier la paroi bactérienne).
3. Fixation de la préparation
La fixation doit s'effectuer sur une préparation sèche.
Plusieurs méthodes peuvent être utilisées :
Fixation par l'alcool flambé
C'est la technique la plus utilisée mais elle doit être réservée aux cultures
bactériennes. Il est prudent de mettre au préalable de l'eau au fond de la cuve de
coloration.
Recouvrir la lame d'alcool à 95°, laisser quelques secondes de contact, égoutter,
puis enflammer l'alcool restant. Laisser refroidir.
Fixation par la chaleur
Cette technique est également réservée aux cultures bactériennes.
La lame séchée, frottis sur le dessus, tenue par une pince, est passée dans une
flamme. Le geste doit être lent et la lame doit écraser 3 ou 4 fois la flamme (figure n°
6).
Fixation à l'alcool
Ce procédé de fixation peut être employé quel que soit le produit traité.
On peut utiliser :
- l'alcool méthylique absolu (recommandé pour les produits pathologiques),
- l'alcool éthylique absolu ou à 95°,
- ou l'alcool-éther (mélange à parties égales).
Les préparations chargées en graisses pourront être lavées au xylol avant d'être
colorées. Ce traitement doit être précédé et suivi de rinçages à l'alcool.
Quelle que soit la technique de fixation employée, la lame doit être rincée à l'eau
distillée, égouttée et séchée avant d'être colorée.

II. Colorations usuelles
La coloration la plus informative est la coloration de Gram. Dans le cas ou les
réactifs nécessaires ne seraient pas disponibles, une coloration au bleu de
méthylène peut apporter des informations concernant la morphologie des germes.
Coloration au bleu de méthylène
Préparation du bleu phéniqué (de " Kühne ")
Dans un mortier, broyer et mélanger :
- bleu de méthylène
(pour microbiologie) 20 g
- acide phénique 20 g

- alcool à 95° 100 ml
Reprendre par 100 à 200 ml d'eau distillée :
- laisser reposer 24 heures,
- compléter à 1 000 ml,
- filtrer,
- conserver en flacon bouché,
- filtrer à nouveau avant l'emploi.
Technique de coloration
Sur le frottis fixé et refroidi :
- Faire couler la solution de bleu de méthylène phéniqué jusqu'à ce que toute la lame
soit recouverte.
- Laisser agir 1 minute.
- Rincer abondamment la lame avec le jet d'une pissette d'eau distillée, ou à l'eau du
robinet jusqu'à élimination des colorants en excès.
- Sécher à l'air ou sur une platine chauffante, ou encore sécher délicatement entre
deux feuilles de papier filtre fin (ou buvard), sans frotter.
- Examiner au microscope, objectif à immersion.
Résultats
Les bactéries sont colorées en bleu sombre.
Cette coloration est intéressante pour l'observation rapide des frottis mais elle permet
seulement l'étude de la morphologie des bactéries.
Il est donc souvent nécessaire de la compléter par une coloration de Gram, que l'on
peut compléter par une coloration de May-Grünwald-Giemsa pour la reconnaissance
des éléments cellulaires.
Coloration de Gram
C'est la coloration de base en bactériologie.
Cette coloration permet de différencier les bactéries selon deux critères :
- leur forme,
- leur affinité pour les colorants.
Principe :
- les bactéries sont imprégnées par une première solution colorante, le violet de
gentiane,
- puis elles sont fixées par un mordant, la solution de Lugol (solution d'iode dans
l'iodure de potassium).
On fait ensuite agir un décolorant (alcool le plus souvent).
Suivant la composition de leur paroi :