Génétique – Dr Vinciguerra 11/04/2008 Dahlem - Deau Bases moléculaires des hémophilies I. L'hémophilie A. Définitions B. Traitement C. Complications II. Apports de la génétique A. Gène du facteur VIII 1) Inversion de l'intron 22 2) Inversion de l'intron 1 3) Mutations dans le gène du facteur VIII B. Gène du facteur IX C. Cas particuliers 1) Hémophilie B Leyden 2) Hémophilies féminines 3) Diagnostic prénatal Conclusion Annexes : les diapos du cours On a eu directement la version papier, donc non modifiable. Ce cours contient les commentaires faits par la prof, mais l'essentiel se trouve dans les diapos, à lire en parallèle donc. 1 Génétique – Dr Vinciguerra 11/04/2008 I. Dahlem - Deau L'hémophilie Diapos 1 à 4 A. Définitions Diapos 1 et 2 Déficit en facteur VIII : hémophilie A Déficit en facteur IX : hémophilie B En France il y a 5000 hémophiles environ, et l'hémophilie concerne une naissance masculine sur 5000. Les hémophilies A et B sont aussi graves l'une que l'autre, et en principe seuls les garçons sont atteints (transmission liée au chromosome X). Pour les formes sévères, les simples gestes de la vie quotidienne peuvent provoquer des hémorragies spontanées, très souvent au niveau des articulations (hémarthroses). Il n'y a pas de différences au niveau de la pénétrance, dans un famille la gravité est identique pour tous les sujets atteints. B. Traitements Diapo 3 Le traitement consiste à injecter des concentrés du facteur de coagulation manquant, ces concentrés ont une demi vie de 8 à 12h et sont d'origine plasmatique , ou issus du génie génétique. Ce traitement est efficace mais il existe des complications. C. Complications Diapo 4 Lors du scandale du sang contaminé, 75% des hémophiles de la région parisienne ont été contaminés par le VIH, et les rares qui avaient été épargnés sont quasiment tous atteints d'une hépatite C… De plus le traitement peut provoquer des résistances, surtout chez les hémophiles sévères qui développent des anticorps contre le facteur de coagulation, qui si ils sont nombreux peuvent rendre le traitement inefficace. A terme il faudrait pouvoir identifier les patients qui ont un risque élevé de développer cette résistance. II. Apports de la génétique Diapos 5 à 30 Le phénomène de lyonisation (inactivation aléatoire d'un ces deux X) peut rendre difficile l'identification des conductrices, en effet certaines peuvent avoir des taux très bas de facteur de coagulation (2 à 3% seulement, comme les formes sévères d'hémophilies), mais aussi dans d'autres cas des taux très hauts, quasi normaux (90%). Approche indirecte (diapos 6 et 7) : L'approche indirecte était infaisable jusque récemment car le séquençage état impossible, elle sera vue plus bas. Pour l'approche indirecte, on recherche l'haplotype (=profil établi à partir de plusieurs polymorphismes, en fonctions des allèles du sujet) lié à la maladie, mais il existe des risques de recombinaison surtout si les polymorphismes sont éloignés du gène. Dans l'exemple présenté, la sœur III2. du sujet hémophile III1. est enceinte, et souhaiterait connaître les risques pour son futur enfant. "Ab" est l'haplotype lié à la maladie, il a été transmis par le grand père I1. Ici on peut dire que la femme enceinte n'est pas conductrice. Mais le cas de la tante II4. est plus compliqué, on dit qu'il n'est pas informatif. On sait qu'elle est conductrice, mais on ne sait pas quel "Ab" vient du père I1. 2 Génétique – Dr Vinciguerra 11/04/2008 Dahlem - Deau A. Gène du facteur VIII (Approche directe) Diapos 8 à 22 Il s'agit d'un gène énorme, de 3000pb, la protéine est donc très longue. (retenir que le gène est très long). L'exon 14 en particulier contient beaucoup de mutations. Dans l'approche indirecte on utilise quatre polymorphismes intragéniques et deux extragéniques, mais seuls 70% des cas peuvent être renseignés, les autres ne sont pas informatifs. De plus même si le cas est informatif, il existe un risque d'erreur non négligeable au moment de donner un conseil génétique: 3 à 5% ! 1) Inversion de l'intron 22 Diapos 11 à 19 En 1993 on a découvert le phénomène d'inversion de l'intron 22. En utilisant une technique de criblage on trouvait des mutations dans 90% des cas, mais chez les hémophiles sévères on ne trouvait un mutation que dans 50% des cas. On a donc étudié les transcrits du gène du facteur VIII, assez difficile quand on les trouve principalement au niveau du foie et qu'il faut faire une biopsie chez un hémophile… On a découvert qu'en utilisant des primers dans la région de jonction des exons 22 et 23 l'amplification était impossible. On a alors trouvé un gène dans l'intron 22: FVIII A qui code dans l'autre sens, et possède une copie située au niveau de chacun des télomères. Quand le chromosome se replie sur lui-même on peut avoir une recombinaison de la région des exons 1 à 22 qui se retrouve sur le télomère, tandis que les exons 23 à 26 restent en place. La transcrit n'est donc plus continu, et il n'y a plus de facteur VIII. Ce phénomène est appelé inversion de l'intron 22. Ceci explique les cas d'hémophilie sporadique, en effet 20% des hémophiles n'ont pas d'antécédents familiaux. Avec le Southern blot, on observe pour la conductrice un dédoublement des bandes, 6 au lieu de 3, mais avec toujours la même quantité d'ADN. 2) Inversion de l'intron 1 Diapos 20 et 21 Le mécanisme ressemble à celui de l'intron 22: la séquence Int1h-1 code dans le même sens que le facteur VIII, et la séquence Int1h-2 code dans le sens inverse un peu plus loin. 3) Mutations dans le gène du facteur VIII Diapo 22 décalé. "Small deletion" = moins de 50 pb, la protéine est tronquée ou le cadre de lecture est On a 4% de délétions de grande taille, 12,7% de faux sens. "Splice" = épissage Pour les 2 à 3% de cas pour lesquels on ne trouve rien, on réessaye l'analyse indirecte. Dans le cas de mutations faux sens nouvelles il est très difficile de savoir si la mutation est effectivement responsable de la maladie. B. Gène du facteur IX Diapos 23 à 25 C'est un gène plutôt court (35 kb), situé sur le chromosome X, et il est mieux connu que le gène du facteur VIII (parce qu'il est plus petit). Avec les polymorphismes on obtient 80% d'informativité, donc avec la seule approche indirecte 80% des familles peuvent être renseignées. On a ainsi pu caractériser de nombreux patients. 3 Génétique – Dr Vinciguerra 11/04/2008 Dahlem - Deau C. Cas particuliers 1) Hémophilie B Leyden Diapo 26 Le taux de facteur IX peut augmenter brusquement au moment de la puberté: de 2 à 3% on peut passer brusquement à 50%! La patient peut alors mener une vie normale, comme si il avait "guéri" de son hémophilie. Ce type d'hémophilie est due à une mutation dans la région promotrice, de -40 à +20, et cette région est un site potentiel de fixation aux androgènes. 2) Hémophilies féminines Diapo 27 On trouve trois cas différents: L'inactivation fortuite: seul le chromosome X muté code, on a donc peu de facteur de coagulation. Certaines hémophilies sont sévères, avec moins de 1%... Syndrome de Turner avec un seul X Si le père est hémophile et la mère conductrice, toutes les filles seront conductrices, et on peut avoir une fille avec deux X mutés. Si la mère connaît son statut de conductrice, on peut proposer quelque chose au couple, mais sinon… C'est pourquoi on peut parfois proposer des études génétiques chez des femmes qui n'ont que 30 ou 40% de facteur VIII, pour voir si on trouve des mutations. 3) Diagnostic prénatal Diapos 28 à 30 Pour pouvoir proposer un DPN, la loi exige que la maladie soit d'une particulière gravité, et considérée comme incurable au moment du diagnostic. Or les concentrés de facteurs de coagulation dont on dispose ne sont pas toujours bien tolérés. Mais on ne propose des DPN qu'aux familles avec un hémophile A ou B sévère. Le type de ponction est décidé en fonction de la technique de biologie moléculaire utilisée. La détermination du sexe fœtal se fait sur un prélèvement ou sur du sang maternel en isolant l'ADN libre fœtal circulant (on parle bien d'ADN, pas de cellules fœtales) qui est spécifique de la grossesse en cours, et est présent dès la huitième semaine de grossesse. Le sexe du fœtus est donc déterminé à environ 10 semaines de grossesse, et on ne propose une ponction qu'en cas de fœtus masculin. Si le fœtus est hémophile, on propose une IMG au couple qui est laissé libre dans son choix. Si le fœtus n'est pas hémophile, en fonction de la technique utilisée la conduite à tenir est différente. Si on a utilisé une technique directe, le résultat est fiable; mais si la technique utilisée était celle des polymorphismes, il faut garder en tête les 3 à 5% d'erreur, on peut donc proposer un dosage de facteur de coagulation sur sang cordonal un peu plus tard dans la grossesse. Conclusion: L'hémophilie est aujourd'hui encore considérée comme une maladie grave, et le pronostic vital peut être engagé. On sait que le risque de développer des anticorps inhibiteurs est plus grand si la mutation est une grande délétion, que si c'est un inversion, et enfin que si il s'agit d'une mutation non sens. 4