Les récepteurs T (TCR)

DAVID Nathalie
LACAZE Cécile
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Les récepteurs T (TCR)
I. Comparaison Ig et TCR

Les immunoglobulines:
Elles contiennent une chaîne lourde et une
chaîne légère.
Le fragment Fc (constant) confère des
propriétés biologiques particulières aux Ig.
Le fragment Fab comprend une région
variable et une région constante réunies par
un pont disulfure.
Deux sites sont capables de fixer
l'antigène.

Les TCR:
Ce sont des hétérodimères. On distingue deux populations lymphocytaires T en fonction de
l'hétérodimère exprimé. Un lymphocyte T exprime soit un récepteur TCR αβ (85% des LT
sanguins) soit un récepteur TCR γδ (ce dernier est comparable au dimère des Ig, moins de
5% des LT sanguins), mais jamais les deux ensembles. Le mode de reconnaissance des deux
TCR est probablement différent.
Il y a un seul site de reconnaissance de l'antigène.
Tout comme pour les Ig, le TCR contient une région variable ainsi qu'une région constante.
Les TCR ont deux régions transmembranaires et deux régions cytosoliques courtes.
TCR ne peut jamais être exprimé sans CD3 !
Les deux chaines α et β sont glycosylées, elles portent des carbohydrates fixés à des
Asparagines. On dit qu'ils sont N-liés.
Points importants:

Les Ig peuvent exister sous forme soluble tandis que le TCR est toujours exprimé à la
surface des lymphocytes T (LT).
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
Les Ac reconnaissent les Ag sous forme d'épitopes (repliement conformationnel).
Les TCR peuvent reconnaître des peptides entièrement enfouis dans la structure des
cellules en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité
(MHC).

Le complexe moléculaire CD3:
Il est constitué de différentes chaines protéiques: delta (δ), epsilon (ε), gamma (γ). CD3 est
indispensable pour la reconnaissance de TCR. Sa fonction est de transduire un signal
d'activation cellulaire lorsque le TCR est activé.
Cas particulier: les résidus à l'intérieur d'une membrane lipidique sont habituellement
hydrophobes, cependant dans ce cas, la région transmembranaire (résidus α, β et ζ) de TCR
est chargée (voir diapo n°3). Les charges permettent de stabiliser les interactions entre les
chaines.
Les rectangles jaunes sur le schéma représentent les résidus Tyrosine phosphorylés qui
servent de site d'ancrage et d'adaptateurs impliqués dans la transduction du signal.
Diapo 3 : Les hétérodimères α et β du
TCR sont associés avec un complexe de
quatre chaines (2 × ε, γ, δ) appelées CD3.
TCR est aussi associé avec un
homodimère de chaines ζ qui contient des
séquences qui signalent à la cellule que
l’antigène s’est lié au TCR. Il semble que
la chaine α interagisse avec le dimère
CD3δε et le dimère ζ alors que la chaine β
interagit avec le dimère CD3γε. Ces
interactions sont médiées par deux charges
positives dans la région transmembranaire
de TCR α et par une charge positive dans
la région de TCR β. Des charges négatives
dans les domaines transmembranaires de
CD3 et de ζ interagissent avec les charges
positives de α et β.
II. Les CMH

MHC classe 1
TCR αβ reconnaît des peptides présentés par des molécules du CMH.
Le complexe MHC de classe I est formé par l'association non covalente d'une chaine lourde
α polymorphe transmembranaire et d’une chaine légère non polymorphe, la β2
microglobuline. La chaine lourde possède 3 domaines extracellulaires: α1, α2, α3. (Fig 320)
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Le complexe MHC de classe I a été étudié par cristallographie, ce qui a permis de
comprendre que sa structure est constituée par un repliement dont la propriété est de former
une poche permettent de fixer un peptide (il y a une cavité entre les domaines α1et α2, c'est
dans ce sillon que se fixe le peptide). Le repliement est constitué d'une série de feuillets β.
Ces peptides sont des protéines endocellulaires dans 95 à 99% des cas. Ils sont
immunogènes et donc reconnus par les LT.
Une molécule MHC classe I est un
complexe trimèrique: elle est constituée
d'une chaine lourde (α1, α2, α3), d'une β2
microglobuline et du peptide.
Par exemple: si un virus infecte les
hépatocytes, il y a production de protéines
virales qui sont découpées, des peptides
sont présentés à la surface des hépatocytes
et seront reconnus par les LT CD8.
TAP 1 et TAP 2 (uniquement pour les CMH de classe I)
Ce sont des transporteurs qui permettent la translocation des peptides dans la lumière du
réticulum endoplasmique.
Après d’autres étapes, les peptides se retrouveront finalement à la surface des CMH.
Séquençage des peptides fixés aux MHC classe Ia:
Ce séquençage a permis de mettre en évidence que les CMH contiennent soit les mêmes
résidus, soit des résidus ayant les mêmes propriétés physico-chimiques (Ex: Tyr et Phe se
ressemblent cf diapos). Ce sont en fait des résidus d'ancrage qui permettent la fixation du
peptide au sein de la poche des molécules CMH classe I (ex: Tyr, Val, Ile = résidus
hydrophobes qui pénètrent dans la MHC et interagissent avec la poche hydrophobe). Les
peptides des MHC classe I ont environ tous la même taille, ils contiennent en moyenne
entre 8 et 10 résidus.
La cristallographie a montré qu'au niveau N-ter et C-ter, la poche est fermée. Des résidus
Tyrosine établissent des liaisons hydrogène aux deux extrémités ce qui permet de maintenir
cette poche fermée.
La taille fixe des peptides provient donc du fait que la poche qui les contient est fermée.
Dans la majorité des cas ce sont des peptides du soi à la surface des CMH.
En général, dans la région centrale le peptide forme une courbure: il est très exposé.
Les MHC classe Ia sont polymorphes, c'est-à-dire qu'ils expriment différents allèles et ce à
une fréquence supérieure à 1%.
Quand on compare leur séquence, on s'aperçoit que les résidus qui varient sont situés au
fond de la poche ou au niveau des hélices α qui pointent vers l'intérieur de la poche. D'un
individu à l'autre les résidus sont différents.
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
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Les MHC classe II
Ce sont des glycoprotéines
transmembranaires hétérodimères
constituées d'une chaine α et d'une chaine
β. Chaque chaine présente deux domaines
extra membranaires (α1 et α2, β1 et β2)
associés par une courte séquence à une
région transmembranaire et à un domaine
intracytoplasmique. Les domaines les plus
externes α1 et β1 sont les plus
polymorphes. Ils s'associent étroitement
pour former une cavité qui reste ouverte
aux 2 extrémités (celle du CMH-I est
fermée).
Il est très difficile de réaliser des cristaux de protéines transmembranaires, car il faut
solubiliser les protéines avec des détergents. Cependant on peut les reconstituer in vitro
grâce à leurs domaines extracellulaires.
La différence essentielle entre MHC classe I et MHC classe II réside dans le fait que la
poche contenant le peptide n'est pas fermée pour les MHC classe II. Ainsi, les peptides
ont une taille variable, contrairement aux peptides de MHC classe I. De plus, les peptides
associés aux CMH-II ont une position plus étendue.
Les MHC-II ne sont pas polymorphes.
Au niveau de la poche, des interactions avec les hélices α (liaisons hydrogène) permettent
de stabiliser la poche sur toute sa longueur.
Tout comme pour les MHC classe I, on a pu mettre en évidence que les peptides présentent
des propriétés physico-chimiques similaires (ancrage au fond de la poche).
La totalité des variabilités est retrouvée au
fond de la poche : au niveau de α1 et α2 pour
MHC classe I, et au niveau de β1 pour les
MHC classe II (voir diapo n°11).
La totalité des variabilités est ainsi retrouvée au niveau des résidus situés au fond de la
poche ou sur les hélices α qui pointent vers l'intérieur de la poche.
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Les peptides dans la poche sont différents chez deux individus. Ainsi chaque personne aura
des populations de LT tolérants à des CMH différents.
Suite aux études de cristallographie, on a pu mettre en évidence les conformations suivantes
des peptides en superposant les peptides de classe I et II:
classe Ia → bosse importante (TCR αβ reconnaît la Tyr qui pointe vers l'extérieur)
classe Ib → conformation allongée
TCR αβ ressemble à un Fab d'immunoglobuline.
Les boucles importantes correspondent aux régions hypervariables (reconnaissance de l'Ag)
CDR1, CDR2 et CDR3. Cette dernière est la région la plus variable, aussi bien chez les Ig
que pour TCR.
Arrangement des différentes boucles (diapo n°16):
NH3-ter Vα - CDR1α + CDR2α - CDR3α – CDR3β - CDR1β + CDR2β - Vβ COOH-ter
CDR3 est situé en position centrale. CDR3 α
et CDR3 β établissent des liaisons avec le
peptide tandis que CDR1 α et CDR2 α
participent aux interactions avec les hélices
α du CMH.
Contrairement aux Ig, TCR doit reconnaître à la fois le peptide replié et la molécule du
MHC.
III. Les molécules CD4 et CD8
Ce sont des marqueurs usuels des LT.

CD4 = chaine unique à 4 domaines (diapo n°18): D1, D2, D3 et D4
D1 et D2 ont un repliement de type domaine variable d’Ig.

CD8 = hétérodimère: 2 domaines α et β avec des régions à repliement de type Ig. Il y
a un pont disulfure entre ces domaines.
Les LT CD4+ interagissent avec les cellules qui présentent des peptides antigéniques sur
les molécules de classe II du CMH. Les LTCD4+ sont dits LT « helper ».
Les LT CD8+ interagissent avec les cellules qui présentent des peptides antigéniques sur
les molécules de classe I du CMH. Les LT CD8+ sont dits LT cytotoxiques.
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(Diapo 19)
CD8 reconnaît en général le domaine α3 des MHC I, donc l’interaction se fait à distance de
là où est fixé le peptide. L’interaction CD8-CMH permet la stabilisation de la rencontre LTcomplexe CMH peptide. La région cytosolique de CD8 contient LCK qui initie la cascade
d'activation du LT.
Le domaine D1 de CD4 reconnait le domaine β2 des MHC II. CD4 comme CD8 est
associée à une LCK qui possède une Tyr Kinase impliquée dans les étapes initiales de la
cascade d’activation.
IV. Réarrangements et diversité
Que ce soit pour les Ig ou pour les TCR, par le biais des réarrangements on peut générer une
diversité monstrueuse.
(Diapo 20)
Lorsqu’un précurseur lymphocytaire s’engage dans la voie de différenciation lymphocytaire
T, il procède à des réarrangements chromosomiques au niveau des loci codant pour les
chaines du récepteur T pour l’antigène. Au cours des réarrangements, les parties de
chromosome situées entre les segments qui se juxtaposent sont délétées. Il s’agit d’un
processus irréversible. La diversité du domaine variable résulte de la multiplicité des
combinaisons possibles.
Pour les chaines δ et β, n’importe quel segment D peut se combiner avec n’importe quel
segment J, et l’ensemble DJ formé peut se combiner avec n’importe quel segment V. Les
chaines α et γ n’ayant pas de segment D, le réarrangement chromosomique juxtapose un
segment V et un segment J.
Ces recombinaisons sont aléatoires et sont catalysées par les enzymes RAG1 et RAG2.
(Diapo 21)
Les réarrangements obéissent à un certain nombre de règles.
Les loci des gènes V, D, J sont flanqués par des Recombination Signal Sequences (RSS) qui
sont reconnues par un groupe d’enzymes connues collectivement comme VDJ
recombinases. Les RSS sont constituées par un heptamère (constitué de sept nucléotides)
palindromique conservé, suivi d’une séquence intercalante de 12 ou 23 nucléotides, puis un
nonamère (constitué de neuf nucléotides) conservé. Ainsi, dans le cas d'un réarrangement
des gènes V et J, les séquences RSS situées en 3’ (aval) du segment V et en 5’ (amont) du
segment J sont reconnues par la recombinase. Seules des associations de RSS dissemblables
sont efficacement recombinées, c’est-à-dire un RSS avec une séquence intercalante de 12
nucléotides sera recombinée avec un RSS ayant un intercalant de 23 nucléotides. Ceci est
connu comme la règle 12/23.
Cette règle empêche ainsi VH de se réarranger avec JH.
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(Diapo 23)
Dans le génome, tous les segments V ne
sont pas dans la même orientation: les
RSS s’associent, il y a formation d'une
boucle, clivage et libération d'un cercle.
Les molécules RAG1 et RAG2 sont indispensables au réarrangement. Elles sont exprimées
uniquement dans les lymphocytes à certains stades de leur développement et de leur
différenciation. Chez des souris KO pour RAG1 ou RAG2 il n’y a plus de réarrangement.
RAG1 ne peut remplacer RAG2 et inversement.
S'il n'y a pas de réarrangement, il y a un blocage de la différentiation des lymphocytes, une
absence de LT et LB et donc une sensibilité extrême aux infections.
(Diapo 24)
RAG1 et RAG2 s’associent et se fixent
au niveau des RSS. Le complexe RAG est
activé et coupe l’ADN.
On obtient deux parties:
- formation d'une boucle de jointure
(épingle à cheveux)
- libération des régions codantes
(segments V et J).
Au niveau de la boucle se trouvent des
molécules non spécifiques des
lymphocytes impliquées dans la
réparation des cassures de l’ADN. Après
phosphorylation des extrémités du
segment, l’ADN ligase ferme la boucle.
Du côté des régions codantes,
l’hétérodimère Ku70-Ku80 va stabiliser
les 2 extrémités V-J. Ces dernières sont
alors coupées par Artemis et DNA-PK
(DNA Protéine Kinase). La TdT va
ensuite créer des extrémités diverses et
imprécises. Enfin, après séparation des
extrémités, la DNA-ligase IV ligature
celles-ci.
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La TdT ajoute des nucléotides de façon matrice indépendante et aléatoire, ce qui augmente
de façon importante la diversité. Ils peuvent être ajoutés en phase ou non, ce qui provoque la
dégradation de nombreux lymphocytes lors de cette étape.
Lors de la sélection des thymocytes dans le thymus 95% des thymocytes sont ainsi perdus.
Sélection jonctionnelle :
1. Nucléotides Palindromiques
Lors de l’initiation du réarrangement des gènes TCR, les extrémités codantes sont scellées
en épingle à cheveux. L’ouverture de cette épingle à cheveux par Artémis grâce à son
activité endonucléasique peut se faire de manière asymétrique, générant une extrémité
cohésive. Le brin portant l’extrémité sortante possède alors une séquence nucléotidique
palindromique. Les nucléotides ainsi « ajoutés » sont nommés nucléotides P. Ces
modifications nécessitent une coupure simple brin de l’épingle à cheveux.
Exemple de clivage entre T et A. Des enzymes de réparation ajoutent des nucléotides
complémentaires (ici G et T).
CTGACA TG
GACTGT/AC

CTGACATG-CA
GACTGTAC GT
Les résidus complémentaires ajoutés sont appelés résidus P (séquence palindromique de
type TATA). Ils sont matrice dépendants.
2. Nucléotides N
Les nucléotides N sont les nucléotides non codés présents dans la jonction codante dont
l’ajout est catalysé de manière aléatoire et indépendamment de toute matrice par la TdT. En
moyenne, on retrouve un ajout de 3 pb par jonction dans les chaînes TCRβ.
La présence d’un tri nucléotide TAT, TGT ou ATA interrompant cette succession de G et de
C marque par contre un site de « coupure » privilégié.
Le plus souvent un nombre variable de nucléotides N (souvent G et C) sont ajoutés entre les
nucléotides P. C’est une N-addition.
CTGAC/ATG
GACTG/TAC

CTGAC-CA-TGC-TATA
GACTG GT ACG- ATAT
Enzymes impliquées dans la jonction des extrémités non homologues (diapos 28):
1. Ku 70 et 80 forment des hétérodimères qui possèdent des activités leur permettent de
fixer les extrémités de l'ADN.
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2. Ku70/80 s'associe à la sous-unité catalytique d'une protéine Kinase, DNA-PKcs pour
former la protéine Kinase dépendante de l'ADN.
3. Artemis, qui est une nucléase, et la DNA-PK jouent un rôle essentiel dans la
formation des jonctions codantes.
4. XRCC4 et la DNA ligase IV sont impliquées dans la ligation des jonctions codantes
et des séquences de recombinaison (RSS).
(Diapo 31)
TCR γδ a une particularité: la chaine Vδ se comporte comme Vβ.
la chaine Vγ se comporte comme Vα.
Vα et Vδ sont au même endroit au niveau de l'ADN ainsi, dès qu'un thymocyte exprime Vα,
il ne peut plus exprimer Vδ.
Vγ est un locus banal avec deux segments constants.
Dans les réponses aux Ac, un certain nombre de mutations apparait, cela provoque
l'augmentation de l'affinité des Ac pour leurs Ag: ce processus est appelé hypermutation
somatique. Ces processus est du au fait qu'il y aurait un trop grand nombre de lymphocytes
capables de reconnaître un Ag particulier.
Ainsi, si le site antigénique change, les lymphocytes qui fixent le mieux les Ag sont
sélectionnés: ne sont conservés que les plus affins.
Il n'y a pas de mutation somatique pour les TCR.
(Diapo 34)
diversité totale
Ig
TCR
13
5.10
1018
Il y a création de diversité par appariement de chaines différentes, mais l’essentiel de la
diversité est due à l’introduction de CDR3.
Diversité des récepteurs pour l'Ag:
1. diversité combinatoire
- recombinaison aléatoire entre les segments géniques V(D)J
- appariement entre une chaine α et une chaine β pour le TCR
2. diversité jonctionnelle
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- délétion de nucléotides
- addition de nucléotides
→ dépendante de la matrice (élément P = palindromique)
→ indépendante de la matrice (élément N = N-addition): médiée par la TdT
(Terminale deoxynucleotidyl Transferase)
La TdT est une ADN polymérase atypique puisqu'elle ne recopie aucun brin
matrice.
Son expression est:
- retrouvée dans toutes les espèces de vertébrés
- tissu-spécifique (thymus et moelle osseuse)
- transitoire au cours de l'ontogénie des cellules B et T ainsi qu'au cours du
développement
V. La technique Immunoscope
La technique Immunoscope
ADNc
ARN
Amplification par PCR
BV
BD
BJ
BC
Elongation d’une
amorce fluorescente
*
Migration sur un
gel dénaturant
Courbe en cloche : indicatif d’une
population polyclonale
Pic proéminent : indicatif d’une
population oligoclonale ou clonale
(expansion clonale)
Analyse
6 7 8 9 1011
6 7 8 9 1011
→ permet de décrire et d’étudier le répertoire de façon détaillée
→ est basée sur la technique de PCR (amplification)
Le principe de la technique Immunoscope consiste en une amplification par PCR des
différentes régions CDR3 en utilisant une amorce 3' commune et une amorce 5' spécifique
de chaque famille V. Les produits amplifiés sont ensuite soumis à une étape d'élongation
effectuée avec une seconde amorce marquée par un fluorophore. Les produits
d'amplification fluorescents sont séparés en fonction de leur longueur par migration sur gel
de polyacrylamide. Le profil de migration est analysé par un séquenceur d'ADN couplé au
logiciel Immunoscope. On obtient ainsi une image de la distribution des longueurs CDR3
pour chaque couple d'amorces. On peut observer entre 1 et 11 pics d'amplification
correspondant chacun à une taille particulière de la région CDR3 et séparés chacun de trois
nucléotides. L'analyse de la répartition des différentes longueurs de CDR3 permet
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d'identifier d'éventuelles expansions oligoclonales. Ces dernières correspondent à des
séquences Vβ et Jβ si on ne trouve que 2 bandes (voir graphique en bas à droite).
Seule la protéine TdT est responsable in vivo de l'addition des éléments N.
Quelle est l'influence de la TdT sur la production du répertoire des LT αβ ? Joue-t-elle un
rôle important dans la diversité ?
Comparaison de la taille des CDR3:
En gris, les pics des souris sauvages sont plus longs que chez les souris KO, donc les CDR3
des souris sauvages sont plus longs que chez les souris KO. En absence de TdT, les CDR3
sont plus courts (uniquement pour Vβ, car léger décalage seulement pour Vα).
Peut-on quantifier le répertoire des TdTko / TdT ?
Grâce à la technique immunoscope I, on met en évidence la taille du répertoire des TdT KO
et des TdT sauvages. On a découpé les bandes correspondantes au CDR3 et on les a
séquencées.
Conclusion (enfin)

Le répertoire des cellules Tαβ des souris TDT KO est polyclonal

Dans les souris TdT KO, la taille du répertoire des TCRαβ représente 5 à 10% de
celle des souris de génotype sauvage.

La baisse de diversité n'est pas contrebalancée par un accroissement de l'appariement
d'une chaine β avec plusieurs chaines α.
=> au moins 90% de la diversité du TCRαβ est due à la TdT, elle joue donc un rôle
très important dans la diversité. Elle est apparue tôt chez les vertébrés.
De façon surprenante, lorsque la déficience en TdT est introduite dans un fond génétique
prédisposant à une maladie auto immune, elle a un rôle protecteur.
Ainsi, les souris TdT KO vivent très bien si on les met dans une animalerie « dégueulasse »
malgré l'absence de TdT dans leur répertoire.
Dans la nature, vivraient-elles aussi longtemps ?? Quels agents infectieux auraient un
impact sur leur santé ? Y a-t-il des agents pathogènes qui les tueraient plus vite que les
TdT+.
Quelle est l'influence de la TdT sur le répertoire des cellules T autoréactives ?
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