L`électrophorèse
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L’électrophorèse SOMMAIRE : Historique Principes Différents types d’électrophorèse I) Electrophorèse sur papier et acétate de cellulose II) électrophorèse sur gel séparation sur gel de polyacrylamide (PAGE) séparation sur SDS-PAGE Electrophorèse bi-dimensionel avec deux dimensions (la première étant la focalisation Isoélectrique (FIE) et la deuxième étant la SDS-PAGE) séparation sur gel d’agarose Electrophorèse en champ pulsé III) Electrophorèse capillaire IV) « Blotting » et applications Western Blot Séquençage d’ADN Southern et Northern Blot Zymographie Cours effectué par Aude Barami (contact sur : [email protected] (précisez que l’on est étudiant en P1) ou à la porte 130 de la fac de médecine a bellevue) INSERER LES SCHEMA QUI SERONT SUR LE BVRA Historique 1937 : Tisetius met au point l’électrophorèse en veine liquide 1955 : Smithies utilise les gels d’amidon pour séparer les protéines sériques par électrophorèse. Sanger complète l’analyse de la séquence d’acides aminés de l’insuline bovine, première protéine déchiffrée 1959 : Raymond et Weintroub introduisent les gels de polyacrylamide, meilleure séparation des protéines par électrophorèse (au gel d’amidon). 1966 : Maizel introduit l’emploi du sodium dodécyl sulfate (SDS), perfectionne l’électrophorèse des protéines sur gel de polyacrylamide. 1975 : O’ Farell développe les gels bi-dimensionnelle (focalisation isoélectrique, SDSPAGE), séparation de plus de 1000 protéines sur un même gel. 1984 : Schwartz et Cantor développent l’électrophorèse en champ pulsé : séparation de très grosse molécules d’ADN Principes L’électrophorèse est une méthode de séparation des molécules chargées électriquement. On a une séparation puis on a une caractérisation ou une purification de molécules d’intérêts. Le terme « électrophorèse » vient de « electro » signifiant énergie électrique et de « Phoresis » (photos en grec) qui veut dire porter, avoir en soi. Cette méthode s’applique principalement à la biochimie et à la biologie moléculaire et on à une séparation des protéines et des acides nucléiques. Son principe consiste à avoir une migration de molécules chargées (perte de neutralité électrique) dissoutes ou en suspension dans un solvant, sous l’effet d’un champ électrique. Un champ électrique est produit par un générateur de courant continu. Le support du champ est un tampon conduisant le courant d’un pôle à l’autre. Les caractéristiques propres des molécules et les conditions de l’électrophorèse implique des vitesse de migration des ions qui est différentes et une séparation les unes des autres (les anioniques migrent vers l’anode (+) et les cationiques vers la cathode (-). Les molécules à séparer sont déposées sur un support dont chaque extrémité est en contact avec une solution tampon. Dans chaque solution tampon se trouve une électrode. Les électrodes sont reliées à un générateur de courant. Lorsque le générateur envoie du courant, les molécules chargées se déplacent sur le support en direction de l’électrode de signe opposé à leur charge. Différents types d’électrophorèse On à plusieurs supports d’électrophorèse : - sur supports liquide : « électrophorèse en veine liquide » pour les TRES grosses particules (cellules, organites) qui est très peu utilisé. - sur supports poreux : « électrophorèse de zone » On à différents support d’électrophorèse de zones : - papier - acétate de cellulose - semi solide (gel) Le support poreux doit être homogène et le plus inerte possible. On à plusieurs types d’électrophorèse sur gel : Electrophorèse sur gel d’agarose Electrophorèse en champ pulsé Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (où PAGE pour polyacrylamide gel electrophoersis) Electrophorèse bi-dimensionnelle Les électrophorèses peuvent aussi être réalisé en conditions dénaturantes (détergent types SDS ou urée). I) Electrophorèse sur papier et acétate de cellulose On a une migration des molécules principalement en fonction (charge globale) en condition non dénaturante. L’électrophorèse sur papier : On a une séparation des petites molécules (acides aminés ou petits peptides) puis une détermination du point isoélectrique d’un acide aminé. On à une mesure de mobilité par détermination de mobilité d’un acide aminé à différent pH et on a la relation suivante. Mobilité= k . (pH-pHi) / Masse molaire Cette méthode d’électrophorèse sur papier est peu utilisée de nos jours. L’électrophorèse sur acétate de cellulose : On a une séparation de molécules de milieux complexes (plasma), de petites molécules migrant de manière proportionnel à leur charge. Cette méthode peut être remplacé par des électrophorèses sur gel. L’électrophorèse sur acétate de cellulose est fait de la manière suivante : -imprégnation d’une bande par un électrolyte convenable Les espèces ioniques se d -dépôt d’une goutte de solution contenant l’espèce ionique à étudier sur la bande sous l’action d’un champ -établissement d’un ddp entre les deux extrémités de la bande de papier avec une vitesse propre En milieu basique, les protéines sont chargées négativement. Dans le montage ci-dessus, on a: - les extrémités des bandes sont plongées dans des solutions conductrices de pH=9.2 - une application d’un champ électrique (entraînant la dissolution de l’échantillon dans la bande conductrice et la migration le long de la bande).La vitesse de migration dépend de la magnitude de la charge et de la taille des molécules. - une coloration des protéines (rouge Ponceau) - une analyse de la densité optique des bandes (l’intensité de la coloration est donc proportionnelle à la concentration de protéines) et on obtient les spectres suivant : La vitesse de migration dépend de la magnitude de la charge. Chez des personnes atteint de myélome, on à une immense concentration de γ-globuline. II) Electrophorèse sur gel Elle sépare des molécules selon leur ratio charge /masse. Cette méthode conjugue l’effet de filtration du gel (taille des pores limitant la vitesse de migration) et la mobilité électrophorétique. Les molécules atteignent rapidement une vitesse V telle que : V = q.E / f q étant la charge de la particule, E étant le champ électrique, f étant le coefficient de frottement de la particule par rapport à son solvant D’après la théorie de l’électrophorèse, on à une mobilité U dans un champ électrique au sein d’un gel Log U = log U0 – Kr . C Log U0 étant la mobilité en milieu liquide Kr étant le coefficient de retardement dû au gel (fonction MW) C qui est la concentration de gel La vitesse de migration dépend aussi de la masse moléculaire. On à deux types de matériaux pour l’électrophorèse sur gel : - l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (l’acylamide à la formule suivante : CH2-CHCO-NH2 se polymérise avec le NN méthylène-bis-acrylamide et on à du polyacrylamide qui à la formule brute suivante : CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 qui donne des chaînes latéral linéaire - l’électrophorèse sur gel d’agarose qui utilise de l’agarose qui est un colloïde naturel extrait d’algue rouge (Gracilaria) et est un polysaccharide gélifiant. On a dans ce cas des pores de grande taille donc on sépare les très grosses molécules qui sont des protéines de plus de 500 kDa et des acides nucléique de plus de 1500 pb. séparation sur gel de polyacrylamide (PAGE) - On à une séparation par purification des protéines : Pour des petits fragments d’acides nucléiques (taille < 1500pb), on à purification d’oligonucléotide de synthèse (élimination de nucléotides libres) ensuite on à détermination des séquence d’ADN et enfin, on à séparation des petits fragment (< 500 pb de long). -On à une séparation par purification d’un mélange de protéines : On détermine la taille et la composition en sous-unité d’une protéine. Les protéines ont ici une charge nette positive ou négative. On à un reflet du mélange en acide aminé dont elles sont formés par cette méthode. Pour cela, on applique un champ électrique à une solution contenant des protéines. La vitesse de migration dépendra alors de : la charge nette de la protéine la forme de la protéine la taille de la protéine L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) à tendance à remplacer l’électrophorèse sur acétate de cellulose. Il faut savoir que l’électrophorèse réalisée de condition native est l’électrophorèse PAGE alors que l’électrophorèse en condition dénaturante est l’électrophorèse SDS-PAGE. Electrophorèse sur gel polyacrylamide-SDS (SDS- PAGE) Cette méthode d'électrophorèse est réalisée en conditions dénaturantes en présence de SDS qui est un agent dénaturant. Le SDS est du sodium dodécyl sulfate qui a pour formule : O CH3—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—O— S—O-—Na+ O Le SDS est un détergent anionique. Lorsque l'on met échantillon protéique à bouillir en présence d'un détergent est un agent réducteur, on a : Toutes les protéines sont enrobées de charges négatives et seront dénaturé par rupture des ponts di-sulfure. Ainsi, la protéine perd sa structure tertiaire et quaternaire. L'électrophorèse sur gel polyacrylamide-SDS se réalise sous certaines conditions lors de la migration et on a donc une suppression des facteurs forme et charge des protéines lors de la migration suite à la dénaturation. Cette méthode d'électrophorèse sur gel polyacrylamide-SDS sépare les protéines uniquement en fonction du facteur taille. Pour faire cette électrophorèse SDS-PAGE, on utilise un gel de préparation (qui est le gel de résolution ayant 6 à 15 % de polyacrylamide) contenant du SDS. On à également un gel concentrateur (qui est le gel de stacking ayant 3 à 5 % de polyacrylamide) et qui est coulé en haut du gel de séparation. Ainsi, on à une entrée homogène de l'échantillon dans le gel de séparation. De plus, on affine les bandes avant leur entrée dans le gel de résolution. Le tampon d'électrophorèse est une solution avec de la glycine ayant un pH de 8,2 qui est mis dans le gel séparateur. Le tampon du gel concentrateur a un pH de 6,8 et est additionné avec des ions chlorure Cl-. Pour la solution de pH de 6,8 ; les ions chlorure chargés négativement vont amplifier le mouvement vers l’anode qui est une électrode positive alors que la glycine à une faible charge négative (son pHi ≈ 6) et que l’on es à pH=6.8. Les ions chlorure migrent donc plus vite que le glycinate. E d g O s s d P o a L c 6 g c ta Pour le niveau concentrateur (qui permet de séparer les échantillons), on à formation d'une zone a faible de concentration en anion (d'où une faible conductivité). Par conséquent, le champ électrique est plus élevé créant une accélération des protéines et à la limite du gel séparateur, les protéines sont en bandes effilées. Comme le concentrateur permet de séparer les échantillons, cet échantillon sera déjà organisé avant d’entrée dans le gel séparateur. Pour le niveau séparateur, on à une solution de pH de 9,8 donc la glycine est chargée négativement donc la migration est à la même vitesse qu'avec les ions chlorure. On a une évaluation des masses molaires des protéines séparées à partir de standards de masse moléculaire connue (qui sont des témoins). La masse moléculaire notée m est exprimée en Dalton (Da) et 1Da équivaut à 1/12 de la masse du carbone 12. Pour les macromolécules, si elles sont suffisamment grosses elles peuvent être exprimées en kiloDalton (kDa). Le poids moléculaire noté Mr ou masse moléculaire relative à un ratio : Masse la macromolécule = Mr 1/12 de la masse carbone 12 On à une révélation des protéines séparées présentant un gel par coloration avec comme colorant possible : - le bleu noir naphtol -le nitrate d'argent (qui est plus sensible) -le bleu de Coomasie -des colorants fluorescents (SYPRO) On à une visualisation de protéines spécifiques dans le gel en utilisant des anticorps spécifiques marqués. On utilise alors la technique de western Blot. Electrophorèse bi-dimensionel avec deux dimensions (la première étant la focalisation Isoélectrique (FIE) et la deuxième étant la SDS-PAGE) Lorsqu'il est existe des bandes protéique très proches, on à un chevauchement. Par les méthodes unidimensionnelles la résolution et bon pour moins de 50 protéines. Grâce à l'électrophorèse bi-dimensionnelle, on combine deux modes de séparation différents. La résolution peut être appliquée pour plus de 1000 protéines différentes. o La première dimension est la focalisation isoélectrique (noté FIE) Pour cette dimension, on est une séparation des protéines en fonction de la charge. Son principe se base sur le fait que la charge nette d'une protéine varie avec le pH. À pHi, la charge nette est nulle. Cette valeur de pH est spécifique d'une protéine qui ne migre plus dans un champ électrique. La FIE est une électrophorèse réalisée dans un tube étroit de gel de polyacrylamide où un gradient de pH est établi. On utilise alors un fort courant électrique et les protéines migrent vers la position du gradient correspondant à son pHi et s'immobilise. On a donc le schéma suivant : o La deuxième dimension est la méthode SDS-PAGE Pour cette dimension, on est séparation en fonction de la taille des protéines. Son principe consiste à mettre les protéines séparées par la focalisation hydroélectrique dans un tube étroit et à soumettre ce tube avec les protéines à une SDS-PAGE dans une direction perpendiculaire à celle de la FIE. Avec cette méthode dimensionnelle, on obtient des résultats des photos ci-après. On remarque qu'au bout des flèches bleu foncé on à l'étage à gauche alors qu'à droite ces spots sont mieux visible. Au bout des flèches bleu clair, sur la photo de gauche, on a un spot alors qu'à droite il y a plus rien. Séparation sur gel d’agarose (= 2eme support de gel, le premier étant le polyacrylamide) L’électrophorèse sur agarose sert à séparer les grosses molécules (ADN, ARN, grosses protéines qui sont supérieur à 500 kDa. Les acides nucléiques sont poly anionique et uniformément chargé donc ici, on à un séparation non pas par la taille mais par l’effet filtration du gel. On considère le gel comme un tamis moléculaire et ce gel forme un maillage plus ou moins serré et la taille de pores peut freiner la migration. On a donc un système de discrimination à cause de cet effet filtration du gel On a donc une séparation à travers ce gel d’agarose de toutes les molécules chargées négativement. On à donc des pores énormes pour séparer les grosse des très grosse molécules. Si on a des petits fragment d’ADN à séparer le pourcentage de gel sera plus élevé Pour des pores petit, alors on sépare les petits ADN on à 2% d’agarose pour des ADN de 0.1 à 0.3 kb. Pou une même molécules, si le pourcentage de gel augmente, alors les mailles sont plus sérés et on à une migration plus lente. Choix du marqueur de masse moléculaire On pose le gel dans une cuve et on à du tampon d’électrophorèse et on fait passer du courant électrique permettant la migration. Lorsque l’on met des échantillons protéiques dans un puit, on à des repères visuelles et on a deux solutions colorantes : - le bleu de bromophénol qui migre comme s’il était très petit. Il migre donc très vite et passe facilement dans des pores à une migration comparable à un fragment d’ADN de 300 pb. - le xylène cyanol et on à une migration comparable à un fragment d’ADN de 4 000 pb. Il y a donc une migration lente. L’électrophorèse sur gel d’agarose se fait comme sur le montage suivant : Si on laisse trop le courant électrique branché les molécules sortent du gel donc on utilise ces colorants pour visualiser la migration et pour savoir quand on arrête le courant (donc la migration). Le bromure d’Ethidium (BET) est intégré dans le gel et devient fluorescent (fluorescence orangé si c’est éclairé par des UV courts de 200 à 300 nm) lorsque l’on le met sous U.V visible grâce à un transilluminateur. Cette technique permet de détecter quelques nanogrammes d’ADN donc cette méthode est très sensible (et très dangereuse aussi). A gauche, sur la photo d’électrophorèse, on à les témoins qui sont disposées. A coté on a les espèces que l’on cherche à identifier. Ce BET est un agent intercalant car il s’intercale entre les plateaux de paires de bases On a également d’autres colorant d’ADN qui sont moins sensibles qu’avec le BET : - le bleu de méthylène - l’azure A ou bleu de bromotylène - le bleu de Toluidine le bleu de Nile Cependant, on utilisera préférentiellement le BET repérable sous UV. L’intensité de la fluorescence sous UV sera alors proportionnelle à la quantité d’ADN présente. Ainsi, on peut avoir une estimation de la quantité d’ADN en la comparant avec une fluorescence d’un échantillon connue (marqueur). En jaune à gauche on a une bande de taille inconnue et on va chercher sa taille donc on fait plusieurs mesures de longueur. En utilisant la distance de migration du standart (= espèce connue) on a une droite dans un modèle mathématiques et on regarde la taille de l’ADN inconnue. On peut aussi séparer les molécules d’acide nucléiques suivant leur structure et on a plusieurs structures d’ADN : L’ADN linéarisé serpente facilement car on à une rupture du brin d’ADN circulaire fermé. L’ADN super enroulé passe facilement à travers les mailles du gel car il est très enroulé donc est très serré et donc on aura une migration plus rapide encore. Pour les ARN, on à le même principe. L’électrophorèse en champ pulsé On peut avoir des ADN de taille énorme (50kb à 10Mb) qui ne peuvent être utilisé en électrophorèse par agarose classique car sa porosité est inférieur à 1 µm. Or un ADN de grosses tailles dépasse largement le µm. On utilisera donc la technique en champ pulsé.
