TP 3 : Explication moléculaire de la double spécificité
publicité
TP 3 : EXPLICATION MOLECULAIRE DE LA DOUBLE SPECIFICITE D’UNE ENZYME Mise en situation et recherche à mener Les enzymes, digérant les sucres, fonctionnent comme toute autre enzyme. Nous étudierons, ici la carboxypeptidase, une enzyme digestive pancréatique responsable de la digestion des polypeptides. Nous savons que les enzymes sont étroitement spécifiques d’une réaction chimique donnée, réalisée sur un type de substrat défini. Donc le substrat va être en quelque sorte reconnu par l’enzyme. On cherche à mettre en évidence que l’enzyme possède une structure tridimensionnelle particulière qui permet d’expliquer sa double spécificité. Ressources Matériel Le site actif de l’enzyme, lieu d’interaction avec le substrat, est composé : -d’un site de reconnaissance du substrat, impliquant quelques acides aminés et intervenant dans la spécificité au substrat ; -d’un site catalytique, impliquant deux ou trois acides aminés, où se réalise la réaction chimique avec le substrat et qui intervient donc dans la spécificité d’action. Pour la carboxypeptidase six acides aminés constituent son site actif et interviennent dans la catalyse, on distingue : - trois acides aminés constituent le site catalytique : Histidine 69, Acide glutamique 72, Histidine196 , - trois acides aminés constituent le site de reconnaissance : Arginine 145, Tyrosine 248 et acide glutamique 270. -Rastop : logiciel de visualisation en 3D -une fiche méthodologique du logiciel Molécules de Rastop - carboxypeptidase : CPASEUL.PDB - carboxypeptidase et son substrat : CPASUB.PDB - site actif seul de l'enzyme : siteseul.pdb - site actif avec le substrat : sitesub.pdb - carboxypeptidase mutée et son substrat : mut_cpasub.pdb Etape 1 : Concevoir une stratégie pour résoudre une situation-problème (durée maximale : 10 minutes) 1) Proposer une démarche d’investigation permettant d’établir les caractéristiques structurales de l’enzyme qui explique sa double spécificité. Appeler l’examinateur pour vérifier votre proposition et obtenir la suite du sujet. Exigences Concevoir une démarche réalisable Etape 2 : Mettre en œuvre un protocole de résolution pour obtenir des résultats exploitables 2) Mettre en œuvre le protocole afin de préciser le rôle de la structure des enzymes dans leur fonctionnement. Appeler le professeur pour vérifier les résultats et éventuellement obtenir une aide. Etape 3 : Présenter les résultats pour les communiquer 3) Sous la forme de votre choix, traiter les données obtenues pour les communiquer. - Maîtrise du logiciel Rastop - Maîtrise du logiciel Word ou powerpoint Etape 4 : Exploiter les résultats obtenus pour répondre au problème 4) Exploiter les résultats pour montrer que la structure tridimensionnelle des enzymes permet - Explication cohérente avec les observations leur double spécificité réalisées. Protocole 1) Comparaison de la carboxypeptidase et de la carboxypeptidase et son substrat : a) Ouvrir les deux molécules ( CPASEUL et CPASUB) en fenêtres mosaïque verticale b) Faire un affichage en sphère VDW pour ces deux molécules. c) Colorer l’enzyme et le substrat de deux couleurs différentes : menu : « Atomes », « colorer par », « Chaine» . d) Afficher le squelette carboné de l’enzyme dans la fenêtre CPASUB ; pour cela : - Sélectionner substrat en cliquant sur l’icône « AbC», taper « *S » (tous les atomes qui appartiennent au substrat sont sélectionnés). Le nombre d'atomes sélectionnés s'affiche en bas dans la zone grise - Sélectionner l'enzyme en utilisant le bouton "inverser la sélection" - Aller dans « atomes -représentation- effacer » (seul le substrat reste affiché) - Aller dans « Rubans » « squelette carboné » e) Afficher également l’enzyme seul en squelette carboné dans la fenêtre CPASEUL; pour cela : - Sélectionner la totalité de l'enzyme (icône "tout sélectionner") - Aller dans " atomes- représentation- effacer" (toute la molécule disparait) - Aller dans "Rubans - squelette carboné" - Colorer en bleu le squelette carboné de l'enzyme f) Identifier les caractéristiques du complexe enzyme-substrat g) Copier les images dans votre fiche réponse Word ou powerpoint h) Fermer les images sans les enregistrer. 2) Comparaison des sites actifs : site actif seul et site actif avec un substrat : a) Ouvrir les deux molécules (siteseul et sitesub) en fenêtres mosaïque verticale. b) Afficher le substrat en sphères VDW rouges et les acides aminés du site actif en bâtonnets. c) Identifier les acides aminés des sites catalytique et de fixation en les colorant, dans les deux fichiers, de deux couleurs différentes : respectivement jaune et rose. d) Identifier les caractéristiques du site actif en présence du substrat e) Copier les images dans votre fiche réponse f) Fermer les images sans les enregistrer 3) Comparaison d’une carboxypeptidase et substrat avec une carboxypeptidase mutée et substrat : a) Ouvrir les deux molécules (CPASUB et mut_cpasub.pdb) en fenêtres mosaïque verticale. b) Afficher le substrat en sphères VDW rouges et l'enzyme en bâtonnets bleus. c) Sélectionner les acides amines des sites catalytique et de fixation et les colorer avec le même code couleur que précédemment. d) Identifier les différences entre les deux sites actifs e) Copier les images dans votre fiche réponse f) Fermer les images sans les enregistrer FICHE METHODE : Utilisation maîtrisée du logiciel RASTOP. Ouvrir une molécule Coloration de la molécule selon différents critères Ouvrir la palette de couleur Fenêtres ouvertes juxtaposées Inverser la sélection : Sélectionne tous les atomes non sélectionnés par l’onglet AbC. Si vous faites *S puis inverser la sélection, vous sélectionnerez tous les atomes de l’enzyme. Modification de Modification de l’affichage de la l’aspect des liaisons. structure spatiale de la molécule Affichage des molécules dans des fenêtres juxtaposées Icônes d’aspect des atomes (sphères, étoiles, fil de fer…) Sélectionner une partie de la molécule : - *S : sélection de tous les atomes du substrat. - 145 : sélection de tous les atomes de l’acide aminé numéro 145. Pour sélectionner plusieurs acides aminés taper 34 ,145 ,67 (sélection des acides aminés 34, 145 et 67). Déplacer et explorer la molécule. a- Pour manipuler les molécules plus aisément, utiliser les raccourcis clavier et la souris : o rotation de la molécule : bouton gauche et déplacement de la souris ; o déplacement de la molécule : bouton droit maintenu enfoncé ; o zoom avant/arrière : rester appuyer sur ctrl et utiliser la roulette de la souris. b- Pour réinitialiser les paramètres d'origine de la molécule, cliquer sur le bouton Restaurer. c- Pour faire tourner automatiquement la molécule sur elle-même, cliquer sur le bouton Pivoter. d- Pour explorer le cœur de la molécule masqué par d’autres atomes : o Créer un plan de coupe de la molécule en cliquant sur le bouton Front. o Cliquer sur le bouton flèche de droite (à côté de Front), afin de déplacer ce plan en profondeur. o Cliquer sur le bouton flèche de gauche (à côté de Front), afin de reconstituer la molécule. Pour obtenir des informations sur un atome ou une partie de la molécule, cliquer sur la molécule ; des informations intéressantes, comme le type et le numéro de l'atome sélectionné, ainsi que le nom de la chaîne, le nom de l'acide aminé et son numéro (pour les protéines) s’affichent dans cette fenêtre.
