Éléments de biochimie 210-120-AH (hiver 2012) Laboratoire 41 Propriétés des glucides Buts : Caractériser des glucides par des tests d’identification chimiques Vérifier l’hydrolyse acide et enzymatique de certains glucides Théorie : Les glucides forment le groupe de composés organiques le plus abondant dans la biosphère. Tout organisme capable de photosynthèse (algues, plantes...) peut en produire des quantités parfois considérables à partir du CO2 atmosphérique et de l’énergie solaire. Source d’énergie pour les organismes vivants, sous forme immédiatement utilisable (glucose) ou sous forme de réserve (amidon, glycogène), les glucides jouent aussi un rôle structural important chez les plantes et les animaux (cellulose, chitine). Du point de vue chimique, on peut définir les glucides comme étant des polyhydroxyaldéhydes (aldoses) ou des polyhydroxycétones (cétoses). La chimie des glucides porte donc essentiellement sur l’étude de la réactivité des fonctions hydroxyles et carbonyles qui, coexistant dans une même molécule, conféreront à ces composés des propriétés particulières qu’il sera utile de connaître en vue de leur isolement, leur dosage et leur identification structurale. Voici un survol des classes de glucides, des réactions chimiques caractéristiques et une description des tests utilisés dans cette expérience. 1-Classification des glucides Selon qu’il s’agisse d’une fonction aldéhyde ou cétone, les glucides sont répartis en aldoses et cétoses. Pour chaque famille, on peut retrouver des sucres à 3, 4, 5 ou 6 carbones (7 et 8 carbones existent mais plus rares). Ces dernières catégories sont nommées trioses, tétrose, pentoses et hexoses. Le tableau de la page suivante montre des exemples de glucides pour les catégories utilisées dans de ce laboratoire. Une unité glucidique seule porte le nom de monosaccharide. Deux monosaccharides peuvent être condensés en une seule molécule appelée disaccharide. La nouvelle liaison formée porte le nom de lien glycosidique. Comme c’est le cas pour un lien peptidique, la formation d’un lien glycosidique entraîne la production d’une molécule d’eau : Monosaccharide + Monosaccharide Disaccharide + H2O Bien que souvent représentés sous une forme linéaire en projections de Fischer, les glucides adoptent en réalité une forme cyclique (voir page suivante). Cette forme cyclique, majoritaire, est en équilibre avec la forme ouverte. 1 Cétoses Hexoses Pentoses Aldoses 2 2-Réactions chimiques 2.1-Formation d’acétals En milieu acide, la fonction carbonyle se combine aux alcools pour donner des acétals : H OH H OH H H O R-OH HO HO H H + H2O HO H H OH H O HO HO OH H RO configuration Cette réaction s’effectue aussi bien avec les aldoses qu’avec les cétoses. Les dérivés formés seront de type et selon la configuration de l’anomère qui a réagi. 2.2-Oxydation La fonction aldéhydique ou cétonique des glucides est susceptible d’être oxydée. Dans le cas des cétoses, la réaction passe par une isomérisation du cétose en aldose avant de subir l’oxydation. Aldoses et cétoses vont donc se comporter comme des réducteurs. Certains oxydants agissent sélectivement sur l’une ou l’autre des extrémités (C1 ou C6), d’autres oxydent seulement les aldoses. Pour sa part, l’acide nitrique est assez puissant pour oxyder les deux extrémités : CHO H HO CHO H OH HO O2/Pt OH H OH H H OH H OH CH2OH H H OH I2/H2O COOH HNO3 H OH HO H H OH H OH COOH COOH COOH H HO OH H H OH H OH CH2OH 3 2.3-Réduction Un réducteur assez puissant tel que le sodium peut réduire un hexose en hexa-alcool. Ainsi, on obtient le sorbitol utilisé dans l’industrie alimentaire comme précurseur de synthèse de la vitamine C par la réduction du glucose ou du fructose : CHO H CH2OH OH HO H H 2H CH2OH OH HO C 2H H HO O H H OH H OH H OH H OH H OH H OH CH2OH CH2OH D-Glucose CH2OH Sorbitol (D-Glucitol) D-Fructose 2.4-Action des acides forts Un acide concentré et à chaud provoque le départ de plusieurs molécules d’eau à partir des aldoses et des cétoses en formant le furfural ou son dérivé selon qu’il s’agisse d’un pentose ou d’un hexose. Le furfural ou son dérivé réagissent ensuite avec les phénols pour donner des composés colorés utilisés dans plusieurs tests (cet item est décrit dans la section 3-Tests d’identification). 2.5-Action des bases diluées L’action d’une base diluée provoque des inter-conversions appelées épimérisations. Ainsi, lorsqu’on traite en milieu alcalin l’un des 3 sucres suivants, on observe la formation des 2 autres; un équilibre s’installe entre les 3 formes : CHO H HO OH H HO CHOH CH2OH CHOH COH C COH H HO O H HO CHO H HO H HO H H OH H OH H OH H OH H OH H OH H OH H OH H OH H OH CH2OH D-Glucose CH2OH CH2OH D-Fructose CH2OH CH2OH D-Mannose 4 2.6-Formation d’éthers Les fonctions alcools des glucides forment des éthers avec d’autres alcools en présence d’un catalyseur : H C OH + R-OH H C OR + H2O De telles réactions sont utilisées en analyse instrumentale afin de faciliter la séparation ou la détection des différents produits. 2.7-Formation d’esters Ces mêmes fonctions alcools forment aussi des esters avec des acides : H C OH + R-COOH H C OCOR + H2O La formation d’ester a permis autrefois l’élucidation de la structure de plusieurs sucres. En biochimie, on retrouve beaucoup d’esters phosphoriques (entre sucres et phosphate), ils sont à la base des processus de transfert et d’entreposage de l’énergie chimique. 3-Tests d’identification chimique utilisés lors de ce laboratoire 3.1-Test de Molisch L’essai de Molisch est utilisé depuis longtemps comme test général d’identification qu’une substance est de nature glucidique. Tous les glucides libres ou liés qui ont une structure supérieure aux tétroses, peuvent être transformés, en présence d’un acide fort, en furfural (pentoses) ou en hydroxyméthylfurfural (hexose). Ce dernier se condense à son tour avec le 1-naphtol pour produire des composés colorés sulfoniques (voir schéma page suivante). 5 3.2-Test de Bial Le test de Bial sert à détecter la présence d’un pentose. Ceux-ci sont dégradés en furfural en milieu acide chaud. Les pentoses qui possèdent 5 carbones sont décomposés de cette façon alors que les hexoses donnent plus difficilement des hydroxyméthylfurfurals. Certains sucres oxydés (glucuronate, galactoronate) peuvent réagir positivement à cet essai suite à une décarboxylation en pentoses. Le furfural dégagé entre à son tour en réaction avec un composé coloré obtenu à partir d’orcinol et de FeCl3. HCl conc. Pentose 3H2O chaleur + CHO O furfural OH + HO FeCl3 solution colorée OH Orcinol Composé bleu-vert 3.3-Test de Seliwanoff Le test de Seliwanoff sert à identifier les cétoses par la vitesse de déshydratation des glucides en hydroxyméthylfurfural. Les cétoses, moins stables dans ces conditions que les 6 aldoses, sont rapidement dégradés et l’hydroxyméthylfurfural produit se condense avec le résorcinol produisant ainsi une coloration rouge dans les premières minutes. Hexose HCl 3M HOH2C chaleur CHO + 3H2O O Hydroxyméthylfurfural OH OH Résorcinol Composé rouge Si la réaction est prolongée, tous les hexoses réagiront positivement. Le saccharose, libérant graduellement son fructose en milieu acide, réagira aussi positivement. 3.4-Test de Benedict ou Fehling Cet essai met en évidence le pouvoir réducteur de certains glucides. Il faut savoir que si tous les monosaccharides sont des sucres réducteurs, il n’en est pas ainsi avec tous les disaccharides. Seuls ceux présentant un carbone anomérique libre possède un pouvoir réducteur : Sucre réducteur (carbone anomérique libre) Sucre non réducteur (C anomérique engagé dans la liaison glycosidique) 7 Les sels cuivriques se prêtent bien à ces processus d’oxydoréduction. La réaction en jeu est la suivante : Glucide réducteur + 2Cu2+ chaleur 2Cu+ + Glucide oxydé 2OH- H2O + Cu2O oxyde cuivreux (ppté insoluble rouge) 2CuOH chaleur L’apparition du précipité rouge et la disparition de la coloration bleue du réactif indiquent la présence d’un sucre réducteur. 3.5-Test de Barfoed Cet essai met aussi en évidence le pouvoir réducteur des glucides mais sert plutôt à identifier les monosaccharides. Les monosaccharides réagissent beaucoup plus rapidement que les disaccharides ou oligosaccharides dans ces conditions d’oxydation. Toutefois, par hydrolyse en milieu acide, les oligosaccharides libèrent des unités monosaccharides et finissent par donner un résultat positif après un certain temps. RCHO (sucre) + 2 Cu(CH3COO)2 + 2H2O RCOOH (sucre oxydé) + Cu2Oppté + 4 CH3COOH Les monosaccharides donnent en deux minutes environ un précipité rouge d’oxyde de cuivre (Cu2O). 3.6-Test à l’iode Le test à l’iode est un test spécifique à l’amidon. Un complexe coloré se forme entre l’amidon et l’iode d’une coloration bleue intense par l’insertion des molécules de I2 à l’intérieur des hélices de l’amidon : 8 4-Hydrolyse de quelques glucides Les liens glycosidiques (entre les unités de monosaccharides) peuvent être coupés au cours de réactions hydrolytiques catalysées par des acides ou par des enzymes. Lors d’une hydrolyse acide, les polysaccharides libèrent d’abord des oligosaccharides qui graduellement seront scindés en monosaccharides. Certains polysaccharides résistent mieux à l’hydrolyse acide. L’hydrolyse d’un disaccharide donne ses monosaccharides constitutifs. L’hydrolyse enzymatique est beaucoup plus spécifique. L’alpha amylase de la salive humaine catalyse l’hydrolyse des liens α-(1-4) mais non l’hydrolyse des liens α-(1-6) ni des liens β. Il existe des enzymes spécifiques de la liaison glycosidique de certains disaccharides. Par exemple, la lactase catalyse l’hydrolyse du lactose en ses 2 constituants de base (cette réaction est utilisée dans l’industrie alimentaire pour éliminer le lactose dans certains aliments tels que des fromages). La réaction suivante, correspond à l’hydrolyse du saccharose (aussi appelé sucrose) produisant ce qu’on appelle aussi dans l’industrie alimentaire, le sucre « inverti » dû à l’inversion du pouvoir rotatoire (activité optique) au cours de la réaction : En utilisant les tests d’identification, il est possible de vérifier que l’hydrolyse s’est réellement produite et de caractériser les produits obtenus. Traitement des données et production du rapport 1. Format habituel pour le rapport. 2. Présentez les résultats sous la forme de tableaux. 3. Identifiez les inconnus en justifiant le choix en fonction des résultats. 4. Discutez des tests qui n’ont pas donné les résultats attendus. 9 5-Vue d’ensemble Labo-41a Iode Barfoed Benedict Bial Molisch Seliwanoff Identification des standards et des hydrolysats d'amidon et de saccharose : Glucose ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ Fructose ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ Xylose ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ Saccharose (sucrose) (2%) ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ Lactose ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ Amidon ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ Témoin positif ✔ Témoin négatif (H2O) ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ Examen de laboratoire1a Iode Barfoed Benedict Seliwanoff Molisch Bial Identification des inconnus et leurs hydrolysats : Inconnu 1 ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ Inconnu 2 ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ Témoin positif ✔ Témoin négatif (H2O) ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ 10 Matériel supplémentaires Bain-marie ajusté à 37°C Supports à éprouvettes Appareil Vortex Crayons marqueurs Gants de nitrile Tampons d’alcool Petites billes de verre pour l’ébullition Grosses billes de verre pour recouvrir les tubes Produits Boîte à réactifs contenant : o Réactif de Barfoed o Réactif de Bial o Réactif de Benedict o Réactif de Seliwanoff o Glucose 2% o Fructose 2% o Xylose 2% o Sucrose (saccharose) 2% o Lactose 2% o Amidon 1% Sucres en commun: o Sucrose (saccharose) solide o ARN 2mg/mL Réactifs en commun (sous les hottes): o Acide chlorhydrique concentré o Acide sulfurique concentré o Réactif de Molisch o Réactif d’iode 1% 11 La partie suivante a été rédigée à partir d’un protocole élaboré par Chantal Racine et Éric Atlan du département de biologie et de biotechnologies. ATTENTION! Certains réactifs utilisés dans ces tests sont dangereux et corrosifs. Séance 11a ☞ Préparation des hydrolyses o Dans un tube, déposer d’abord 10 mL d’eau, 1 cm3 de saccharose solide (sucrose) et 2 mL de HCl concentré (acide chlorhydrique). Bien agiter avec une tige de verre. o Dans un second tube, déposer d’abord 10 mL d’eau et ensuite 1 cm3 saccharose solide + 2 mL de salive. Bien agiter avec une tige de verre car le saccharose a tendance à se solidifier dans le fond du tube. o Répéter les 2 premières étapes en remplaçant le saccharose par l’amidon (1%). o Recouvrir les 4 tubes d’une paraffine. o Placez les éprouvettes dans un bain-marie thermostaté à 37°C et laisser réagir durant 90 minutes. o Réalisez les tests à raison de 2 mL d’hydrolysat par tube sauf celui de Molisch (voir tableau « vue d’ensemble »). 1. Test de Bial (identification d’un pentose) o Dans des éprouvettes identifiées, versez 2 mL de chacun des échantillons. o Ce test requiert un témoin positif, on ajoutera donc un autre tube contenant de l’acide ribonucléique (ARN), lequel contient un pentose. o Ajoutez à chaque échantillon 2 mL du réactif de Bial. Bien mélanger. Placez au bain-marie bouillant. o Après quelques minutes de chauffage, notez les échantillons présentant une coloration verte à bleue. 12 2. Test de Molisch (identification d’un glucide) o Dans des éprouvettes identifiées, versez 2 mL de chacun des échantillons. o Ajoutez à chacun 3 gouttes du réactif de Molisch. Bien mélanger. o Ajouter, sans agiter, 2 à 3 mL d’acide sulfurique concentré en faisant couler lentement l’acide sur la paroi de l’éprouvette afin d’obtenir 2 couches. o Laissez reposer 1 à 2 minutes (support à éprouvettes) et notez s’il y a formation d’une coloration violette (anneau violacé) à l’interface des 2 liquides. o Notez vos résultats sous la forme d’un symbole : -, , +, ++, +++. Notez bien la coloration, son intensité et la présence d'un solide. 3. Test de Seliwanoff (identification d’un cétose) o Dans des éprouvettes identifiées, versez 2 mL de chacun des échantillons. o Ajoutez à chaque échantillon 2 mL du réactif de Seliwanoff. Bien mélanger. Placez au bain-marie bouillant pour exactement 2 minutes. o Après 2 minutes, retirez les éprouvettes et notez celles présentant une coloration rose orangé. 4. Test de l'iode (identification des polysaccharides amidon et glycogène) o Dans des éprouvettes identifiées, versez 2 mL de chacun des échantillons. o Ajoutez 2-3 gouttes d’une solution d’iode à 1%. Bien agiter. Notez vos observations. 5. Test de Barfoed (identification d’un monosaccharide) o Dans des éprouvettes identifiées, versez 2 mL de chacun des échantillons. o Ajoutez à chaque échantillon 2 mL du réactif de Barfoed. Bien agiter. Placer au bain-marie bouillant pour exactement 2 minutes. o Après 2 minutes, retirez les tubes et notez vos observations. 13 6. Test de Benedict (identification des sucres réducteurs) o Dans des éprouvettes identifiées, versez 2 mL de chacun des échantillons. o Ajoutez 2 mL du réactif. Agitez et placez au bain-marie bouillant de 3 à 5 minutes (notez le temps ou la quantité de ppté). o Le milieu réactionnel devrait être neutralisé surtout dans le cas des hydrolyses acides avant d’ajouter le réactif. 14