Projet de construction d`une puce pan

Projet de construction d’une puce pan-génomique thématique et d’étude de
profils génomiques
Résumé :
Le projet consiste en construire une puce à ADN pan génomique thématique puis à l’utiliser
pour caractériser le contenu en gènes d’intérêt de 80 souches.
Etapes du projet :
Etape 1 : Dessin des amorces
Le laboratoire DGIMI dispose des génomes de 8 souches bactériennes :
-
2 génomes en libre accès dans les bases de données internationales (génomes publics),
-
3 génomes d’accès confidentiel dont la séquence est achevée (génomes privés
achevés),
-
3 génomes d’accès confidentiel en cours de séquençage au moment de la publicité
(génomes privés en cours de séquençage).
A partir de ces 8 génomes bactériens, un puce à ADN (technologie Agilent technologies)
devra être construite. Cette puce représentera entre 500 et 1000 gènes d’intérêt. Pour cela, le
laboratoire DGIMI fournira au prestataire au format fasta la séquence des 8 génomes
concernés ainsi que la liste des séquences des gènes d’intérêt. A partir de cette liste, le
prestataire dessinera un ou plusieurs oligonucléotides d’environ 60 nucléotides qui
représenteront de façon unique chaque gène d’intérêt. La détermination de la séquence des
oligonucléotides sera faite selon l’interface eArray (Agilent technologies). Dans le cas où la
détermination d’un oligonucléotide représentant de façon unique un gène d’intérêt sera
impossible à cause de la trop grande conservation des séquences nucléotidiques, le prestataire
dessinera des oligonucléotides correspondant à une famille de gènes d’intérêt. Le prestataire
devra également vérifier que les oligonucléotides n’hybrident pas ailleurs sur les génomes
bactériens. Des échanges entre le prestataire et le laboratoire DGIMI devront permettre de
valider le choix des oligonucléotides avant d’engager l’étape de synthèse in situ des
oligonucléotides.
Remarque : si au démarrage du projet, le séquençage d’un ou plusieurs des 3 génomes privés
en cours de séquençage n’est pas achevé, le dessin des amorces s’effectuera sur les cinq
génomes disponibles pour la construction et le test de la puce témoin (étape 2). Une seconde
phase de dessin d’oligonugléotides pour le ou les derniers génomes privés en cours de
séquençage devra alors être effectuée avant la construction des puces analytiques.
Etape 2 : Production d’une puce témoin et hybridations témoins
Le prestataire commencera par faire produire une puce témoin (format désiré : 8 x 15K). Avec
cette puce témoin, le prestataire effectuera des hybridations avec l’ADN génomique des 8
souches dont les génomes sont déjà séquencés.
Outre les résultats des contrôles qualité usuels (qualité des marquages fluorescents, validation
de l’hybridation selon les critères donnés par le rapport après lecture de la lame), le prestataire
fournira à l’issue de cette hybridation test, un fichier Excel pour chaque hybridation avec la
valeur de l’intensité normalisée d’hybridation pour chaque oligonucléotide. Le laboratoire
DGIMI se servira de ces premières données pour contrôler la fiabilité des résultats qui devront
être en accord avec la séquence des génomes correspondants. Le passage à l’étape 3 est
conditionné par le succès de ce contrôle.
Dans le cas où ce contrôle serait négatif, une discussion devra être entreprise entre le
laboratoire et le prestataire pour redéfinir les conditions d’expérimentation.
Dans le cas où ces tests seraient positifs, les hybridations témoin seront utilisées par le
laboratoire DGIMI pour définir des seuils d’intensité d’hybridation normalisée caractérisant
des gènes absents ou présents. Ces seuils seront fournis au prestataire pour la suite des
analyses.
Etape 3 : Production des puces analytiques et étude des profils de gènes de 80 souches
(étape réalisée uniquement si les tests de l’étape 2 sont positifs)
Les ADN génomiques restants seront préparés par le laboratoire DGIMI et envoyés au
prestataire par lot de 8 ou d’un multiple de 8. Les hybridations seront menées par le
prestataire selon les conditions définies lors des tests préalables de l’étape 2. A partir des
données d’hybridation interprétées selon les seuils définis par le laboratoire DGIMI dans
l’étape 2, le prestataire établira une classification des souches en fonction de la présence et de
l’absence des gènes représentés sur la puce.
Echéancier :
Juin
2011
Juil.
2011
Août
2001
Sept.
2011
Oct.
2011
Nov.
2011
Déc.
2011
Janv.
2012
Dessin amorces puce
Synthèse puce « témoin »
Hybridations « témoin »
Analyse hybridations
témoin
Synthèse puces
analytiques et hybridation
ADNg
Analyse et validation
PCR
DGIMI
Prestataire « Puces à ADN »
lot1
lot2
lot3