Conservation des Fonctions de la Protéine Vpx Issue de Différents

1
Master 2 de Biologie Cellulaire, Moléculaire et Oncologie,
spécialité Biologie Moléculaire et Cellulaire
Ecole Normale Supérieure de Lyon
Rapport technique, Juin 2005
Lise RIVIERE
Conservation des Fonctions de la Protéine Vpx Issue de
Différents Lentivirus de Primates dans l'Infection des
Cellules Dendritiques Humaines
Directeur de recherche: Dr Jean Luc Darlix
Tuteur: Dr Andrea Cimarelli
LaboRetro
Unité de Virologie Humaine Inserm U412
Ecole Normale Supérieure de Lyon
46, allée d'Italie
69364 LYON cedex 07
Jury :
Dr Branka HORVAT
Dr Eric WATTEL
Dr Ioan NEGRUTIU
REMERCIEMENTS:

2
Je tiens à remercier Jean Luc Darlix de m’avoir accueillie dans son équipe pour mon
stage de master 2.
Merci beaucoup à Andrea Cimarelli qui m’a encadrée pendant ce stage.
Je remercie aussi Caroline Goujon ainsi que Lorraine Jarrosson-Wuillème pour leur
aide et leurs conseils.
Enfin, je remercie tous les membres du Labo Rétro pour leur sympathie.
SOMMAIRE:
Résumé.................................................................................................................................1
Introduction...........................................................................................2
Matériels et Méthodes..............................................................................7
Résultats...............................................................................................12
La transduction de cellules dendritiques humaines par SIVmac peut être restaurée par
les Vpx de différents lentivirus de primates.......................................................................12
La protéine Vpr peut elle avoir la même fonction que Vpx dans la transduction des DCs
Humaines par SIVmac, chez des lentivirus ne possédant pas Vpx ?..................................14
Y a-t-il une relation entre l’adaptation d’une souche à l’humain et son indépendance à
Vpx ou Vpr pour infecter les DCs ?...................................................................................15
Discussion.............................................................................................17
Références.............................................................................................20RESU
ME:

3
Les lentivirus sont une sous-famille des retroviridae et comprennent le virus de
l'immunodéficience humaine (HIV) ainsi que de nombreuse souches de SIV, son homologue
simien. Ils possèdent, en plus des gènes structuraux et enzymatiques gag, pro-pol et env
présents chez tous les rétrovirus, des gènes accessoires dont vpr et chez certaines souches vpx,
issu de la duplication de vpr. Vpr et Vpx sont incorporés dans les virions grâce à une
interaction avec un domaine conservé de Gag. Chez les lentivirus ne possédant pas Vpx tels
que HIV-1, Vpr possède deux fonctions principales: elle provoque l'arrêt du cycle cellulaire
en phase G2/M, et participe à l'import nucléaire de l'ADN proviral, permettant l'infection de
cellules en arrêt de division, ces deux fonctions étant réparties entre Vpr et Vpx
respectivement, chez les souches de lentivirus qui possèdent les deux protéines.
Des résultats obtenus au laboratoire ont clairement montré que Vpx était nécessaire à
l'infection des cellules dendritiques (DCs) mais pas d’autres cellules dont les macrophages
humains par une souche de SIV infectant le macaque (SIVmac). Le fait que Vpx soit
nécessaire dans l’infection des DCs mais pas des macrophages bien que ces deux types
cellulaires ne se divisent pas suggère que Vpx pourrait avoir une autre fonction, différente de
l’import nucléaire. Etant donnée l’importance des DCs dans la pathogénèse du HIV in vivo
nous avons décidé de caractériser plus précisément ce blocage. En parallèle d’autre études
menées au laboratoire pour caractériser précisément l’effet de Vpx du SIVmac sur les DCs,
nous avons aussi voulu déterminer si des Vpx issus de différentes souches de SIV et de HIV-2
partageaient des fonctions similaires à celle de Vpx du SIVmac dans l'infection des DCs.
Nous avons pour cela utilisé des vecteurs lentiviraux SIVmac minimaux (dépourvus de gènes
accessoires) auxquels ont été apportés en trans les différents Vpx à tester, puis évalué leur
capacité à infecter des DCs. Nous avons ainsi montré que la fonction de Vpx impliquée dans
l'infection des DCs était conservée chez les souches de SIV proches du SIVmac. Vpx du HIV-
2 en revanche ne semble pas partager ces fonctions, bien que HIV-2 appartienne à la même
lignée que SIVmac. L'adaptation du HIV-2 à l'humain pourrait lui permettre de surmonter un
blocage dans l'infection des DCs humaines, de même que HIV-1 qui est capable d'infecter les
DCs sans Vpr ni aucune autre protéine accessoire. Le cas du HIV-2 semble pourtant différent
puisqu'une délétion touchant vpx, vif et peut être des sites d'épissage de vpr abolit sa capacité
à infecter les DCs et celle-ci n’est pas restaurée par l’apport en trans de Vpx du HIV-2,
suggérant qu’une autre protéine telle que Vpr ou Vif pourrait jouer un rôle dans l’infection
des DCs par HIV-2.

4
INTRODUCTION:
Le virus de l'immunodéficience humaine (HIV), l'agent causal du SIDA (syndrome de
l'immunodéficience acquise) et son homologue simien SIV appartiennent à la sous-famille
rétrovirale des lentivirus. Comme tous les rétroviridae, les lentivirus sont des virus
enveloppés, possédant un génome ARN simple brin de polarité positive, ayant la particularité
d'être rétrotranscrit au cours du cycle réplicatif en ADN proviral double brin, puis intégré
dans le génome de la cellule hôte. Le génome des lentivirus de primates comprend les 3 gènes
principaux présents chez tous les rétrovirus: gag, pro-pol et env. Gag et pro-pol codent des
polyprotéines clivées pas la protéase virale pour donner les protéines structurales sous leur
forme mature (MA: matrice, CA: capside, NC: nucléocapside et p6 issues de Gag), et les
enzymes virales (PR: protéase, RT: transcriptase inverse et IN: intégrase issues de Pro-Pol).
Env code une polyprotéine clivée par une enzyme cellulaire en deux sous unitées: SU
(surface) et TM (transmembanaire). Les lentivirus possèdent, en plus de ces 3 gènes, des
gènes accessoires et régulateurs (tat, rev, nef, vif, vpu, vpr et chez certaines souches de
lentivirus vpx) (fig. 1A). Le cycle réplicatif viral débute par la reconnaissance entre la
glycoprotéine d'enveloppe du virus et le récepteur de la cellule cible, permettant la fusion des
membranes virale et cellulaire puis la libération dans le cytoplasme d'un complexe
nucléoprotéique contenant l'ARN génomique et des protéines virales. L'ARN génomique est
rétrotranscrit en ADN proviral à l'intérieur de ce complexe par la transcriptase inverse puis
importé dans le noyau. Chez les lentivirus, contrairement aux rétrovirus dits simples, cet
import se fait de façon active à travers les pores nucléaires car l'ADN proviral est associé à
des protéines virales aux propriétés nucléophiliques, dont Vpr, MA et IN. Les lentivirus,
contrairement aux autres rétrovirus, sont donc capables d'infecter des cellules qui ne se
divisent pas. L'ADN proviral, une fois importé dans le noyau, est intégré dans le génome de la
cellule hôte grâce à l'intégrase virale, ce qui marque la fin des phases précoces de l'infection.
Les phases tardives ont ensuite lieu avec l'expression du génome viral et la production des
protéines virales qui s'assemblent avec l'ARN génomique pour former de nouvelles particules
virales, libérées de la cellule (fig. 1B, ).
Si HIV provoque le SIDA chez l'humain, ce n'est pas le cas pour la plupart des souches de
lentivirus. Il existe en effet de nombreuses souches de SIV (fig. 2) qui infectent naturellement
diverses espèces de singes sans causer de pathologie mais c'est la transmission d'une souche
de SIV à une nouvelle espèce de primate qui cause souvent une immundéficience grave. Ainsi

5
le SIDA humain est la conséquence de la transmission du SIV à l'homme qui a donné
naissance au HIV, un nouveau virus adapté à l'humain. Les deux grands types de HIV (HIV-1
et HIV-2) sont issus de deux souches de SIV différentes (SIVcpz du chimpanzé et SIVsm du
singe sooty mangabey, respectivement) ayant été transmises à l'humain à plusieurs reprises et
de façon indépendante (). Les zoonoses (passage d'un virus à une nouvelle espèce), souvent
délétères, peuvent se produire si le virus d'origine est capable de s'adapter à un nouvel hôte,
mais sont cependant limitées par des barrières d'espèces. Parmi ces barrières, des facteurs de
restriction cellulaires récemment décrits sont capables de limiter l'infection par des lentivirus
de primates, de façon spécifique pour chaque espèce hôte. C'est le cas du facteur cellulaire
Trim5alpha, responsable de la restriction à l'infection par HIV-1 dans certaines cellules de
singe et qui pourrait expliquer le fait que HIV-1 ne puisse pas infecter les singes à l’exception
du chimpanzé dont il est originaire. Le mécanisme d'action de ce facteur, encore mal connu,
cible la capside virale après son entrée dans la cellule et bloque l'infection à une étape
antérieure à la transcription inverse qui pourrait impliquer la déstabilisation du complexe
nucléoprotéique entrant (, ). Des protéines accessoires virales peuvent cependant, dans
certains cas, permettre aux virus de s'adapter aux facteurs cellulaires. C'est notamment le cas
de la protéine Vif du HIV-1 qui permet de protéger le virus contre APOBEC3G, un facteur
cellulaire antiviral responsable d'hypermutations dans l'ADN proviral néosynthétisé (, , ).
Un blocage de l'infection par SIVmac, levé par la protéine accessoire Vpx, a été mis en
évidence au laboratoire, dans l'infection des cellules dendritiques (DCs) humaines. Les DCs
sont des cellules présentatrices d'antigène, cibles de HIV in vivo qui jouent un rôle important
dans l'infection puiqu'elles font partie des premières cellules infectées par le virus et
permettent sa dissémination et sa transmission aux lymphocytes T (). Le gène vpx n'est
présent que chez certaines souches de SIV et chez HIV-2 (fig. 2). Vpx est issu de la
duplication de vpr, un autre gène accessoire présent chez tous les lentivirus de primate (). Ces
deux gènes codent des protéines de 112 et 96 acides aminés, respectivement, qui sont
incorporées dans les particules virales via une interaction avec le domaine p6 de la protéine
structurale Gag (, ). Chez les lentivirus qui, comme HIV-1, ne possédent pas Vpx, Vpr a deux
fonctions principales. Elle provoque d'une part l'arrêt du cycle cellulaire en fin de phase G2,
ce qui pourrait permettre de garder un environnement cellulaire favorable à la transcription
virale (, ). D'autre part Vpr joue un rôle dans l'import nucléaire de l'ADN proviral, étape
nécessaire pour l'infection de cellules qui ne se divisent pas telles que les macrophages ou les
cellules dendritiques (, , ). Chez les lentivirus possédant à la fois Vpr et Vpx, comme HIV-2
ou SIV du macaque (SIVmac), ces fonctions sont séparées entre les deux protéines (): Vpx