Le lactosérum - microbiologie

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TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
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Le lactosérum
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1. CONTROLE DE CERTAINS CRITERES MICROBIOLOGIQUES
1.1. Dénombrement des coliformes à 30°C
Préciser le volume ensemencé dans chaque boîte : dénombrement dans la masse donc v = 1 mL.
Analyser la composition du milieu VRBL fournie ci-dessous.
VRBL
peptone
extrait de viande
lactose
désoxycholate de sodium
cristal violet
rouge neutre
chlorure de sodium
agar
source de C, N, acides aminés
source de C, N, facteurs de croissance
source de C et d’énergie (glucide dont on teste l’utilisation dans le milieu)
inhibiteur (sélection des bactéries « intestinales »)
inhibiteur des bactéries Gram +
indicateur coloré de pH
faible concentration  pression osmotique
agent solidifiant
Justifier le choix de ce milieu pour dénombrer les coliformes.
Les coliformes sont des entérobactéries fermentant le lactose avec production de gaz à 30°C.
Le milieu VRBL contient des inhibiteurs permettant la sélection des bacilles Gram – non exigeants.
La fermentation du lactose par les coliformes entraîne une acidification révélée par le rouge neutre : les
colonies de coliforme sont rouge foncé et entouré d’un halo de précipitation des sels biliaires.
1.2. Recherche de Salmonella
Indiquer les agents sélectifs présents dans le milieu Rappaport-Vassiliadis :
vert malachite
chlorure de magnésium hexahydraté
36 mg
37,3 g (forte concentration)
Le milieu Rappaport-Vassiliadis est un milieu d'enrichissement des salmonelles. Il favorise la
multiplication de ces bactéries au détriment des autres, et permet donc de les isoler plus facilement.
2. IDENTIFICATION
D’UNE
SOUCHE
ISOLEE
AU
COURS
DE
L’ANALYSE
D’UN
ECHANTILLON DE LACTOSERUM NON CONFORME
Examens microscopiques :

Etat-frais : bacilles isolés mobiles (ciliature péritriche)

Coloration de Gram : bacilles isolés , aux bouts arrondis, Gram négatif, coloration
homogène. Un seul type de bactérie : la souche semble pure.
Test enzymatique : oxydase (car bacilles Gram –) => test négatif (pas de coloration violette du disque).
Orientation : bacilles Gram – non exigeants, oxydase –, ciliature péritriche
=> orientation vers la famille Enterobacteriaceae.
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Choix des milieux :
-
GTS pour vérifier la pureté,
-
VF pour déterminer le type respiratoire,
-
Hugh et Leifson + glucose 1% pour déterminer la voie d’attaque du glucose,
-
microgalerie API 20E pour identifier l’espèce.
3. RECHERCHE DE LA PRESENCE D’ANTIBIOTIQUE
Préciser la dilution effectuée et le volume utilisé pour l’ensemencement de la gélose.
Le bouillon contenant Micrococcus présente une concentration Ci = 109 bactéries.mL-1.
La concentration dans la gélose (Vf = 40 mL) doit être Cf = 105 bactéries.mL-1.
Le volume de culture Vi (sans faire de dilution) à ajouter dans la gélose serait :
Vi = Vf . Cf / Ci = 40 x 105 / 109 = 0,004 mL (soit 4 µL).
Pour travailler avec un volume plus important, il faut réaliser des dilutions décimales de la culture (100).
Dans les 40 mL de gélose MH, il est donc possible d’inoculer (au choix, selon le matériel disponible) :

40 µL de 10-1 (volume encore trop faible)

400 µL de 10-2 (volume convenable)

4 mL de 10-3 (1/10e du volume final = limite)
Pourquoi trois des six puits contiennent également de la solution de pénicillinase ?
La pénicillinase est une enzyme catalysant l’hydrolyse de la pénicilline (antibiotique recherché dans le
lactosérum) : elle permet d’identifier la pénicilline éventuellement présente dans les échantillons. En
effet, la présence d’un halo d’inhibition autour d’un puits sans pénicillinase signifie seulement que
l’échantillon contient un agent antimicrobien. En présence de pénicillinase, ce halo d’inhibition sera
absent seulement si cet agent antimicrobien est la pénicilline.
Résultats possibles :
Puits contenant l’échantillon seul
Puits contenant l’échantillon et la Interprétation
pénicillinase
Pas de halo d’inhibition
Pas de halo d’inhibition
Pas d’agent antimicrobien détectable
Halo d’inhibition
Pas de halo d’inhibition
Présence de pénicilline
Halo d’inhibition
Halo d’inhibition
Présence
d’agent(s)
antimicrobien(s)
dont au moins un n’est pas la pénicilline
Pas de halo d’inhibition
Halo d’inhibition
Erreur de manipulation
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1. CONTROLE DE CERTAINS CRITERES MICROBIOLOGIQUES
1.1. Dénombrement des coliformes à 30°C
1) Tableau de résultats
100
10-1
UFC / boite (essai 1)
45
5
UFC / boite (essai 2)
49
4
Somme
94
9
Dilution
2) Choix des boîtes
Le nombre de colonies obtenues (entre 15 et 300) avec la dilution 100 est utilisable pour
calculer le résultat du dénombrement.
3) Formule AFNOR
ΣC = somme des colonies sur les boites exploitables,
d = dilution,
v = volume de l’inoculum,
n1 et n2 = nombre de boites choisies pour chaque dilution.
4) Résultat
NUFC/mL = 4,7.101 UFC.mL-1 (pour la suspension mère).
Cette suspension mère a été préparée en mélangeant 10 g de poudre à 90 mL de tryptone-sel.
On peut donc considérer qu’elle constitue une dilution au 10e du lactosérum en poudre.
NUFC/g = 47 x 1/10-1 = 4,7.102 UFC.g-1 (pour le lactosérum en poudre = produit « pur »)
5) Conclusion
Le nombre de coliformes par gramme de produit est de 470, il dépasse la norme de 25 (et le
seuil maximal égal à 10 fois la norme de 250) : on peut donc conclure que le lactosérum
n’est pas conforme aux normes microbiologiques en vigueur.
3.1. Recherche de Salmonella
Décrire les colonies obtenues sur milieux Hektoen et XLD.
En déduire le(s) caractère(s) biochimique(s) des bactéries formant ces colonies.
Hektoen :
Colonies bleues (alcalinisation) donc lactose -, saccharose -, salicine - ; à centre noir donc H2S +.
 suspicion de Salmonella
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XLD :
Colonies rouges (alcalinisation) donc LDC +, lactose -, saccharose -, xylose - ; à centre noir donc H2S +.
 suspicion de Salmonella
En cas de suspicion de Salmonella, effectuer un test de discrimination rapide.
5 colonies suspectes subissent un test « uréase rapide » en milieu urée-indole.
Après 2 heures d’incubation, on n’observe aucune alcalinisation du milieu (milieu orange) : uréase -.
Conclure quant à l’éventuelle présence de Salmonella et décrire la démarche à adopter pour
confirmer le diagnostic.
Les résultats obtenus orientent le diagnostic vers Salmonella : le contenu des 5 tubes « uréase rapide » est
repiqué sur gélose ordinaire (incubée 24h à 37°C). Les 5 souches ainsi repiquées seront identifiées par
ensemencement d’une galerie API 20E, puis un sérotypage serait réalisé le cas échéant.
Si l’identification de Salmonella était confirmée, le critère microbiologique étant « absence dans 100
grammes », on pourrait conclure à nouveau à la non conformité du produit.
A l’aide de la fiche technique fournie page suivante, expliquer l’intérêt du milieu SMID par rapport
au milieux SS, Hektoen, XLD…
Les colonies de Salmonella sur gélose SMID sont roses. Ceci est dû à l’utilisation du glucuronate (virage
de l’indicateur coloré de pH au rose). Cette caractéristique permet d’identifier directement le genre
Salmonella, et de le distinguer des autres entérobactéries notamment des coliformes qui forment des
colonies bleues sur ce milieu (-galactosidase +).
Autre milieu « moderne » : gélose Rambach
Les colonies de Salmonella sur gélose Rambach sont rouges. Ceci est dû à la libération d’acides suite à
l’utilisation du propylène glycol (virage de l’indicateur coloré au rouge). Cette caractéristique permet
d’identifier clairement le genre Salmonella, et de le distinguer des autres entérobactéries.
2. IDENTIFICATION D’UNE SOUCHE ISOLEE AU COURS DE L’ANALYSE D’UN ECHANTILLON
DE LACTOSERUM NON CONFORME
Rappel 1er jour : bacilles Gram – non exigeants, oxydase –, ciliature péritriche
 forte suspicion pour la famille Enterobacteriaceae.
Lecture 2e jour :
Isolement : un seul type de colonie, la souche est donc pure et la galerie est exploitable. Les colonies
obtenues sont ocres, lisses et brillantes (de type S), semi-bombées à contour régulier, de contour régulier.
Type respiratoire : culture dans tout le milieu VF => bactérie aéro-anaérobie facultative.
Voie d’attaque du glucose : le milieu de Hugh et Leifson a viré au jaune entièrement => voie d’attaque
du glucose fermentative.
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Confirmation :
bacilles Gram – non exigeants, oxydase –, ciliature péritriche, AAF et fermentant le glucose
 famille Enterobacteriaceae
Identification de l’espèce :
API 20 E : Enterobacter aerogenes ; %id = 92 % ; T= 0,8.
3. RECHERCHE DE LA PRESENCE D’ANTIBIOTIQUE
Résultats et interprétations :
Puits
Puits contenant l’échantillon
Puits contenant l’échantillon
seul
et la pénicillinase
Halo d’inhibition : la souche
Témoins
de Micrococcus est bien
sensible à la pénicilline.
L’activité de la pénicillinase
utilisée est satisfaisante : elle
« annule » l’effet de la
d’agent antimicrobien
Pas de halo d’inhibition
détectable.
B
Halo d’inhibition : présence
d’agent(s) antimicrobien(s).
VALIDATION DE LA
MANIPULATION
pénicilline sur Micrococcus.
Pas de halo d’inhibition : pas
A
Conclusion
Pas de halo d’inhibition :
présence uniquement de
pénicilline.
L’ECHANTILLON A EST
CONFORME
L’ECHANTILLON B N’EST
PAS CONFORME