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T.P. : ELECTROPHORÈSE D’A.D.N. EN TERMINALE S
I - NIVEAU ET INSERTION DANS LE PROGRAMME

Niveau : terminale S, enseignement de spécialité.
 Extrait de programme :
- B.O. H.S. n°5 du 30 août 2001 -
La révolution technologique du début des années 70
- L'utilisation des enzymes de restriction ouvre la voie du clonage des gènes et de leur séquençage. En contribuant à une
évolution importante du concept de gène et de la perception du polymorphisme, elle fait entrer la génétique dans l'ère
des biotechnologies.
II - PRINCIPE ET OBJECTIF

Principe : digestion de l'ADN d'un phage  par des enzymes de restriction et électrophorèse.

Objectifs :
- acquérir les connaissances de base sur la technique du Southern Blot,
- découvrir des propriétés des enzymes de restriction et envisager l'intérêt de leur utilisation.
III - COMPOSITION DU KIT SORDALAB
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3 solutions d’A.D.N. saumon :
–
–
–
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solution non diluée,
1
solution diluée au /8 ,
1
solution diluée au /8 et EcoR1.
Tampon pH=8,3 (technique de gel immergé),
Agarose,
Bleu de dépôt (= bleu de bromophénol + xylène de cyanol)
Azure A = colorant de l’ADN,
Mini-pasteurettes (micro-pipettes P200).
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3 solutions d’ADN de phage  :
–
–
–
ADN phage  + EcoR1,
ADN phage  + Hind III,
ADN phage  + EcoR1 + Hind III.
Société Sordalab - ZA des Poupettes - 91580
Villeneuve Sur Auvers
Tél. : 01.69.92.26.72 - Fax : 01.69.92.26.74 - site :
www.sordalab.com
mail : [email protected]
IV - ENVIRONNEMENT NECESSAIRE
-
cuve à électrophorèse pour A.D.N. (voltage = 90 V ; il doit toujours être inférieur à 150V),
micro-pipettes P 20, P50, P 1000 et cônes adaptés,
eau distillée,
pipettes, éprouvettes graduées,
four micro-ondes,
400 mL d'éthanol 20%,
alcool 70°,
appareil photo numérique / flexcam+TV.
Les cuves et générateurs sont à se procurer auprès des sociétés Jeulin ou Pierron. Les micropipettes et leurs cônes pourront
être achetés auprès de Sordalab ou Biorad.
Stage Génétique au lycée
Myriam Vial
V - PRINCIPE DE CETTE ELECTROPHORESE
L'A.D.N. est une molécule acide ; dans un tampon à pH=8,3 (donc basique), elle sera chargée négativement.
Les fragments d'A.D.N. ayant des charges respectives quasi-équivalentes migreront dans le champ électrique plus ou
moins rapidement en fonction de la masse moléculaire, donc en fonction de leur taille. Plus les fragments sont de
petite taille, plus ils migreront rapidement dans le gel, donc se déplaceront loin de leur point de départ.
Montage expérimental
Disposez les puits du côté de la cathode 

Suivi de la migration des fragments d'A.D.N. :
Il se fait grâce à un colorant de charge : le bleu de dépôt, qui :
–
–
alourdit les séquences d’ADN : coulent mieux au fond du puits,
permet le repérage de la migration des séquences dans le gel :
• bleu de bromophénol : front de migration,
• xylène cyanol : dernières séquences en train de migrer.

Coloration de l'A.D.N. :
Le colorant utilisé est l'azure A. Il est moins sensible que le bromure d'éthydium, mais n'est pas cancérigène.

Phage  :
• bactériophage (E. coli) ;
• ADN bicaténaire de 48 502 nucléotides, séquencé (sites de coupure d’EcoR1 et Hind III connus).
VI - MANIPULATION
La veille :
− Couler les gels, après fabrication,
− Préparation de l’ADN de saumon,
− Préparation du tampon,
− Préparation de l’Azure A.
Travaux à réaliser par les élèves :
− Ajouter le bleu de dépôt dans les solutions
d'A.D.N.,
− Mettre en place le gel dans la cuve,
− Verser le tampon (technique du gel
immergé),
− Effectuer les dépôts.
Dépôts :
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Puits 1 : ADN de saumon,
Puits 2 : ADN de saumon dilué au 1/8,
Puits 3 : ADN de saumon dilué au 1/8 + EcoR1,
Puits 4 : ADN du phage  + EcoR1,
Puits 5 : ADN du phage  + Hind III,
Puits 6 : ADN du phage  + EcoR1 + Hind III

Protocole :
-
Ajouter 13 μL de bleu de dépôt au 100 μL de solution d’ADN de phage λ, et agiter très délicatement.
-
Changer le cône et ajouter 67 μL de bleu de dépôt au 500 μl d’ADN de Saumon, puis agiter.
-
Déposer 20 μL de chaque solution dans les puits :
1 = ADN de saumon
2 = ADN de saumon dilué au 1/8
3 = ADN de saumon 1/8 + EcoR1
4 = ADN phage λ + Eco R1
5 = ADN phage λ + HindIII
6 = ADN phage λ + Eco R1 + HindIII
-
Démouler le gel en sortant le gel de la boite de coulage et en enlevant le peigne (matériel Pierron) / en enlevant
le peigne et l’adhésif (matériel Jeulin). Placer le gel dans la cuve, puits côté cathode sur le fond blanc.
-
Remplir chaque compartiment de la cuve avec le tampon TBE,
-
Fermer la cuve.
-
Relier la cuve au générateur et régler la tension sur 90 V.
-
Arrêter la migration lorsque le front de migration est à 1 cm de l’extrémité du gel (45 à 60 min).
-
Sortir le gel à l’aide la pelle et l’immerger dans le colorant Azure A pendant 5 min en agitant légèrement.
-
Vider le colorant réutilisable.
-
Éliminer l’excès de colorant de la surface avec quelques mL d’alcool à 70 % pendant quelques secondes.
-
Éliminer l’alcool et rincer à l’eau plusieurs fois pour totalement éliminer le colorant.
-
Attendre quelques minutes pour une révélation discrète (maximale après quelques heures).
Remarque : On peut réaliser une nouvelle étape de coloration-décoloration si le gel est trop clair.
Le gel peut être conservé au réfrigérateur pendant 2 mois (dans un récipient en plastique fermé hermétiquement
avec un peu d’eau distillée au fond) et être observé sur un rétroprojecteur.
VII - PISTES D'EXPLOITATION DES RESULTATS
1°) Données à propos des fragments de restriction :
L'A.D.N. utilisé est l'A.D.N. d'un phage  digéré par 2 enzymes de restriction : EcoR1 et Hind III. L'A.D.N. du
phage  étant de 49 kb, donc de petite taille, le nombre de fragments de restriction obtenus à l'issue de(s) action(s)
enzymatique(s) sera peu important.
a) - EcoR1 et phage  : EcoR1 coupe la molécule d'A.D.N. chaque fois qu'elle rencontre la séquence
GAATTC.
5’—G—A—A—T—T—C—3’
3’—C—T—T—A—A—G—5’
L’ADN du phage  est coupé, par Eco R1, aux positions : 21 226 ; 26 104 ; 31 747 ; 39 168 ; 44 972.
b) Hind III - phage  :
Hind III coupe la molécule d'A.D.N. chaque fois qu'elle rencontre la séquence AAGCTT.
5’—A—A—G—C—T—T—3’
3’—T—T—C—G—A—A—5’
Cette enzyme coupe l’ADN du phage  aux positions : 23 130 ; 25 157 ; 27 479 ; 36 895 ; 37 459 ; 44 141.
2°) Utilisation de ces données pour prévoir les résultats :
- A partir des données concernant l'action des enzymes de restriction, EcoR1 et Hind III, indiquez en justifiant
votre réponse le nombre de fragments de restriction obtenus :
- à la suite de l'action de chacune d'elle sur l'ADN du phage ,
- puis à la suite de l'action conjointe des 2 enzymes sur ce même A.D.N.
-
Schématisez la disposition des fragments de restriction telle qu'elle devrait apparaître en fin d'électrophorèse.
3°) Interprétation des résultats des électrophorèses : - Cf. fiche Sordalab - Comparez les résultats aux prévisions que vous avez faites. Essayez d'expliquez les différences observées si elles
existent. Remarque : on pourra utiliser des photographies de résultats non conformes aux attentes.
- Expliquez le résultat obtenu pour l'ADN de saumon.
4°) Autre activité possible : calcul de la taille des fragments d'A.D.N. :
Cela peut se faire à partir d'une électrophorèse bien réussie.
Si l'on connaît, par exemple, la taille des fragments obtenus suite à l'action d'Eco R1, on peut calculer la taille des
fragments observés après action de l'enzyme Hind III.
Pour ce faire, il faut construire une courbe étalon : log (T) = f(d), où T désigne la taille des fragments et d, la distance
parcourue par le fragment au sein du gel (exprimée en mm).
On peut ensuite déterminer graphiquement, à partir de cette courbe et de la distance parcourue par le fragment et
mesurée sur le gel, la valeur log(T). Le calcul permettra d'obtenir T, la taille du fragment.
5°) Activité qui peut être réalisée par le professeur :
- Téléchargez la séquence complète de l'A.D.N. du phage  à partir d'une banque de données (Genbank ; adresse :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
- Repérez les sites de coupure à l'aide de la fonction "Rechercher" de Word ou autre logiciel de traitement de textes.
Remarques : Quelques précautions pour la bonne réalisation de cette manipulation
-
acquérir la technique d'utilisation des micropipettes.
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coulage des gels (ne pas dépasser le haut des branches du peigne),
-
enlèvement du peigne, sans endommager les puits,
-
enlèvement du scotch (cas du matériel Jeulin),
-
récupération du gel après migration.
-
Remplissage des puits : il demande de la délicatesse et de la dextérité ; il convient de s'entraîner pour ne pas les
endommager au moment des dépôts. Pour ce faire, utilisez de l'eau distillée avec du bleu de dépôt.
= des opérations DELICATES !!!