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Nom de l’organisme bénéficiaire :
ADEREM
Nom de l’unité ayant effectué les travaux : UPRES 3287, « pathologies respiratoires liées à
l’environnement »
Adresse de l’unité : Faculté de Médecine, 27, Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 5
Responsable des travaux :
Pr Antoine MAGNAN
Téléphone : 04.91.74.46.30
14 décembre 2005
Programme PRIMEQUAL 2/ PREDIT
« Etude de l’influence des particules diesel sur l’activation des lymphocytes T chez
l’asthmatique»
Rapport final
« Impact of diesel exhaust particulate matter on Allergic Asthmatic T lymphocytes»
Final report
Emilie MAMESSIER, Antoine MAGNAN
N° de contrat ADEME
N° 02 62 039
Date du contrat :
23/12/2002
Durée du contrat :
Du 23/12/2002 au 23/06/2005
Nom du responsable ADEME :
Christian Elichegaray
Confidentialité
X Non
 Oui
durée
 Renforcée
Ces travaux font-ils suite
à d’autres travaux financés dans le cadre des programmes
PRIMEQUAL/PREDIT ou PRIMEQUAL2/ PREDIT ? Non
1
Table des matières
Résumé court
3
Résumé long
4
Note de synthèse
7
Introduction
7
Matériel et Méthodes
7
Patients
7
Particules diesel
8
Culture cellulaire et cytométrie de flux
8
Expectoration induite
9
Statistiques
9
Résultats
10
Marqueurs de surface
10
Production de cytokines
10
Prolifération
11
Discussion
12
Bibliographie
14
Tableaux
16
Légende des figures
18
Figures
19
Degré d’atteinte des objectifs
24
Difficultés rencontrées
24
Mots clés
24
Abréviations :
24
2
Résumé court
La prévalence de l’asthme continue d’augmenter dans les pays industrialisés. Parmi les
facteurs responsables du déclenchement des exacerbations, les polluants atmosphériques et
notamment les particules diesel ont été incriminés.
Dans cette étude, nous avons étudié l’impact des particules diesel sur l’activation des
lymphocytes T, essentiels à l’inflammation de l’asthmatique. Trente-deux prélèvements ont
été étudiés chez 27 asthmatiques sévères, 13 lors d’une exacerbation et 19 à distance, et 14
volontaires sains ont été inclus.
L’expression des marqueurs membranaires CD69 et CD25 et la production d’IL-4 et
d’IFN- par les lymphocytes T ont été étudiées en cytométrie de flux. La prolifération des
lymphocytes T a été étudiée par l’incorporation du PKH 26. Les expériences ont été réalisées
dans le sang, avant et après stimulation par les particules diesel.
L’expression de CD69 est diminuée chez l’asthmatique sévère. L’expression de ce
marqueur augmente après stimulation par les particules diesel, de façon plus importante chez
l’asthmatique, notamment en exacerbation. La production de cytokines Th1 et Th2 augmente
seulement chez les asthmatiques après stimulation par les particules diesel, et ce d’autant plus
que les patients sont en exacerbation. L’augmentation de l’IL-4 est prédominante.
La prolifération des lymphocytes T est stimulée par les particules diesel, mais cet effet
est plus important chez l’asthmatique que chez le volontaire sain et maximum lors des
exacerbations.
En conclusion, ce travail démontre que les particules diesel agissent comme
activateurs des lymphocytes T chez l’asthmatique. Cet effet est augmenté lors des
exacerbations, ce qui suggère que les particules diesel augmenteraient d’autant plus les
symptômes que l’asthme est déjà instable.
3
Résumé long
Introduction
La prévalence de l’asthme continue d’augmenter dans les pays industrialisés. Cette
maladie se manifeste par l’alternance d’exacerbations et de périodes de contrôle. Dans la
grande majorité des cas, un contrôle de longue durée est obtenu sous traitement. Pourtant, une
petite proportion d’asthmatiques sévères présente plusieurs exacerbations par an malgré un
traitement de fond lourd associant corticoïdes inhalés à forte dose et bronchodilatateurs de
longue durée d’action. Les facteurs en cause dans le déclenchement de ces exacerbations sont
multiples. Les polluants atmosphériques en font partie et parmi eux les particules diesel ont
été incriminées. Les mécanismes par lesquels les particules diesel agissent sur l’inflammation
bronchique sont mal connus. Les lymphocytes T sont les cellules responsables de la réaction
inflammatoire bronchique à éosinophiles qui caractérise l’asthme. Ces données nous ont
conduit à tester l’hypothèse d’une action directe des particules diesel sur les lymphocytes T
des sujets asthmatiques sévères, pendant les exacerbations et en dehors de celles-ci.
Matériel et méthodes
Dans cette étude, nous avons voulu étudier l’impact d’une stimulation par les
particules diesel sur l’activation des lymphocytes T du sang ex vivo, dans la population
d’asthmatiques sévères de la cohorte ISEA (Induced Sputum in Exacerbations of Asthma)
comparée à des volontaires sains. Les patients de cette cohorte sont des patients sévères qui,
malgré un traitement de fond associant corticoïdes inhalés à forte dose (> 1000 µg/j
d’équivalent beclometasone) et bronchodilatateurs de longue durée d’action, présentent
plusieurs exacerbations par an nécessitant la mise sous corticoïdes par voie générale. Ils sont
suivis tous les mois, de sorte que des prélèvements sont obtenus pendant et en dehors des
exacerbations.
Trente deux prélèvements de 27 asthmatiques sévères ont été inclus. Les prélèvements
ont été obtenus 13 fois pendant une exacerbation et 19 fois en dehors. Quatorze volontaires
sains ont été inclus. Les cellules mononucléées (PBMC) ont été isolées et cultivées en
présence de faibles doses de particules diesel. Les particules utilisées sont les particules de
référence du National Institute of Standard and Technology. Leur diamètre est de 120nm et
leur surface spécifique de 108m²/g. Les conditions de culture optimales ont été déterminées
par des courbes dose/réponse et des études de cinétique, sur l’expression de marqueurs
4
membranaires, la production de cytokines et la prolifération cellulaire. Ces conditions ont été
jugées optimales à 7 jours de stimulation par 8µg/ml de particules diesel.
L’expression des marqueurs membranaires CD69 et CD25 et la production d’IL-4 et
d’IFN- par les lymphocytes T ont été étudiées en cytométrie de flux. La prolifération des
lymphocytes T a été étudiée par l’incorporation du PKH 26, un marqueur fluorescent qui
s’intègre dans la membrane cellulaire et dont la décroissance de fluorescence par cellule est
proportionnelle au nombre de divisions.
Les comparaisons entre les groupes (volontaires sains, patients en exacerbation,
patients en dehors d’une exacerbation) ont été réalisées par une analyse de variance non
paramétrique. Les groupes ont été comparés entre eux par des tests de Mann et Whitney. Les
variations observées pendant les exacerbations ont été comparées à celles retrouvées en
dehors des exacerbations par des tests de Mann et Whitney réalisés sur ces variations.
Résultats
De façon inattendue, l’expression de CD69 est diminuée chez l’asthmatique sévère.
L’expression de ce marqueur augmente après stimulation par les particules diesel, de façon
plus importante chez l’asthmatique, notamment en exacerbation.
La proportion de cellules T CD25+ augmente uniquement dans le groupe
« exacerbations ».
La proportion de cellules T productrices d’IL-4 et celle de cellules productrices d’IFN augmentent en réponse aux particules diesel dans les deux groupes d’asthmatiques, et de
façon significativement plus importante lors des exacerbations. Ces proportions n’augmentent
pas chez les volontaires sains. L’augmentation de l’IL-4 est prédominante, indiquant une
activation globale orientée dans un sens Th2.
La prolifération des lymphocytes T est stimulée par les particules diesel, mais cet effet
est plus important chez l’asthmatique que chez le volontaire sain et maximum lors des
exacerbations.
Conclusions
La diminution d’expression de CD69 chez les asthmatiques est surprenante mais est en
accord avec certaines données récentes qui suggèrent que C69 puisse être exprimé dans les
phases de résolution de l’inflammation et être plus un facteur régulateur qu’un récepteur
activateur. Les autres résultats apportent des données importantes concernant l’action des
particules diesel dans l’asthme :
5

Ils montrent que les particules diesel sont actives sur les cellules de malades mais pas sur
celles de contrôles, ce qui rejoint les données épidémiologiques qui montrent que
l’exposition aux polluants est délétère chez les asthmatiques en diminuant le seuil de
déclenchement des symptômes, mais sans effet chez les non malades.

Ils montrent qu’effectivement les particules diesel sont capables d’activer les lymphocytes
T, qui sont les chefs d’orchestre de la réaction inflammatoire de l’asthmatique.

En étant retrouvés dans un groupe d’asthmatiques sévères traités par corticoïdes inhalés à
forte dose, ils montrent que même sous traitement les lymphocytes T des asthmatiques
conservent une « hyperréactivité immunologique ».

En montrant clairement que l’effet des particules diesel et supérieur lors des
exacerbations, nos résultats suggèrent que l’asthmatique sévère est d’autant plus
vulnérable vis-à-vis de tels polluants que son asthme est mal équilibré.
6
Note de synthèse:
Introduction
Au cours des dernières décennies, l’augmentation de la prévalence des maladies de l’atopique
a été attribuée à des modifications du mode de vie, incluant l’exposition aux polluants atmosphériques
(1,2). Dans les sociétés occidentales, la pollution est essentiellement attribuée à la circulation
automobile, et notamment à celle induite par les particules (DEP) émises par les moteurs diesel. Les
études épidémiologiques ont montré que la survenue des maladies atopiques est liée à l’exposition aux
particules diesel, notamment chez les enfants (3).
Les DEP sont composées d’un noyau carbonique fait d’hydrocarbures polyaromatiques qui
adsorbe toutes sortes d’ions métalliques, d’hydrocarbures et de composés organiques dont la poussière
et les pollens. Ainsi, plus que par toxicité propre, les DEP agissent comme vecteurs transportant des
éléments toxiques et allergèniques directement déposés dans les voies aériennes (4, 5).
Le rôle propre des DEP sur l’inflammation allergique reste peu clair. L’exposition aux DEP
induit une activité oxydative dans les poumons, médiée par les hydrocarbures (6,7). Les chimiokines
pro-inflammatoires comme l’IL-8, le GM-CSF, le TNF-, le MIP-1, et l’IL-1 sont alors produites
par les cellules épithéliales bronchiques et/ou les macrophages alvéolaires (8-10). De plus, les DEP
induisent l’expression de molécules d’adhésion et la formation d’un gradient de chimiokines facilitant
la diapédèse (11) et l’attraction des neutrophiles, des éosinophiles et des lymphocytes (12, 13). Plus
spécifiquement, les DEP induisent in vitro et in vivo la production d’IgE chez des patients sensibilisés
et non sensibilisés (14). De ce point de vue, les DEP augmentent aussi la production d’IL-4 par les
basophiles et d’autres cellules du système immunitaire (5, 16). En revanche l’action des DEP sur les
cellules T est inconnue. Pourtant les cellules T sont les cellules principales impliquées dans la
survenue de l’inflammation de type asthmatique, et notamment les cellules Th2 sont responsables de
la commutation isotypique des plasmocytes vers la synthèse d’IgE.
Les asthmatiques sévères représentent un sous-groupe de patients réduit mais spécialement
vulnérable. Ce sont des patients qui malgré un traitement de fond lourd présentent un handicap
important et un risque élevé d’exacerbations sévères. C’est le groupe de patients pour lequel de
nouveaux modes de prise en charge sont vraiment nécessaires, dans le but de diminuer à la fois les
exacerbations, mais aussi la consommation de corticoïdes par voie générale administrés lors de ces
épisodes.
C’est ainsi que dans cette étude, nous nous sommes intéressés à l’action des DEP sur les
lymphocytes T, chefs d’orchestre de la réaction inflammatoire de l’asthmatique, chez l’asthmatique
sévère pendant les exacerbations et en dehors de celles-ci.
Matériel et méthodes.
Patients
Vingt-sept patients asthmatiques sévères ont été recrutés dans le cadre de la cohorte « ISEA »
(Induced Sputum in Exacerbations of Asthma). Cette cohorte concerne des asthmatiques persistant
sévères suivis chaque mois avec réalisation d’une prise de sang et d’une expectoration induite.
L’asthme est connu depuis au moins un an, défini selon les recommandations du GINA, sur la base
d’un syndrome obstructif réversible soit au moment de l’entrée dans l’étude soit antérieurement. La
sévérité est également déterminée en fonction de la classification GINA, c'est-à-dire qu’ils présentent
tous des « symptômes continus et une limitation de leur activité physique due à l’asthme, et des
symptômes nocturnes d’asthme fréquents » (17). De plus, ces symptômes étaient présents malgré un
traitement par au moins 1000 µg/j d’équivalent béclométasone et un bronchodilatateur de longue durée
d’action. Enfin, ces patients avaient tous présenté au moins deux exacerbations sévères dans les 12
mois précédent leur entrée dans l’étude, nécessitant l’utilisation de corticoïdes par voie générale.
Cependant, certains d’entre eux restaient avec un VEMS de base normal. Ces patients étaient ainsi
tous des asthmatiques sévères non contrôlés.
Les échantillons étaient considérés comme pris en dehors d’une exacerbation (NE) si une
exacerbation sévère n’était survenue ni un mois avant ni un mois après le prélèvement. Ils étaient
considérés comme pris lors d’une exacerbation (E) s’ils étaient prélevés pendant une exacerbation
7
sévère définie par la nécessité de traiter par une cure de corticoïdes par voie générale en raison d’une
aggravation des symptômes d’asthme avec détérioration de la fonction respiratoire.
Le diagnostic d’atopie était porté en cas de positivité d’au moins un test cutané pour un
pneumallergène commun au sein d’une batterie de 35 extraits (Stallergènes, Antony, France). La
batterie incluait notamment les extraits suivants : Dermatophagoides pteronissinus et farinae, chat,
chien, blatte, alternaria, aspergillus, cladosporium et penicillium, pollens de graminées, pariétaire,
bouleau, noisetier, olivier, chêne, mimosa, peuplier, acacia.
Quatorze volontaires sains non atopiques et non fumeurs, présentant une fonction respiratoire
normale ont été inclus comme groupe contrôle. Tous les sujets ont donné un consentement écrit. Le
protocole a été approuvé par le Comité Consultatif de Protection des Personnes se prêtant à la
recherche Biomédicale de Marseille 2.
Particules diesel
Les particules ont été obtenues auprès du National Institute of Standard and Technology. Ce
Standard Reference Marterial 1650® est utilisé pour évaluer les méthodes analytiques de
détermination des hydrocarbures aromatiques polycycliques des DEP (18,19). Ce matériel a été obtenu
à partir de l’accumulation sur 200 heures de particules produites par différents moteurs utilisés dans
différentes conditions. Le diamètre des particules utilisées était 120 nm et leur surface spécifique de
108 m²/g. Les particules ont été lavées en dichlorométhane puis resuspendues dans un tube en verre
dans de l’eau déminéralisée, et soniquées selon la méthode décrite par Moller et al (20).
Culture cellulaire
Les cellules mononucléées du sang (PBMC) ont été préparées à partir du sang hépariné sur
gradient de Ficoll. La concentration a été ajustée à 10 x 106 cellules /ml. 2 x 106 cellules ont été
utilisées pour les études de prolifération. Brièvement, les cellules ont été marquées par un colorant
membranaire fluorescent, le PKH 26 (2.5 µM ; Sigma, Lyon, France). Ce marqueur fluorescent
s’intègre dans la membrane plasmique de sorte que l’intensité de fluorescence de chaque
cellule diminue de moitié à chaque mitose. Le nombre de divisions cellulaires peut ainsi être
apprécié facilement en cytométrie de flux. Ce marquage est réalisé à partir de 5.10 6 cellules.
Les cellules sont resuspendues dans le tampon approprié au marquage PKH26 (107/ml). Le
PKH26 2 M est ajouté pendant 5 minutes. La réaction est arrêtée par du sérum de veau foetal
pur décomplémenté puis après lavage, les cellules sont mises en culture. Après 7 jours de
culture, les lymphocytes T sont incubés avec un anti-CD3-PC5. Les résultats sont exprimés en
pourcentage de lymphocytes T CD3+ qui se sont divisés.
Des études de cinétique (24h à 10j) et dose-réponse (1 à 100 µg/ml) ont été réalisées sur des
prélèvements d’asthmatiques, et ont permis de déterminer que la dose de 8µg/ml de DEP pendant 7
jours permettait d’obtenir la meilleure production de cytokines, la meilleure prolifération et offrait la
meilleure sensibilité pour comparer les groupes de patients entre eux (Fig 1 A et B). Les expériences
ont été réalisées en double.
Les cellules ont été cultivées en milieu complet composé de RPMI 1640 (Gibco, CergyPontoise, France), supplémenté en serum de veau fœtal décomplémenté (10%), 100 U/ml de
pénicilline G, 100 µg/ml de streptomycine, 100 U/ml de kanamycine, 2mM de glutamine, 1 mM de
pyruvate de sodium et 5µM de 2-mercaptoéthanol. Les DEP à 8µg/ml ont été ajoutées pendant 7 jours.
Une stimulation addtionnelle non spécifique a été réalisée durant les 12 dernières heures de culture
dans les puits destinés à l’étude de la production de cytokines.
Cytométrie de flux
Chacune des expériences a été réalisée en double, sur 5.105 cellules et dans un volume
final de 800l. Les cellules étaient incubées 15 minutes avec un anticorps Anti-CD3-PC5
(Dako, Trappes, France), un anti-CD69-PE (Dako) et un anti-CD25-FITC (Immunotech,
Marseille, France), et fixées par du PBS 2,5% formaldéhyde. Les résultats sont exprimés en
pourcentage de lymphocytes T CD3+ CD69+ et / ou CD3+CD25+.
8
Pour l’analyse de la production des cytokines au niveau unicellulaire, les cellules ont
été incubées 15 minutes avec un anticorps anti-CD3-PC5, fixées 10 minutes avec du PBS
2,5% formaldéhyde puis rincées et perméabilisées 7 minutes avec du PBS, 0,1% saponine, 1%
BSA. Les cellules sont ensuite incubées 15 minutes en présence d’anticorps anti-IFN--FITC
(Pharmingen, Le Pont de Claix, France) et anti-IL-4-PE (Immunotech). Les résultats sont
exprimés en pourcentage de lymphocytes T CD3+IFN-+ ou CD3+IL-4+. Pour chaque
expérience de cytométrie de flux, des isotypes IgG contrôles ont été utilisés comme témoin
interne négatif. Les marquages ont été analysés sur un cytomètre BD FACScan Becton
Dickinson, Franklin Lanes, NJ, USA), à l’aide du logiciel Cell Quest Pro (Becton
Dickinson).
Expectoration induite
Les expectorations induites ont été obtenues après nébulisation ultrasonique de sérum salé à
4.5% (Systam, Villeneuve sur Lot, France). La nébulisation a été réalisée en 3 périodes de 7 min à
travers un embout buccal. Après chaque nébulisation une mesure de VEMS était réalisée pour
apprécier la tolérance. On demandait aux patients de se moucher et de se rincer la bouche pour limiter
la contamination salivaire, avant de cracher dans un pot stérile.
Les prélèvements étaient immédiatement récupérés dans une boîte de Pétri et les portions
denses d’origine bronchique triées, transférées dans un tube pré-pesé et pesées. Du Dithiotreitol (USB,
Cleveland, USA) 0,1 % était ajouté dans un volume en µl trois fois égal au poids de l’expectoration
en µg. Le même volume de PBS était ajouté, et la mixture filtrée. Les cellules étaient lavées,
centrifugées et reprises dans 500µl. Elles étaient ensuite cytocentrifugées sur lames. Les lames étaient
colorées par la méthode de May Grunwald et Giemsa et une formule cellulaire était réalisée.
Statistiques
Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel Statview. Les variations entre les
différents groupes ont été comparées par une analyse de variance non paramétrique de KruskallWallis. Lorsque cette analyse était positive, des comparaisons entre les groupes deux à deux ont été
réalisées par des tests de Mann et Whitney. Les variations intra-groupes ont été faites par des tests
appariés de Wilcoxon. L’importance de l’effet des DEP a été comparée entre les groupes par des tests
de Mann et Whitney réalisés sur les différences obtenues entre les résultats avec et sans stimulation.
Les données sont exprimées en médianes (interquartiles). Une valeur de p < 0.05 est considérée
comme significative.
9
Résultats
Patients
Trente deux échantillons provenant de 27 asthmatiques sévères (15 femmes, 12 hommes)
d’age moyen 57 ans ont été inclus dans l’étude (Tableau I). Leur VEMS ± ES moyen était à 86,5 ±
2.9 % de la valeur théorique en dehors des périodes d’exacerbations et en moyenne de 60.6 ± 17.7 %
durant les exacerbations. Une diminution du VEMS a été observée chez tous les patients pendant les
exacerbations. Douze patients étaient non atopiques. Treize échantillons sanguins ont été obtenus
durant une exacerbation (groupe E), et 19 en dehors d’une exacerbation (groupe NE). Cinq patients ont
été étudiés en dehors et pendant une exacerbation. Conformément à ce qui est connu lors des
exacerbations, une élévation des éosinophiles de l’expectoration induite était observée lors des
exacerbations (E : 16 % vs NE : 4.9 %, p = 0.01, Fig 2).
Le tableau I donne les données morphométriques des patients. Une réversibilité d’au moins
12% du VEMS de base était retrouvée à l’inclusion chez 11 patients. Vingt-deux patients recevaient
1600 à 2000 µg/j de beclometasone ou équivalent et 12 étaient traités par anti-leucotriènes.
Les 14 volontaires sains inclus étaient tous non atopiques, non fumeurs et porteurs d’une fonction
respiratoire normale.
Induction des marqueurs CD69 et CD25 par les DEP
Le niveau de base d’expression de CD69 était diminué chez les asthmatiques par rapport aux
contrôles (p < 0.005 pour les deux groupes d’asthmatiques comparés aux contrôles), et cette différence
était augmentée après stimulation par les DEP (p < 0.0001 pour les deux groupes d’asthmatiques
comparés aux contrôles) (Fig 3A). La stimulation par les DEP a induit une augmentation d’expression
de CD69 dans les trois groupes. (Fig 3A et tableau II).
Il n’y avait pas de différence à l’état de base de l’expression de CD25 par les cellules T entre
les groupes. Après exposition aux DEP, l’expression de CD25 augmentait significativement seulement
chez les asthmatiques en exacerbation (Fig 3B, tableau II).
L’intensité moyenne de fluorescence des marqueurs de surface variait de la même façon que
les proportions de cellules positives pour ces marqueurs (non montré), à la fois pour CD69 et CD25,
ce qui indique que le nombre de récepteurs par cellule varie de la même façon que le nombre de
cellules exprimant ces récepteurs après stimulation par les DEP.
Induction des cytokines Th1 et Th2 par les DEP.
La proportion de base des cellules T produisant l’IFN- était augmentée chez les patients en
exacerbation par rapport aux patients sans exacerbation et aux volontaires sains. (ANOVA de Kruskall
Wallis : p = 0.0038, Fig 4A, tableau II). L’exposition aux DEP augmentait la proportion de cellules
productrices d’IFN- à la fois chez les E et les NE (p < 0.005 et p < 0.05 respectivement par
comparaison aux cellules non stimulées), mais pas chez les contrôles (Fig 4A, tableau II). Cet effet est
illustré chez les 5 patients prélevés pendant et en dehors d’une exacerbation (Fig 4B).
De plus l’exposition aux DEP augmentait la différence entre le groupe E et les deux autres
groupes (ANOVA de Kruskall-Wallis : p = 0.0011, Fig 4A tableau II). L’effet des DEP était
statistiquement plus grand dans le groupe E comparé aux deux autres (p = 0.01).
Les pourcentages de base de cellules produisant de l’IL-4 étaient augmentés dans les deux
groupes d’asthmatiques par rapport aux contrôles, mais étaient le plus élevés dans le groupe E
(ANOVA de Kruskall-Wallis : p = 0.02, Fig 4C, tableau II). Dans les deux groupes d’asthmatiques les
DEP ont significativement augmenté la production de cellules productrices d’IL-4 (p < 0.005 pour NE
et p < 0.0005 pour E, par comparaison aux cellules non stimulées Fig 4C, tableau II). Cet effet est
illustré pour les 5 patients prélevés pendant et en dehors d’une exacerbation Fig 4D. Les particules
diesel n’ont pas eu d’effet sur la production d’IL-4 dans le groupe contrôle.
A nouveau, et de façon plus marquée que pour l’IFN-, l’exposition aux DEP augmente la
différence entre le groupe E et les deux autres groupes (ANOVA de Kruskall-Wallis : p = 0.0003, Fig
4C, tableau II). L’effet des DEP est statistiquement plus important dans le groupe E que dans les deux
autres groupes (p = 0.006).
Proportionnellement, les DEP ont induit plus de cellules productrices d’IL-4 que de cellules
productrices d’IFN-, de sorte que le rapport IFN-/IL-4 diminuait après stimulation dans les deux
10
groupes d’asthmatiques par rapport aux résultats sans stimulation (p < 0.005 pour les deux groupes
d’asthmatiques).
Prolifération induite par les DEP.
La prolifération de base ne différait pas entre les trois groupes. En présence de DEP, la
prolifération des cellules T n’augmentait que chez les asthmatiques. La différence avec la prolifération
de base était plus importante dans le groupe E. (p < 0.05 pour NE, p < 0.005 pour E par rapport aux
contrôles, Fig 5A, tableau II). L’effet des DEP était significativement plus important chez les patients
du groupe E (p = 0.03) et induisait une prolifération significativement plus importante chez les
asthmatiques par rapport aux contrôles. (ANOVA de Kruskall-Wallis : p = 0.02, Fig 5A, tableau II).
Cet effet est illustré chez les 5 patients prélevés pendant une exacerbation et à distance (Fig 5B).
11
Discussion
Dans cette étude, nous avons montré que la stimulation ex vivo des lymphocytes T par des
particules Diesel induit une activation chez les asthmatiques mais pas chez les sujets contrôles. En
effet, les DEP ont entraîné à la fois l’expression de marqueurs de surface, la production de cytokine et
la prolifération. Cet effet était statistiquement plus important chez les patients en exacerbation par
rapport aux patients en dehors d’une exacerbation, pour la production de cytokines et la prolifération.
Il faut remarquer que ces effets ont été obtenus après une stimulation à faible dose mais sur plusieurs
jours, de façon assez proche d’une stimulation naturelle. (20-22). Bien que le mécanisme exact de
l’induction de l’activation des cellules immunitaires par les DEP ne soit toujours pas connu, on a
suggéré que les DEP diminuent le seuil d’activation des cellules du système immunitaire responsables
des symptômes d’asthme. En effet la plupart des études ont démontré que les DEP pouvaient faciliter
la survenue de maladies allergiques en induisant la production de cytokines et chimiokines par les
cellules épithéliales et les macrophages alvéolaires, et aussi la production d’IgE par les cellules B (23,
24). Ici nous démontrons que les DEP agissent aussi sur les cellules T, considérées comme les cellules
principales impliquées dans la genèse de l’asthme.
CD69 et CD25 sont considérés comme des marqueurs précoces de l’activation T. Une
expression spontanée de ces marqueurs est retrouvée lors de situations inflammatoires chroniques, à la
fois in vitro et in vivo (25). Le pourcentage de cellules T exprimant CD69 est de façon inattendue plus
élevé chez les volontaires sains que chez les asthmatiques, mais augmente encore après stimulation par
les DEP. Chez les contrôles, l’expression de CD69 est associée à une faible prolifération et une faible
production de cytokines. Une hypothèse pour cette différence entre asthmatiques et contrôles pourrait
être que les corticoïdes inhalés diminuent l’expression de CD69 chez les asthmatiques. Cela est peu
probable, car tous les autres marqueurs d’activation sont plus élevés chez ces malades. Il n’y a pas
d’étude comparant l’effet des DEP en fonction de la présence ou non d’un traitement par corticoïdes
inhalés. Cependant Nordenhall et al. (26) ont retrouvé une induction d’hyperréactivité bronchique chez
des patients traités par corticoïdes inhalés. Nous suggérons plutôt que chez les contrôles, CD69 puisse
être responsable d’un état de non réactivité des cellules T. En effet il a été démontré récemment que
CD69 pouvait être impliqué dans des voies de régulation, notamment via la production de TGF- (27).
De plus, il a été rapporté que l’expression de CD69 était diminuée lors d’une suractivation
lymphocytaire T en réponse à une exposition antigénique prolongée (28).
A l’inverse, les cellules T CD25+ n’étaient pas différemment représentées d’un groupe à
l’autre, et n’augmentait en réponse aux DEP que dans le groupe en exacerbation. CD25 est associé à
un phénotype activé lorsqu’il est exprimé à un niveau moyen, et à un phénotype régulateur lorsqu’il
est fortement exprimé. L’augmentation parallèle de la production de cytokines suggère qu’il est ici un
marqueur d’activation pro-inflammatoire.
En effet, les DEP ont induit à la fois la production de cytokines Th1 et Th2 par les cellules T.
L’induction Th2 était plus prononcée, ce qui est en accord avec le rôle connu des DEP sur la synthèse
d’IgE (29). De plus en réponse aux DEP, la production d’IFN- augmentait chez les asthmatiques mais
pas chez les contrôles, confirmant ainsi la participation Th1 à l’inflammation de l’asthmatique. La
littérature concernant les relations entre les DEP et la production d’IFN- est controversée. Chez la
souris, la production d’IL-12p40 est corrélée négativement avec l’exposition aux DEP (30), et une
diminution de l’IFN- a récemment été décrite par les monocytes, les NK et les NKT après stimulation
par les DEP (31, 32, 33). Inversement chez l’homme, après exposition naturelle aux poussières
organiques, Muller-Sur et al. ont décrit une production d’IL-12 par les phagocytes, induisant
l’activation des cellules NK et Th1 (34). Enfin, Senechal et al. ont démontré que bien que les
chimiokines Th1 et Th2 pouvaient être induites par les DEP associées à une stimulation par
l’allergène, l’effet résultant était chimiotactique sur les cellules Th2 mais pas Th1 (35). Notre étude
ex-vivo a été réalisée chez l’homme, dans un sous-groupe de patients sévères pour lesquels les
mécanismes inflammatoires en jeu sont probablement différents de ceux retrouvés chez des
asthmatiques moins sévères. L’activation Th1 pourrait être plus importante dans ce groupe de patients,
comme cela a été suggéré par le passé (36). Par ailleurs, certaines des exacerbations étudiées
pourraient être d’origine infectieuse et accroître l’activation Th1. Néanmoins l’IFN- peut participer
directement à la pathogenèse des exacerbations (36). Cela est en accord avec l’augmentation de base
de production d’IFN- retrouvé chez ces asthmatiques sévères par rapport aux contrôles.
12
En stimulant l’activation de base des lymphocytes T des asthmatiques, les DEP pourraient
augmenter l’hyperréactivité bronchique (26) et par conséquent déclencher des symptômes d’asthme.
De plus, elles pourraient agir comme des adjuvants lorsqu’elles sont associées à d’autres facteurs
déclenchants les symptômes comme les infections ou les allergènes (37).
Considérés ensemble, les effets des DEP sur les lymphocytes T des asthmatiques mais pas des
volontaires sains, suggèrent que les asthmatiques sont à risque d’accroître leurs symptômes lorsqu’ils
sont exposés aux DEP, d’autant plus qu’ils sont mal contrôlés.
13
Références
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15
Age
Patient
(years)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
55
65
64
24
64
43
39
57
58
55
57
63
65
44
59
68
59
50
73
43
62
61
70
46
65
45
57
Sexe
Poids
(Kg)
Taille
(cm)
F
F
F
F
M
F
M
F
F
F
M
F
F
F
M
F
M
F
M
M
F
M
F
M
M
F
M
68
85
60
93
90
98
73
76
92
65
96
67
58
65
82
70
82
123
64
55
80
66
78
82
80
96
90
165
155
157
183
165
180
160
174
182
159
158
152
157
166
175
160
158
160
150
162
175
180
160
168
177
160
180
VEMS
(% predite)
NE
90
100
63
93
71
67
88
93
100
100
97
100
87
100
88
77
100
71
100
79
93
75
76
100
100
61
81
VEMS
VEMS
ICS
reversibilité à
(% predite) l’inclusion
dose
E
(µg/d)
(%)
59
0
2000
81
8.2
1600
37
0
1600
72
6.4
2000
34
20
2000
41
7.4
2000
50
0
2000
78
39.7
1600
84
17.1
1600
64
32.8
1600
42
3.6
2000
96
6.1
1600
49
23.7
1600
83
19.1
2000
65
2.6
1600
51
2.6
2000
87
29.3
1200
41
23.1
1200
78
0
1200
42
30.4
2000
56
1.6
2000
63
0
1000
37
0
1600
76
2.9
1000
78
0
2000
50
36.2
2000
57
2.6
2000
MK Atopie
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Tableau I. Caractéristiques des patients. M = Masculin ; F = Féminin ; NE = pas
d’exacerbation ; E = Exacerbation ; ICS = Corticoïdes inhalés; MK = montelukast ; O = Oui ;
N = Non
16
O
N
O
O
O
N
O
N
N
O
N
N
O
O
O
N
N
N
N
N
N
O
N
N
O
O
N
Tableau II. Impact des DEP sur l’activation des cellules T. Les cellules ont été cultivées
pendant 7 jours sans (Cf = 0 µg/ml) ou avec (Cf = 8 µg/ml) DEP. Les resultats sont exprimés
en médiane (interquartile). Des comparaisons appariées entre cellules exposées et non
exposées ont été réalisées. NS = non significatif.
DEP 0 µg/ml
DEP 8 µg/ml
p
CD3+CD69+
Controles
n = 14
9.38 16.98
19 15.73
p = 0.005
Pas d’ Exacerbation
n = 19
5 5.5
6.6 2.38
p < 0.05
Exacerbation
n = 13
3.75 3.50
6 3.50
p = 0.0001
CD3+CD25+
Controles
n = 14
3.95 3
4.80 2.9
NS
Pas d’ Exacerbation
n = 19
5 4.75
5.8 2.75
NS
Exacerbation
n = 13
4 2.38
5.95 5.5
p = 0.005
CD3+IFN- +
Controles
n = 14
7.77 7.00
9.65 5.60
NS
Pas d’ Exacerbation
n = 19
9.1 8.00
11.5 9.25
p < 0.05
Exacerbation
n = 13
20 11.0
23.2 11.8
p  0.005
CD3+IL-4+
Controles
n = 14
1.87 1.5
2.48 1.6
NS
Pas d’ Exacerbation
n = 19
2.75 1.85
3.55 2.87
p  0.005
Exacerbation
n = 13
3.45 1.88
8 6.43
p  0.005
Prolifération
Controles
n = 14
2.5 4.05
2.5 5.62
NS
Pas d’ Exacerbation
n = 19
4.15 10.1
6.85 8.5
p < 0.05
Exacerbation
n = 13
3.25 2.70
4.8 6.5
p  0.005
17
Légendes des figures
Figure 1. Cinétique et effet dose réponse de la stimulation par les DEP.
A. Effet dose-réponse de la stimulation par les DEP sur l‘expression de CD69, la production
d’IFN- et la prolifération des lymphocytes T. Les cellules T ont été stimulées par des doses
croissantes de DEP pendant 7 jours. Données d’un sujet asthmatique. La dose de 8µg/ml
donne la meilleure réponse.
B. Cinétique de la stimulation par les DEP sur l’expression de CD69, CD25, la production
d’IFN- et d’ IL4 et la prolifération. Les expériences ont été réalisées chez 5 patients par
condition de culture en moyenne avec 8µg/ml de DEP. La stimulation de 7 jours donne le
meilleur compromis pour tous les paramètres étudiés (flèche).
Figure 2. Eosinophilie de l’expectoration induite. Les cellules de l’expectoration induite ont été
recueilles pendant (E) et en dehors des exacerbations (NE), et une formule cellulaire a été réalisée
après cytocentrifugation des cellules et coloration de May-Grunwald-Giemsa.
Figure 3. Induction par les DEP de l’expression de CD69 et CD25 sur les cellules T..
Les pourcentages de cellules T exprimant CD69 (A) ou CD25 (B) ont été déterminés après 7 jours
deculture sans (- = 0 µg/ml) ou avec ( + = 8µg/ml) DEP.C = contrôles; NE = Pas d’ exacerbation; E =
Exacerbation. Resultats exprimés en médiane [Interquartile]. **: p < 0.005 ; ***: p < 0.0005.
Figure 4. Induction par les DEP de la production d’IFN- et d’IL-4 par les lymphocytes T.
Les pourcentages de cellules CD3+ IFN-+ (A, B) et CD3+IL-4 (C, D) ont été mesurée après 7 jours
de culture sans ( - = 0 µg/ml) ou avec ( + = 8µg/ml) DEP. B, D: données individuelles obtenues chez 5
patients sampled prélevés pendant et en dehors d’une exacerbation. Resultats exprimés en médiane
[Interquartile]. C = contrôles; NE = Pas d’ exacerbation; E = Exacerbation. *: p < 0.05; **: p < 0.005;
***: p < 0.0005.
Figure 5. Prolifération des cellules T induite par les DEP.
Les cellules ont été marquées par le PKH26 et cultivées pendant 7 jours sans ( - = 0 µg/ml) ou avec ( +
= 8µg/ml) DEP. (A) Les résultats ont été compares en fonction de l’exposition aux DEP. (B) :
données individuelles obtenues chez 5 patients sampled prélevés pendant et en dehors d’une
exacerbation. Resultats exprimés en médiane [Interquartile]. C = contrôles; NE = Pas d’ exacerbation;
E = Exacerbation. *: p < 0.05; **: p < 0.005; ***: p < 0.0005.
18
0 µg/ml
5 µg/ml
8 µg/ml
10 µg/ml
A
B
12.00
CD3-PC5
13 %
26%
29%
22.5 %
10.00
8.00
IFN--PC5
CD69 -PE
9%
11%
6.00
14%
11.6%
4.00
2.00
0.00
CD3-PC5
CD3-PC5
1
14%
14%
22%
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Days
18%
CD69
CD25
IL-4
Proliferation
IFN-
PKH26
Figure 1
19
Figure 2
P = 0.001
% IS eosinophils
80
70
60
50
40
30
20
10
0
NE
E
20
Figure 3
A
**
35
30
25
20
15
10
5
0
C
NE
0 g/ml
CD3+CD25+ cells
***
% of CD3+CD25+ T cells
**
% of CD3+CD69+ T cells
B
CD3+CD69+ cells
***
E
C
NE
8 g/ml
E
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
C
NE
0 g/ml
E
C
NE
E
8 g/ml
21
Figure 4
***
***
% of CD3+IFN-+
40
***
**
35
B
% of CD3+IFN-+
A
30
25
20
15
10
5
NE
E
C
0 g/ml
NE
20
15
10
8 g/ml
***
**
14
E
*
E (-)
E(+)
NE (-) NE (+)
E (-) E(+)
14
12
10
*
8
NE (-) NE (+)
D
***
% of CD3+IL-4+
% of CD3+IL-4+
25
0
C
6
4
12
10
8
6
4
2
2
0
30
5
0
C
35
0
C
NE
0 g/ml
E
C
NE
E
8 g/ml
22
Figure 5
B
25
22.5
20
17.5
15
12.5
10
7.5
5
2.5
0
CD3+ T cells division (%)
CD3+ T cells division (%)
A
14
12
10
8
6
4
2
0
C
NE
0 g/ml
E
C
NE
8 g/ml
E
NE (-) NE (+)
E (-) E(+)
23
Degré d’atteinte des objectifs :
Les objectifs fixés par le protocole ont été atteints.
Conformément à notre hypothèse, nous avons montré que les particules diesel étaient
capables d’activer les cellules T des sujets asthmatiques. Un article est en révision pour
allergy.
Difficultés rencontrées : Les difficultés ont résidé essentiellement en la mise au point des
protocoles de stimulation. Plusieurs mois ont été perdus en raison de l’arrêt de la
commercialisation des particules diesel utilisées dans ce travail. Ces difficultés ont pu être
surmontées, et l’étude a pu être menée à son terme.
Mots clés :
Lymphocyte T ; balance TH1/TH2 ; asthme ; allergie ; particules diesel ; pollution
Key words :
T lymphocytes ; TH1/TH2 balance ; asthma ; allergy ; diesel exhaust particles ;
pollution
Abréviations :
IL
Interleukine
IFN
Interféron
PBMC
Cellules mononucléées du sang périphérique
DEP
Particules diesel
ES
Erreur standard
24