Noms des roneotypeurs

Wenisch Emilie – Valy Laure
Steph -- Chloé
VACCINOLOGIE
Date 24/04/09
Heure 15h45-16h00
C. CAMUS
APPLICATIONS VACCINALES DE LA GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE
Nous allons voir dans ce cours comment utiliser les techniques de biologie moléculaire pour créer
de nouveaux vaccins.
Les vaccins classiques sont de deux types :
 Vivant atténué : (développé depuis de nombreuses années) ; ce sont des souches apathogènes
obtenues soit de façon naturelle, soit provoquées de façon empirique : mise en culture pendant
un temps très long. Par exemple, au labo de maladies contagieuses de l’ENVT, une souche de
terrain a été cultivée sur œufs embryonnés (et non sur cellules animales) à 33°C (et pas 37), le
génome s’en est ainsi trouvé modifié et on a obtenu la souche atténuée toujours utilisé dans les
vaccins.
 Inactivé : la souche pathogène est traitée soit par traitement chimique, soit par chaleur et on
obtient le virus inactivé.
Les nouvelles générations de vaccins sont à agent vivant atténué, inerte (correspondant à
inactivé) ou intermédiaire.
 Vaccins vivants atténués classiques
Ils sont efficaces à faible dose (car vivants), permettant ainsi un nombre limité d’administrations
(moins de rappels), avec une réponse immunitaire très proche de celle se produisant avec l’agent
pathogène sauvage. Il n’y a aucune restriction de voie d’administration. De plus, une fois la souche
atténuée obtenue, il suffit de l’amplifier donc l’obtention du vaccin est à faible coût.
Mais ces vaccins présentent l’inconvénient de provoquer des maladies vaccinales (si l’atténuation
n’est pas suffisante), ou des phénomènes d’immunodépression. Du coup bien souvent on ne les
utilise pas sur des petits animaux. Il y a aussi des problèmes de contamination : par exemple en
Asie, des lots de vaccins contre la maladie de Marek ont été contaminés par le virus de la
réticuloendothéliose aviaire, entraînant la mort de milliers de volailles.
Les souches atténuées étant vivantes, elles se multiplient dans l’organisme donc il peut y avoir
transmission entre animaux, ou encore des phénomènes de réversion, des recombinaisons
pouvant faire apparaître de nouvelles souches virulentes.
Problème aussi de conservation de ces souches atténuées.
Laëti et Vanessa
Noms des correcteurs
Vaccinologie
24/04/09
16H-17H
Camus
 Vaccins inactivés classiques
L’agent est tué donc il y a innocuité totale ; et ils sont beaucoup plus stables.
Vaccinologie – Applications vaccinales de la génétique moléculaire – page 1/9
Cependant ils présentent aussi un certain nombre d’inconvénients :
. Lors des différentes techniques d’inactivation, on peut avoir une modification de la
conformation des différentes protéines (par exemple, lors d’inactivation par haute température).
Les anticorps, créés lors de la réponse immunitaire, vont donc moins bien reconnaître les
protéines virales. L’efficacité vaccinale est alors moindre que celle obtenue avec un virus atténué.
. Vu que l’efficacité est plus faible, la stratégie de vaccination va nécessiter plusieurs
administrations ; et l’utilisation d’adjuvants pour stimuler la réponse immunitaire.
. On a donc un coût plus important.
 Nouvelles stratégies vaccinales utilisation de la génétique moléculaire
I. Vaccin à agent vivant
Il existe trois types de vaccins à agent vivant :
a) Vaccin atténué classique (vu plus haut), qui est obtenu après modification génétique
aléatoirement.
b) Vaccin atténué par mutagenèse dirigée, où cette fois on va cibler la mutation que l’on veut
obtenir. Il s’agit le plus souvent de délétion, et non de mutation ponctuelle ; afin d’éviter les
phénomènes de réversion.
c) Vaccin recombinant réplicatif ; où l’on insère dans le génome viral un gène codant pour une
protéine d’intérêt vaccinal (protéine de surface), par l’intermédiaire d’un vecteur.
NB : réplicatif= il y a multiplication possible au sein de l’hôte.
a) Vaccin atténué classique : vu plus haut
b) Vaccin atténué par mutagenèse dirigée
Cette méthode permet d’augmenter la stabilité du vaccin, et de diminuer les risques de
réversion, en ciblant le gène que l’on va déléter.
Par exemple, pour les bactéries, on peut viser de créer des mutants métaboliques, en délétant des
gènes liés au métabolisme des acides aminés. Les bactéries deviennent incapables de se multiplier.
On peut également déléter des gènes de virulence par recombinaison homologue. On peut choisir
le gène de telle façon qu’il devient possible de différencier les animaux vaccinés des animaux
Vaccinologie – Applications vaccinales de la génétique moléculaire – page 2/9
infectés. On parle de vaccin marqueur (cette méthode s’inscrit dans la stratégie DIVA :
Differenciating Infected From Vaccinated Animals, yeah baby).
Exemples :
. Maladie d’Aujeszky : on a atténué le vaccin par délétion du gène tk et du gène gE (codant
pour la glycoprotéine E).
. Rhinotrachéite infectieuse bovine : il y a également délétion du gène Ge. Ainsi, on peut
reconnaître les animaux vaccinés des animaux infectés. En effet, la souche vaccinale ne possédant
pas la glycoprotéine gE, les animaux vaccinés n’auront pas d’anticorps anti gE ; contrairement aux
infectés. Capiche ?
c) Vaccin recombinant réplicatif
Cette méthode consiste à introduire dans le génome d’un vecteur vivant (virus, bactérie non
pathogène) un gène codant pour un antigène contre lequel on peut vacciner.
Il faut donc un vecteur non pathogène (ou atténué), facile à manipuler, stable génétiquement et
permettant une bonne expression des protéines.
Utilisation des Poxvirus
Principe : On utilise une souche
atténuée d’un Poxvirus
sauvage.
Sur un plasmide de transfert,
on insère le gène de l’antigène
vaccinal que l’on veut obtenir ;
placé à la suite d’un
promoteur viral poxvirus. De
part et d’autre, on insère des
séquences du génome viral
selon l’endroit où l’on veut
insérer notre séquence
vaccinale, et le gène viral que
l’on veut déléter.
On cultive, ensuite des cellules, que l’on va infecter par un poxvirus et transfecter avec le
plasmide.
Il y a alors recombinaison homologue (équivalent à un double crossing-over) entre les séquences
identiques, ce qui permet d’obtenir le gène vaccinal dans le génome viral.
Exemples
. Vaccins, sous forme d’appâts, utilisés pour vacciner les renards contre la rage il y a
quelques années en Europe. Il s’agit du virus de la Vaccine, dans lequel on a inséré le gène codant
pour la glycoprotéine G de la rage. On a alors une vaccination à double valence (= contre les deux
maladies)
. Autre exemple, un vaccin en cours de demande d’AMM : Christelle Camus nous annonça
non sans émotion dans la voix, que ce vaccin a été créé par notre cher Stéphaaagnoliiii, ici à
l’école ! Il s’agit d’une souche du virus myxomateux atténué (utilisé pour la vaccination contre la
myxo) ; dans laquelle on a inséré le gène codant pour la protéine VP6O de la maladie
hémorragique du lapin. On a donc un vaccin à double valence. C’est magique !
Vaccinologie – Applications vaccinales de la génétique moléculaire – page 3/9
(Le vaccin aujourd’hui utilisé pour la maladie hémorragique est un vaccin inactivé qui coûte cher.
En effet, il est produit à partir de lapins que l’on infecte, et dont on récupère le foie contenant une
quantité importante de virus)
. Vaccin de l’Influenza aviaire, est un vaccin recombinant. Il s’agit d’un Fowlpox, auquel on
ajoute le gène de l’hémagglutinine de l’influenza de type 5.
Attention le vaccin est inefficace si l’animal a déjà été infecté par le Fowlpox sauvage (l’animal est
alors immunisé ; après la vaccination la réponse est trop rapide, le vaccin est détruit et on a alors
pas d’immunisation contre l’influenza).
Autres exemples de virus recombinant :
. Virus recombinant entre une souche du virus de la maladie de Newcastle et le gène HA de
l’Influenza. On a de nouveau un virus à double valence.
Or le virus de Newcastle est un virus à ARN négatif non segmenté. Afin de modifier son génome, les
chercheurs utilisent la génétique inverse.
Principe : On clone le génome entier du
virus de la maladie de New Castle dans un
plasmide, dans lequel on insère le gène de
l’HA aviaire précédé d’une séquence
promotrice pour une ARN polymérase
(T7). En parallèle, on clone dans différents
plasmides les gènes codant pour les
protéines virales, sous influence du même
promoteur.
On cultive alors des cellules de
mammifères, dans lesquels on rajoute le
gène de l’ARN polymérase T7. On infecte
ces cellules par tous les plasmides. Il y a
alors synthèse d’ARN viral positif, puis
d’ARN négatif grâce à l’ARN polymérase ;
et production de l’ensemble des protéines
virales grâce aux plasmides. On a alors
production de particules virales complètes
assemblées : virions avec New Castle + HA Influenza.
Une fois ces premières particules obtenues, il suffit de les mettre en culture classiquement, sans
passer par toutes ces étapes ; pour obtenir de nombreuses particules de souche recombinante.
Intérêt des vecteurs recombinants réplicatifs
. Il est possible d’en faire des vaccins marqueurs.
. On ne manipule pas d’antigène pathogène, seulement le génome.
. Il est possible de vacciner contre les maladies ; dont l’agent ne peut être cultivé (virus de
l’hépatite B), ou que celui-ci soit très dangereux, contagieux.
. Les vaccins à base de Poxvirus sont très stables, notamment à la chaleur ; il n’ya donc pas
de problème de conservation.
Risques des vecteurs recombinants réplicatifs
. Risque lié au vecteur, notamment chez les immunodéprimés.
Vaccinologie – Applications vaccinales de la génétique moléculaire – page 4/9
. Risque lié à la réplication : on a des phénomènes de dissémination et de recombinaison
possible.
Tous ces risques, font qu’à l’heure actuelle, seuls des vaccins vétérinaires ont reçu une AMM.
II. Vaccins à agent inerte
Il s’agit des vaccins sous-unités ou peptidiques avec des antigènes purifiés in vitro.
Il n’y a alors pas d’agent pathogène vivant injecté mais seulement une protéine ou un morceau de
protéine.
Les vaccins sous-unités et peptidiques respectent les notions suivantes :
 Les fractions immunogènes sont isolées à partir de l’agent pathogène ou produites par voie
génétique (système procaryote ou eucaryote)
 Comme il s’agit d’une protéine seulement, l’innocuité est parfaite.
 le coût de production est réduit (si clonage).
 il y a possibilité de faire des vaccins marqueurs.
 étant donné que la réponse immunitaire est moins bonne qu’avec le virus, il est nécessaire
d’ajouter des adjuvants pour la stimuler.
a) Vaccins sous unités : production in vitro
Pour fabriquer un vaccin sous-unités on prend une protéine immunogène, on la purifie in vitro et
on utilise le produit obtenu comme vaccin (à condition d’ajouter des adjuvants).
On choisit le système de telle façon que :
 La culture soit facile
 On peut réaliser une production importante des protéines
 On peut réaliser une maturation post-traductionnelle si besoin, par exemple si la protéine
est a besoin d’être produite sous forme glycosylée.
 La purification est facile
Par exemple, on peut utiliser des
cellules de mammifères en
culture. Sur le plasmide, on
trouve le gène qui code pour la
protéine. On le fait entrer dans
la cellule par transfection (ou
infection si on utilise un Poxvirus
à la place du plasmide). Il y a
alors synthèse de la protéine,
que l’on purifie. On obtient alors
un vaccin par ajout d’adjuvants.
Exemple 1.
Exemple de systèmes bactériens :
- Vaccin FeLV (chat)  utilisation de plasmide et E.coli, et protéine p45 du FeLV
- Vaccin : Leucogen™ Virbac
Vaccinologie – Applications vaccinales de la génétique moléculaire – page 5/9
Exemple de Système eucaryote :
- Vaccin contre l’Hépatite B (homme) : 2 types de productions différentes
 Utilisation de plasmide, de levure et de l’antigène de surface du virus de l’hépatite
HbSag. Vaccin : Engerix® B GlaxoSmithKline
 Utilisation du même gène HbSag mais production sur cellules animales : les cellules
CHO (Cellules d’Ovaires d’Hamster chinois) Vaccin : GenHevac® Sanofi Pasteur
Exemple 2.
Papillomavirus humain 6, 11, 16 et 18 (responsable du cancer du col de l’utérus) : Gardasyl
 Utilisation de plasmide intégré dans une levures et de gènes de protéines L1.
On fait la même manipulation pour les 4 souches différentes de papillomavirus. On mélange les
protéines L1 obtenues qui s’associent entre elles naturellement et forment des pseudo-particules
virales (= elles ne contiennent pas de génome) mais leur structure est similaire à celle d’un vrai
virus. Par conséquent la réponse immunitaire est beaucoup plus efficace que contre une protéine
en solution.
Vaccin : VLP L1 Gardasil® Sanofi Pasteur
Exemple 3.
Animaux ou plantes transgéniques : il n’y a pas encore de vaccin sur le marché.
Le principe est grossièrement le suivant : on introduit l’antigène dans la plante et on doit manger
la plante pour être vacciné. De nombreux essais sont réalisés sur la pomme de terre et la banane,
mais le rendement reste médiocre et ce type de notion reste mal accepté par l’opinion publique
(de plus, pour être efficace, il faut manger cru ces aliments, pas tip top pour la patate).
Avec les animaux, le risque de dissémination est moins important. On utilise un promoteur
spécifique (avec expression dans les glandes mammaires, la vessie et le blanc d’œuf) qui permet
l’expression du transgène. Les espèces tests sont la truie, la lapine et la chèvre, chez qui on utilise
surtout des promoteurs de caséine.
Il n’y a pas encore de vaccin sur le marché cependant, une molécule de lait de chèvre
transgénique (qui exprime l’antithrombine humaine) est commercialisée. Elle exprime
l’antithrombine, qui est une molécule anticoagulante. De plus, la production annuelle d’une
chèvre équivaut aux échantillons obtenus sur plus de 90 000 hommes.
En développement, production de VLP (VP2 + VP6) de Rotavirus dans le lait de lapines (INRA vaccination gastroentérite à Rotavirus).
b) Vaccins peptidiques
Ce sont des vaccins qui utilisent uniquement des épitopes = une petite partie de la protéine
immunogène.
Les épitopes sont faciles à produire et stables. On peut les obtenir par synthèse chimique ou génie
génétique (par clonage de la séquence) et ils possèdent un excellent contrôle qualité. Toutefois, ils
sont peu immunogènes, d’où ajout d’adjuvants et couplage= on les accroche à une protéine qui va
stimuler la réponse immunitaire.
Il n’y a pas encore de commercialisation mais des essais sont réalisés pour la fièvre aphteuse chez
les bovins et la parvovirose chez les chiens.
Vaccinologie – Applications vaccinales de la génétique moléculaire – page 6/9
III. Les vaccins intermédiaires
Il y a deux catégories :
- les vaccins à ADN
- les vaccins recombinants non
réplicatifs (c’est-à-dire que le virus est
vivant mais il n’y a pas multiplication
dans l’hôte).
a) Vaccin recombinant non réplicatif
 Canarypox-FeLV chez le chat
On utilise les gènes env (enveloppe) et gag (protéine P27).
Après infection et/ou transfection, il y a intégration des gènes env et gag au sein du génome
Canarypox (non réplicatif chez le chat), et on obtient le vaccin contre FeLV.
Ce type de vaccin est intermédiaire dans la mesure où il possède l’efficacité d’un vaccin vivant
mais il n’y a pas de multiplication ni dissémination, donc l’innocuité d’un vaccin inerte.
 Canarypox-influenza équin
Même principe avec ajout du gène hémagglutinine influenza au virus équin.
 Fowlpox chez les volailles est réplicatif mais chez les autres espèces en est-il de même ?
chez le chat
Chez le chat, le vaccin est non réplicatif. On vaccine deux fois et on récupère le sérum sur lequel
on réalise le test d’inhibition de l’hémagglutinine. On constate une bonne inhibition, cela
s’explique par la production importante d’anticorps qui interagissent avec l’hémagglutinine. Par
ailleurs, avec des HA hétérologues, le chat produit tout de même du sérum avec des anticorps qui
peuvent inhiber.
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b) Vaccins à ADN
On utilise directement les gènes codant pour les antigènes qui sont ensuite exprimés in vivo (ce
qui implique une transcription et une traduction). On a une immunisation génétique et
l’administration se fait par voie IM ou ID.
La protéine exprimée par l’organisme va induire la réponse immunitaire.
Il faut toutefois que le plasmide rentre dans la cellule puis qu’il passe dans le noyau. Ensuite, l’ARN
est transcrit et l’antigène va être synthétisé. Il est alors soit dans le cytoplasme, soit dans la
membrane plasmique ou bien sécrété.
Avantages :
 Expression prolongée : le plasmide reste longtemps dans la cellule
 Efficacité proche vaccin vivant mais il y a moins d’interférence avec immunité d’origine
maternelle : on peut alors vacciner le plus tôt possible.
 Innocuité
 Effet adjuvant de l’ADN : l’ADN stimule la réponse immunitaire
 Facile à manipuler, à produire (cf plasmide)
 Stables
 Multivalents (on peut placer plusieurs gènes sur le même plasmide)
 Coût faible, contrôle qualité bon (car petite molécule d’ADN circulaire)
Inconvénients :
 mutagénèse insertionnelle : intégration de plasmide dans le génome.
 Induction d’anticorps anti-ADN (révélé au cours des essais)
 Phénomènes de tolérance : l’organisme produisant la protéine, elle peut être prise pour
une molécule du soi et il n’y a alors pas de production d’anticorps.
De nombreux vaccins sont en cours d’essais cliniques tels que :
Virus : parvovirus canin, virus de la maladie des muqueuses (bovins), virus Influenza, Herpesvirus
bovin, maladie de Gumboro (poulet)
Bactéries : Chlamydia...
Parasites : Coccidies, Toxoplasmose...
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BILAN
CONCLUSION
Nouvelles approches vaccinales
 Connaissance agent pathogène et pathogénie de la maladie, c’est-à-dire les gènes à
l’origine de la virulence et de l’effet pathogène.
 Connaissance des mécanismes immunitaires efficaces : savoir quel type de virus induit
une réponse de type Th1 ou Th2 et si la réponse est mucosale ou cellulaire.
 Recherche et caractérisation des antigènes majeurs qui permettent une protection :
savoir quels antigènes permettent la meilleure protection.
 Stratégies moins empiriques et plus sûres (plus sur que le vaccin atténué au hasard).
3-
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