Noms des roneotypeurs

Vaccinologie – Applications vaccinales de la génétique moléculaire – page 1/9
Wenisch Emilie – Valy Laure
Date 24/04/09
Steph -- Chloé
VACCINOLOGIE
Heure 15h45-16h00
C. CAMUS
APPLICATIONS VACCINALES DE LA GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE
Nous allons voir dans ce cours comment utiliser les techniques de biologie moléculaire pour créer
de nouveaux vaccins.
Les vaccins classiques sont de deux types :
 Vivant atténué : (développé depuis de nombreuses années) ; ce sont des souches apathogènes
obtenues soit de façon naturelle, soit provoquées de façon empirique : mise en culture pendant
un temps très long. Par exemple, au labo de maladies contagieuses de l’ENVT, une souche de
terrain a été cultivée sur œufs embryonnés (et non sur cellules animales) à 33°C (et pas 37), le
génome s’en est ainsi trouvé modifié et on a obtenu la souche atténuée toujours utilisé dans les
vaccins.
 Inactivé : la souche pathogène est traitée soit par traitement chimique, soit par chaleur et on
obtient le virus inactivé.
Les nouvelles générations de vaccins sont à agent vivant atténué, inerte (correspondant à
inactivé) ou intermédiaire.
 Vaccins vivants atténués classiques
Ils sont efficaces à faible dose (car vivants), permettant ainsi un nombre limité d’administrations
(moins de rappels), avec une réponse immunitaire très proche de celle se produisant avec l’agent
pathogène sauvage. Il n’y a aucune restriction de voie d’administration. De plus, une fois la souche
atténuée obtenue, il suffit de l’amplifier donc l’obtention du vaccin est à faible coût.
Mais ces vaccins présentent l’inconvénient de provoquer des maladies vaccinales (si l’atténuation
n’est pas suffisante), ou des phénomènes d’immunodépression. Du coup bien souvent on ne les
utilise pas sur des petits animaux. Il y a aussi des problèmes de contamination : par exemple en
Asie, des lots de vaccins contre la maladie de Marek ont été contaminés par le virus de la
réticuloendothéliose aviaire, entraînant la mort de milliers de volailles.
Les souches atténuées étant vivantes, elles se multiplient dans l’organisme donc il peut y avoir
transmission entre animaux, ou encore des phénomènes de réversion, des recombinaisons
pouvant faire apparaître de nouvelles souches virulentes.
Problème aussi de conservation de ces souches atténuées.
Laëti et Vanessa
24/04/09
Noms des correcteurs
Vaccinologie
16H-17H
Camus
 Vaccins inactivés classiques
L’agent est tué donc il y a innocuité totale ; et ils sont beaucoup plus stables.

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Cependant ils présentent aussi un certain nombre d’inconvénients :
. Lors des différentes techniques d’inactivation, on peut avoir une modification de la
conformation des différentes protéines (par exemple, lors d’inactivation par haute température).
Les anticorps, créés lors de la réponse immunitaire, vont donc moins bien reconnaître les
protéines virales. L’efficacité vaccinale est alors moindre que celle obtenue avec un virus atténué.
. Vu que l’efficacité est plus faible, la stratégie de vaccination va nécessiter plusieurs
administrations ; et l’utilisation d’adjuvants pour stimuler la réponse immunitaire.
. On a donc un coût plus important.
 Nouvelles stratégies vaccinales utilisation de la génétique moléculaire
I. Vaccin à agent vivant
Il existe trois types de vaccins à agent vivant :
a) Vaccin atténué classique (vu plus haut), qui est obtenu après modification génétique
aléatoirement.
b) Vaccin atténué par mutagenèse dirigée, où cette fois on va cibler la mutation que l’on veut
obtenir. Il s’agit le plus souvent de délétion, et non de mutation ponctuelle ; afin d’éviter les
phénomènes de réversion.
c) Vaccin recombinant réplicatif ; où l’on insère dans le génome viral un gène codant pour une
protéine d’intérêt vaccinal (protéine de surface), par l’intermédiaire d’un vecteur.
NB : réplicatif= il y a multiplication possible au sein de l’hôte.
a) Vaccin atténué classique : vu plus haut
b) Vaccin atténué par mutagenèse dirigée
Cette méthode permet d’augmenter la stabilité du vaccin, et de diminuer les risques de
réversion, en ciblant le gène que l’on va déléter.
Par exemple, pour les bactéries, on peut viser de créer des mutants métaboliques, en délétant des
gènes liés au métabolisme des acides aminés. Les bactéries deviennent incapables de se multiplier.
On peut également déléter des gènes de virulence par recombinaison homologue. On peut choisir
le gène de telle façon qu’il devient possible de différencier les animaux vaccinés des animaux

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infectés. On parle de vaccin marqueur (cette méthode s’inscrit dans la stratégie DIVA :
Differenciating Infected From Vaccinated Animals, yeah baby).
Exemples :
. Maladie d’Aujeszky : on a atténué le vaccin par délétion du gène tk et du gène gE (codant
pour la glycoprotéine E).
. Rhinotrachéite infectieuse bovine : il y a également délétion du gène Ge. Ainsi, on peut
reconnaître les animaux vaccinés des animaux infectés. En effet, la souche vaccinale ne possédant
pas la glycoprotéine gE, les animaux vaccinés n’auront pas d’anticorps anti gE ; contrairement aux
infectés. Capiche ?
c) Vaccin recombinant réplicatif
Cette méthode consiste à introduire dans le génome d’un vecteur vivant (virus, bactérie non
pathogène) un gène codant pour un antigène contre lequel on peut vacciner.
Il faut donc un vecteur non pathogène (ou atténué), facile à manipuler, stable génétiquement et
permettant une bonne expression des protéines.
Utilisation des Poxvirus
Principe : On utilise une souche
atténuée d’un Poxvirus
sauvage.
Sur un plasmide de transfert,
on insère le gène de l’antigène
vaccinal que l’on veut obtenir ;
placé à la suite d’un
promoteur viral poxvirus. De
part et d’autre, on insère des
séquences du génome viral
selon l’endroit où l’on veut
insérer notre séquence
vaccinale, et le gène viral que
l’on veut déléter.
On cultive, ensuite des cellules, que l’on va infecter par un poxvirus et transfecter avec le
plasmide.
Il y a alors recombinaison homologue (équivalent à un double crossing-over) entre les séquences
identiques, ce qui permet d’obtenir le gène vaccinal dans le génome viral.
Exemples
. Vaccins, sous forme d’appâts, utilisés pour vacciner les renards contre la rage il y a
quelques années en Europe. Il s’agit du virus de la Vaccine, dans lequel on a inséré le gène codant
pour la glycoprotéine G de la rage. On a alors une vaccination à double valence (= contre les deux
maladies)
. Autre exemple, un vaccin en cours de demande d’AMM : Christelle Camus nous annonça
non sans émotion dans la voix, que ce vaccin a été créé par notre cher Stéphaaagnoliiii, ici à
l’école ! Il s’agit d’une souche du virus myxomateux atténué (utilisé pour la vaccination contre la
myxo) ; dans laquelle on a inséré le gène codant pour la protéine VP6O de la maladie
hémorragique du lapin. On a donc un vaccin à double valence. C’est magique !

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(Le vaccin aujourd’hui utilisé pour la maladie hémorragique est un vaccin inactivé qui coûte cher.
En effet, il est produit à partir de lapins que l’on infecte, et dont on récupère le foie contenant une
quantité importante de virus)
. Vaccin de l’Influenza aviaire, est un vaccin recombinant. Il s’agit d’un Fowlpox, auquel on
ajoute le gène de l’hémagglutinine de l’influenza de type 5.
Attention le vaccin est inefficace si l’animal a déjà été infecté par le Fowlpox sauvage (l’animal est
alors immunisé ; après la vaccination la réponse est trop rapide, le vaccin est détruit et on a alors
pas d’immunisation contre l’influenza).
Autres exemples de virus recombinant :
. Virus recombinant entre une souche du virus de la maladie de Newcastle et le gène HA de
l’Influenza. On a de nouveau un virus à double valence.
Or le virus de Newcastle est un virus à ARN négatif non segmenté. Afin de modifier son génome, les
chercheurs utilisent la génétique inverse.
Principe : On clone le génome entier du
virus de la maladie de New Castle dans un
plasmide, dans lequel on insère le gène de
l’HA aviaire précédé d’une séquence
promotrice pour une ARN polymérase
(T7). En parallèle, on clone dans différents
plasmides les gènes codant pour les
protéines virales, sous influence du même
promoteur.
On cultive alors des cellules de
mammifères, dans lesquels on rajoute le
gène de l’ARN polymérase T7. On infecte
ces cellules par tous les plasmides. Il y a
alors synthèse d’ARN viral positif, puis
d’ARN négatif grâce à l’ARN polymérase ;
et production de l’ensemble des protéines
virales grâce aux plasmides. On a alors
production de particules virales complètes
assemblées : virions avec New Castle + HA Influenza.
Une fois ces premières particules obtenues, il suffit de les mettre en culture classiquement, sans
passer par toutes ces étapes ; pour obtenir de nombreuses particules de souche recombinante.
Intérêt des vecteurs recombinants réplicatifs
. Il est possible d’en faire des vaccins marqueurs.
. On ne manipule pas d’antigène pathogène, seulement le génome.
. Il est possible de vacciner contre les maladies ; dont l’agent ne peut être cultivé (virus de
l’hépatite B), ou que celui-ci soit très dangereux, contagieux.
. Les vaccins à base de Poxvirus sont très stables, notamment à la chaleur ; il n’ya donc pas
de problème de conservation.
Risques des vecteurs recombinants réplicatifs
. Risque lié au vecteur, notamment chez les immunodéprimés.

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. Risque lié à la réplication : on a des phénomènes de dissémination et de recombinaison
possible.
Tous ces risques, font qu’à l’heure actuelle, seuls des vaccins vétérinaires ont reçu une AMM.
II. Vaccins à agent inerte
Il s’agit des vaccins sous-unités ou peptidiques avec des antigènes purifiés in vitro.
Il n’y a alors pas d’agent pathogène vivant injecté mais seulement une protéine ou un morceau de
protéine.
Les vaccins sous-unités et peptidiques respectent les notions suivantes :
 Les fractions immunogènes sont isolées à partir de l’agent pathogène ou produites par voie
génétique (système procaryote ou eucaryote)
 Comme il s’agit d’une protéine seulement, l’innocuité est parfaite.
 le coût de production est réduit (si clonage).
 il y a possibilité de faire des vaccins marqueurs.
 étant donné que la réponse immunitaire est moins bonne qu’avec le virus, il est nécessaire
d’ajouter des adjuvants pour la stimuler.
a) Vaccins sous unités : production in vitro
Pour fabriquer un vaccin sous-unités on prend une protéine immunogène, on la purifie in vitro et
on utilise le produit obtenu comme vaccin (à condition d’ajouter des adjuvants).
On choisit le système de telle façon que :
 La culture soit facile
 On peut réaliser une production importante des protéines
 On peut réaliser une maturation post-traductionnelle si besoin, par exemple si la protéine
est a besoin d’être produite sous forme glycosylée.
 La purification est facile
Par exemple, on peut utiliser des
cellules de mammifères en
culture. Sur le plasmide, on
trouve le gène qui code pour la
protéine. On le fait entrer dans
la cellule par transfection (ou
infection si on utilise un Poxvirus
à la place du plasmide). Il y a
alors synthèse de la protéine,
que l’on purifie. On obtient alors
un vaccin par ajout d’adjuvants.
Exemple 1.
Exemple de systèmes bactériens :
- Vaccin FeLV (chat)  utilisation de plasmide et E.coli, et protéine p45 du FeLV
- Vaccin : Leucogen™ Virbac