PROCESSUS D`EVALUATION DES PROJETS DE THESE

Année 2015-2016 - Demande d’allocation doctorale
ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV) n°549
1. Informations administratives :
Nom de l’encadrant responsable de la thèse : Marie POTIER-CARTEREAU
Unité : Inserm U 1069
Email de l’encadrant : [email protected]
2. Titre de la thèse : Régulation de la signalisation calcique sensible aux lipides des cellules
cancéreuses par le micro-environnement osseux.
3. Résumé :
Le développement de métastases osseuses (MO) est une complication fréquente, sévère et invalidante
chez les patients atteints de cancer. Ces MO se rencontrent chez 70% des patients métastatiques ayant
un cancer de la prostate ou un cancer du sein. Nous avons montré que des canaux calciques Orai
associés au canal potassique SK3, favorisaient la migration des cellules cancéreuses et le
développement de MO en contrôlant des entrées de calcium spécifiques et modulées par des lipides.
En parallèle, nous avons décrit pour la première fois que des anticorps monoclonaux thérapeutiques
(mAbs), modulaient cette signalisation calcique impliquée dans la migration cellulaire et qu'il était
possible de modifier leur réponse en inhibant l'association Orai1/SK3 par des lipides1. Cependant, le
rôle du micro-environnement osseux (ostéoblastes/ostéoclastes et les facteurs solubles) dans ces
mécanismes n’est pas connu et est important à documenter dans l'optique de développer des approches
thérapeutiques permettant de traiter ou, de façon plus ambitieuse, de prévenir cette pathologie osseuse
et ces conséquences catastrophiques pour les patients. Les objectifs de ce projet sont de :
1.
Étudier la régulation de la signalisation calcique et des canaux calciques par le microenvironnement osseux.
Nous étudierons les effets de facteurs du micro-environnement osseux sur la migration dépendante de
la signalisation calcique. Ainsi nous proposons de tester différents facteurs solubles du microenvironnement osseux tels que : le SDF-1, le collagène, le Ca2+, le TGFβ1 (transforming growth
factor β1), le RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), les BMP (bone
morphogenetic proteins)…Nous déterminerons précisément les effets de ces facteurs solubles sur les
influx calciques dépendants de la vidange en Ca2+ du réticulum endoplasmique (SOCE) et
indépendants de la vidange en Ca2+ du réticulum endoplasmique (influx SICE = influx stimuler par
l'acide arachidonique (ARC) et influx constitutif). Les tests de migration/invasion et d’adhésion
seront réalisés en présence ou non des différents facteurs du micro-environnement osseux avec ou
sans apamine (bloqueur du canal SK3) pour évaluer le rôle du canal SK3, partenaire important dans le
développement de MO. La modulation de l’expression des canaux calciques par les facteurs du microenvironnement sera évaluée par western blotting et Q-PCR. Les mêmes expériences seront réalisées
avec des milieux conditionnés de l’os en partenariat avec le Dr. L. Cronier (Equipe I2PC, Poitiers).
Nous analyserons en même temps la composition lipidique de ces milieux conditionnés osseux afin
d’identifier des lipides particuliers synthétisés par le micro-environnement osseux et pouvant moduler
la signalisation calcique. Conjointement, l’exploration de l’expression des complexes de canaux
calciques d’intérêts dans les MO de cancer de la prostate en fonction du statut hormonal sera
effectuée au laboratoire par le Pr Fromont-Hankard.
2.
Tester des modulateurs de ces canaux calciques (anticorps commerciaux dirigés contre les
canaux, petites molécules lipidiques et hétérocycliques synthétisées par les chimistes du
réseau canaux ioniques du CGO).
Nous avons déjà pu mettre en évidence que l’activité de canaux calciques pouvaient être modulée par
des anticorps commerciaux, des lipides ainsi que des molécules hétérocycliques1,2. Les tests seront
réalisés sur les cellules cancéreuses du sein et de la prostate. L’efficacité des modulateurs sera évaluée
en imagerie calcique puis pour les molécules retenues en patch clamp. Enfin les molécules les plus
pertinentes seront testées sur leur capacité à moduler la migration, l’invasion et l’adhésion cellulaire
in vitro.
3.
Tester in vitro et in vivo ces modulateurs sur le développement de MO, seuls ou bien en
association avec des anticorps monoclonaux (denosumab) et les biphosphonates
prescrits pour retarder la survenue d’accidents osseux suite aux développent de MO.
Nous étudierons si les molécules ou anticorps modulateurs de la signalisation calcique sélectionnés
peuvent i) moduler la colonisation osseuse en interférant avec les canaux calciques et ii) moduler
l'efficacité voir sensibiliser au traitement comme le denosumab ou les biphosphonates dans le cadre
de MO. In vivo, l’évaluation du potentiel ostéolytique de nos modèles cellulaires (sein et prostate)
sera réalisée sur deux modèles animaux : i) greffes de cellules cancéreuses dans les fémurs de rat
(partenariat avec la société Atlantic Bone Screen, Nantes) et ii) xénogreffes orthotopiques chez la
souris (plateforme in vivo du CGO, Nantes). En parallèle nous réaliserons des tests in vitro en milieux
conditionnés (migration, invasion, adhésion) en présence ou non des modulateurs les plus pertinents
utilisés seuls et en association avec le denosumab ou les biphosphonates.
Perspectives du projet.
Ce projet propose que les acteurs de la signalisation calcique jouent un rôle critique dans le
développement des cancers à tropisme osseux marqués (sein et prostate) devenant ainsi soient des
marqueurs pronostiques intéressants, et/ou soient des cibles pharmacologiques/thérapeutiques
essentielles dans la cadre de MO. La validation de nouveaux bio-marqueurs prédictifs de l'efficacité
des traitements apportera une aide médicale significative pour la prescription de médicaments tels les
anticorps monoclonaux déjà utilisés dans le cas de MO et aidera à envisager de nouvelles stratégies
thérapeutiques «à la carte». Ce projet fait partie du réseau canaux ioniques et cancer du CGO et du
projet « lipides comme modificateurs de la réponse aux biothérapies » ARD2020 et est
complémentaire à un projet INCa dans lequel nous sommes partenaires et qui est coordonné par le Pr
Natalia Prevarskaya PLIBIO 2014-2019 « Identification de la signature des canaux ioniques comme
marqueurs pronostiques et cibles thérapeutiques des métastases prostatiques ».
1.Maxime Guéguinou et al.,. The alkyl-lipid Ohmline modifies the anti-EGFR mAbs action through
the control of calcium signaling and Akt in colon cancer cells. En révision favorable dans Oncotarget
2.Thèse de Doctorat M. Guéguinou : «Complexes canalaires KCa/Ca sensibles aux éthers-lipides :
régulation de la signalisation calcique dans la migration des cellules cancéreuses».
Principales techniques utilisées (déjà validées au laboratoire).
- Culture cellulaire pour évaluer prolifération, migration et invasivité cellulaire
Migration/Invasion sur inserts
- Biologie moléculaire et cellulaire (extraction d’ADN, ARN, transfection cellulaire, Western
blot, RT-et Q-PCR).
- Etude des radeaux lipidiques et caveolae et leur importance dans la signalisation calcique :
localisation des canaux calciques
- Microscopie de fluorescence (confocale)
- Imagerie calcique sur cellules adhérentes ou en suspension : mesure dynamique des flux
calcique grâce à une sonde calcique fluorescente ratiométrique.
- Patch-clamp : mesure des courants calciques
- Etudes In vivo : réalisées sur la plateforme in vivo du CGO et chez Atlantic Bone Screen