Bactéries IOA = +
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Rôle du laboratoire de bactériologie dans le diagnostic des IOA du prélèvement … aux techniques moléculaires Frédéric LAURENT Laboratoire de Bactériologie - Hôpital de la Croix Rousse CNR des Staphylocoques INSERM 851 – Equipe "Pathogénie des Staphylocoques" Trois acteurs majeurs dans la prise en charge bactériologique des IOA Chirurgien orthopédiste / Pédiatre/ Rhumatologue Evacuer / Nettoyer Prélever Microbiologiste Détecter Identifier Mesurer la sensibilité aux antibiotiques Antibiothérapeute Interpréter Choisir de l’antibiothérapie optimale Points critiques pour le microbiologiste • Gestion des prélèvements • Conditions / Délais de cultures • Détection et identification de variants ou de souches différentes • Interprétation et rendu clair et cohérent des résultats qui puissent aider à la décision thérapeutique Difficultés rencontrées avec les IOA par le bactériologiste • Bactéries IOA = +/- bactéries de la flore cutanée • Infections plurimicrobiennes • Bactéries fragiles • • Bactéries physiologiquement peu actives Antibiothérapie préalable au prélèvement • Bactéries cachées – intracellulaires – biofilm • Bactéries normale (IOA aiguë) vs bactéries stressées (IOA chronique) Contamination ou pas ? Gestion des prélèvements +++ Cultures longues Milieux riches Multiplicité des milieux Traitement adéquat des prélèvements Expression phénotypique variée Gestion des prélèvements Eviter toute contamination Bactéries IOA = +/- bactéries de la flore cutanée . nature du prélèvement . fistule, trajet de fistule = Se et Sp médiocre . biopsies tissulaires, pus, tissus per-op, liquide articulaire, synoviale, … +++ . post-prélèvement . pots ou tubes secs stériles / seringue sans aiguilles et closes . Hotte PSM, gants stériles, matériel stérile et ou à usage unique Ensemencer dans les meilleurs délais Bactéries fragiles . transport rapide (<4 heures) / Portagerm® ou équivalent / ensemencement au bloc ? . prévenir si arrivée tardive au laboratoire Gestion des prélèvements Sélectionner les prélèvements … pour IOA sur prothèse ni trop ... ni trop peu - ↑ risque contamination - pb gestion au laboratoire . 15 minutes/prelts/technicienne . matériel pour broyage . identification/localisation - taux positifs = critère d’interprétation Spe 1+ / 5 à 7 prelts 26% 2+ / 5 à 7 prelts 53% 3+ / 5 à 7 prelts 85% Altweg, JSJB, 2003 + identification du patient, du service, du prescripteur, du prélèvement Examen direct Permettre éventuellement une orientation diagnostic rapide . présence de bactéries et morphologie (sensibilité faible) Gram, Ziehl, auramine . présence d’une réaction cellulaire signant une infection coloration MGG : PNN, macrophages Numération des éléments et formule pour liquide articulaire Liquide articulaire sans prothèse < 1 000 GB 5 000 - 60 000 GB/mm3 < 20% PNN 50% PNN Arthrose PR Trauma Algodystrophie Mécanique 60-80% PNN 100 000 GB > 90%PNN > 90% PNN Réactionnelle Cristaux Infection Lupus Chlamydia, Yersinia, Salmonelle, Shigelle, Campylo, Neisseria, Lyme Infection Psoriasis ……… PCR Cristaux Inflammatoire +/- septique Mathews, Ann. Rheum Dis., 2007 Septique Examen direct Permettre éventuellement une orientation diagnostic rapide . présence de bactéries (sensibilité faible) et morphologie Gram, Ziehl , auramine . présence d’une réaction cellulaire signant une infection MGG (PNN, macrophages) Numération des éléments et formule pour liquide articulaire Liquide articuliare avec prothèse Infection sur PTG Sensibilité Spécificité GB > 1700 / mm3 94% 88% PNN > 65% 97% 98% ** Trampuz, Am J Med , 2004 sensibilité = vrais (+), spécificité = vrais (-) Mise en culture Présence de bactéries ? Lesquelles ? Quels sont les antibiotiques actifs ? Mise en culture Présence de bactéries ? Lesquelles ? Quels sont les antibiotiques actifs ? Bactéries IOA = +/- biofilm / intracellulaire X 2940 2h 4h 8h Fixation des S. aureus Début de fabrication du "slime " La surface du matériel est recouverte par une couche épaisse de "slime" sur des irrégularités à la surface du matériel Olson, Olson, et al. al. J. Biomed Mater Res 1988 24 h Des bactéries émergent du biofilm, libres et prêtes à se fixer ailleurs Mise en culture Bactéries IOA = +/- biofilm / intracellulaire COCCI X 2940 Cocci au fond d'une cassure d'une couche épaisse de biofilm d'un séquestre infecté Evans et al., Clin Orthop. 1998, 243-249 Mise en culture Bactéries IOA = +/- biofilm / intracellulaire X 1000 Bactéries (points noirs) internalisées dans les ostéocytes entourés par des lamelles osseuses. (Internalization of S. aureus by osteoblasts in a patient with long term recurrent osteomyelitis JBJS 2005) Mise en culture Bactéries IOA = biofilm / intracellulaire donc des bactéries cachées, engluées et adhérentes des bactéries stressées des bactéries physiologiquement peu actives Bactéries IOA = très diverses donc des bactéries aérobies des bactéries anaérobies des bactéries à croissance rapide / lente des bactéries classiques / des bactéries exigeantes/non cultivables Mise en culture Recommandation Référentiel de Microbiologie REMIC 2007 – Broyage avant ensemencement (merci de nous adresser des morceaux pas trop gros !!!) . mortier/pilon, broyeur à billes, … . sonication (Trampuz, 2007 NEJM) – Cultures . prolongées au moins 10 jours . en aérobiose et anaérobiose . sur géloses riches sang et chocolat isovitalex / J1-J10 . en bouillons d’enrichissement J10 à J21 repiquage systématique des bouillons même si clairs +++ . en bouillons d’hémoculture pour liquides articulaires + recherche de mycobactéries pas systématique mais y penser (surtout si négatif) Mise en culture • Gélose Sang aérobie + gélose chocolat CO2 (lecture à J2) • Gélose Sang anaérobie + gélose chocolat CO2 (lecture à J10) • Bouillon liquide (lecture jusqu’à J21) + repiquage sytématique: . gélose sang anaérobie + gélose chocolat lecture CO2 . lecture 48h Diagnostic bactériologique Infections aiguës à espèces classiques Bactéries " normales " • facile • ED + • réaction cellulaire ++ • culture rapide Infections chroniques Bactéries "stressées" • ED – • Peu de PNN • culture lente >> 48 heures • populations d'aspects différents • perturbation de l'activité des ATB • antibiogrammes différents S. aureus J10 J2 Staphylocoques à coagulase négative Interprétatation des cultures J2 J10 Interprétation des cultures J2 J10 ou culture uniquement en bouillon liquide (sachant qu’un seul cocci ou un seul bacille suffit à positiver) Interprétation des cultures Polymorphisme Polymicrobisme Contamination ???? Aide : caractères biochimiques (galerie), génétique éventt Interprétation des cultures Infection polymicrobienne (>15% des cas) • Rare (1 colonie) Staphylococcus aureus culture positive en 24h • Quelques colonies de Staphylocoque à coagulase négative à J4 • Nombreuses petites colonies de P. acnes à J10 Interprétation des cultures Variation phénotypique de la morphologie et de la résistance d ’un même S. aureus Souches Témoin Péni R Genta S Genta R Peflo S Peflo R Peflo I Rif S Rif I Rif R Fosfo S Fosfo I Fosfo S 1 morphologie 2 morphologies 2 morphologies Electrophorèse Champs pulsés Interprétation des cultures Variants microcolonies ou SCV "Small Colony Variants" Faciles à méconnaître : • • • • • • • décrits pour beaucoup d’espèces bactériennes (os, mucoviscidose) croissance lente et culture retardée colonies de petite taille perte pigmentation, perte d’hémolyse auxotrophisme (Hémine, Thymidine, ménadione...) métabolisme de l ’ATP profondément perturbé forme de résistance des bactéries ? Variants microcolonies ou SCV Même souche (génétiquement) En bas : normale En haut SCV SCV Particularités des micro-colonies in vitro: . adhérence +++ . tps de génération (doublement) x 10 . perte de l ’activité bactéricide de certains ATB . persistance des bactéries dans des niches cellulaires protectrices (Cellules endothéliales des vaisseaux, ostéoblastes, …)…. . peu de réaction inflammatoire locale . à l’origine d’échec thérapeutique Infection polymicrobienne Infection chronique depuis 8 ans, PTH 4 changée fois Cotyle et synoviale gauche (4 prélèvements): • S. aureus : Péni R, S à tout • S. epidermidis multi R Fémur gauche (4 prélèvements) • S. aureus : Péni R, S à tout • S. epidermidis : 3 antibiogrammes différents (oxa S/R, Genta S/R, Ery S/R, Fosfo S/R, Pef S/R, Rif S/R) • S. warneri : 2 antibiogrammes différents Culture et identification • Isoler tous les aspects avec au moins: – identification et antibiogramme sur les colonies différentes – sur au moins deux prélèvements différents (si possible) Staphylocoques : . recherche systématique du gène mecA (meti-R) ? (recommandations CA-SFM) . CMI Vanco et Teico systématique ? • Rendu des résultats avec – pour chaque prélevement + : • Nombre de milieux + et lesquels • nombre de colonies / milieu • Antibiogramme(s) – synthèse type "Anapath" Que faire des prélèvements restés stériles ? 10 à 50 % des IOA selon les séries et les contextes épidémio-cliniques • patient sous antibiotique (arrêt minimum 15 j) • prélèvement mal fait • transport trop long • culture inadéquate • bactérie trop fragile • espèce particulière et/ou méconnue ou non cultivable • mycobactérie Comment améliorer le diagnostic ? Un exemple : ostéo-arthrite de l’enfant et Kingella kingae 190 prélèvements 89 des 104 prélèvements culture négative Culture <4 ans Positif : 86 S. aureus 38 K. kingae 25 S. Pyogenes 4 S. Agalactiae 3 S. Pneumoniae 6 H. influenzae 2 Others >4 ans Negatif : 104 1+ Gélose sang 12+ Flacon Hémoc ana 24+ Flacon Hémoc aéro PCR spécifique PCR Universel K. kingae 16SrDNA 29 K. Kingae 8 Bilan Kingella kingae Culture gélose Culture gélose + flacon hémoculture Culture gélose + flacon hémoculture + PCR 60 - 29 + 1/190 25/190 54/190 8 + N. meningitidis W13 (1) S. pyogenes (1) S. constellatus (1) S. aureus (1) Streptococcus spp. (1) Enterobacteria (2) Pseudomonas spp. (1) 52 - Nouveaux outils travail encore possible pour l’optimisation de conditions de culture (flacon d’hémoculture) et délais de mise en culture biologie moléculaire ¾ rapidité, sensibilité potentielle à optimiser + ¾ pas de miracle mais prometteur ¾ encore en phase d’évaluation ¾ nécessité de coordonner des études prospectives d’évaluation . de la PCR universelle . des PCR spécifiques . des schémas diagnostiques optimisés stratifiés par groupe patients pour l’instant : à réserver quand culture – et suspicion ++ Conclusion • Points clés – gestion des prélèvements – conditions de cultures – travail délicat et difficultés rencontrées – résultats échellonnés parfois longs à obtenir • Nouveaux outils – amélioration des cultures – outils moléculaires Remerciements • Anne-Marie FREYDIERE (CBE, HCL) • • • • Sylvestre TIGAUD Laboratoire bactériologie Chantal ROURE-SOBAS CBN, HCL Hélène SALORD Olivia RAULIN et … l’ensemble des techniciennes du laboratoire de la Croix Rousse • Bactériologistes du CBE et CBL des HCL
