Diagnostic de Ralstonia solanacearum et Clavibacter
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Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire LFSAGx MET-LFSAGX-081 MET-LFSAGX-082 I-MET Diagnostic de Ralstonia solanacearum et Clavibacter michiganensis sepedonicus sur tubercule de pomme de terre et boutures de Pélargonium Version Date d’application 04 2013-08-20 Rédaction par : Sandrine Léonard, Responsable section Phytopathologie ; 2013-07-18 Révision par : Alain Dubois, Responsable Qualité LFSAGx ; 2013-08-19 Autorisation de publication par : Franck Defeijt, Manager laboratoire LFSAGx ; 2013-08-19 Gestion et localisation de la version valide : M:\LFSAGx-QSE\A 3-Instructions\A30-Qualité Destinataires : Mots clefs : COLLABORATEURS SECTION PHYTOPATHOLOGIE LFSAGX Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensis sepedonicus, diagnostic. LAB 21 I-MET-PHY-081-082-v04 - 1/10 DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET BOUTURES DE PÉLARGONIUM Aperçu des modifications* Révision par/date SL-09/12/09 SL-16/08/11 SL-24/05/13 SL-17/07/13 * Motif de la révision Partie du texte/portée de la révision Document original : «Diagnostic de Ralstonia solanacearum et Clavibacter michiganensis sepedonicus sur tubercule de pomme de terre». Audit interne 24/06/11 et mise à jour en lien avec les Mise à jour des pratiques actuelles. schémas d’analyse des annexes 1 et 2 et adaptation conséquente du texte du point 5. Suppression de la ligne faisant référence à une annexe 3 non présente. Ajout de précisions sur la gestion du matériel contaminé. Ajout du contact avec le laboratoire national de référence. Ajout de la matrice boutures pour R. solanacearum Titre, Objectif, Documents légaux, Principe, Caractéristiques de performance, Consignes de sécurité, Références à d’autres documents, Schéma annexe 2. Audit interne du 20/06/13 : correction des schémas d’analyses Clavibacter et Ralstonia. Annexes 1 et 2 : surpression de la réitération de la PCR en cas de résultat positif. L’écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans. Les modifications par rapport à la version précédente sont reprises en rouge. LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 2/10 DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET BOUTURES DE PÉLARGONIUM TABLE DES MATIERES 1 OBJECTIF .......................................................................................................................... 4 2 CHAMP D’APPLICATION ................................................................................................. 4 3 DOCUMENTS LÉGAUX ET NORMATIFS ........................................................................ 4 4 DÉFINITIONS ET ABRÉVIATIONS ................................................................................... 5 5 PRINCIPE........................................................................................................................... 6 6 CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE ................................................................... 6 7 CONSIGNES DE SÉCURITÉ ET MESURES SPÉCIFIQUES ........................................... 6 8 RÉACTIFS.......................................................................................................................... 7 9 APPAREILLAGE ............................................................................................................... 7 10 MÉTHODE .................................................................................................................... 7 11 CONTRÔLES DE LA QUALITÉ .................................................................................. 7 12 CALCUL ET RAPPORTAGE ....................................................................................... 8 13 RÉFÉRENCE À DES PROCÉDURES AFFÉRENTES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES OU LISTES ........................................................................... 8 LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 3/10 DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET BOUTURES DE PÉLARGONIUM 1 Objectif Cette méthode a pour objectif la détection des bactéries phytopathogènes de quarantaine Ralstonia solanacearum et Clavibacter michiganensis sepedonicus sur tubercule de pomme de terre infecté et bouture de Pélargonium (cette dernière uniquement pour R. solanacearum) de manière latente ou symptomatique. 2 Champ d’application Cette méthode est applicable aux tubercules de pomme de terre et aux boutures de Pélargonium. 3 Documents légaux et normatifs Norme/Fil conducteur Clauses Pour R. solanacearum : Bulletin OEPP 2004 34, 173-178 PM 7/21(1): de diagnostic pour les Protocoles organismes réglementés : Ralstonia solanacearum. Point “Isolation”, page 174. Journal officiel de l’Union européenne L 206/36 : Directive 2006/63/CE de la Commission du 14 juillet 2006 modifiant les annexes II à VII de la directive 98/57/CE du Conseil concernant la lutte contre Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Pour C. m. sepedonicus : Section III, point 1 et 2. Section IV, points A.4.1., A.6., B.4. Appendice 2.b. Appendice 4. Appendice 6.3. Annexes III et VII. Bulletin OEPP 2006 36, 99-109 PM 7/59(1): Diagnostic : Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Journal officiel de l’Union européenne L 182/1-43 : Directive 2006/56/CE de la Commission du 12 juin 2006 modifiant les annexes de la directive 93/85/CEE du Conseil concernant la lutte contre le flétrissement bactérien de la pomme de terre. Point « Screening for latent infection », page 102: les 3 premiers paragraphes. Point “IF Test”, page 103. Point 3.1. Point 6. Point 9.2. Appendices 2., 3., 5.b., 6.1. Annexes II et V. LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 4/10 DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET BOUTURES DE PÉLARGONIUM 4 Définitions et abréviations Terme Ralstonia Origine de la définition LFSAGx Clavibacter LFSAGx Talon de pomme de terre Définition Dans la présente procédure, le terme s’applique à Ralstonia solanacearum : bactérie gram-négative phytopathogène de quarantaine causant notamment la pourriture brune de la pomme de terre. Dans la présente procédure, le terme s’applique à Clavibacter michiganensis sous-espèce sepedonicus : bactérie grampositive phytopathogène de quarantaine causant la pourriture annulaire de la pomme de terre. Zone circulaire d’environ 5-10 millimètres de diamètre présentant un léger relief visible en surface du tubercule, correspondant au canal vasculaire, à l’endroit où le tubercule était relié à la plante pendant la culture. Le talon est prélevé sur le tubercule à une profondeur d’environ 5-10 millimètres, selon un volume conique. Séro-agglutination LFSAGx Milieu de culture semispécifique LFSAGx Milieu de culture non spécifique LFSAGx Pathogénicité sur plantes LFSAGx Test visuel de mise en évidence des bactéries d’intérêt au moyen d’un sérum spécifique : un test positif donne lieu à la formation de complexes antigène-anticorps s’agglutinant entre eux et détectables à l’œil nu. Milieu nutritif gélosé contenant des substances inhibitrices de la croissance de certains (mais pas tous) micro-organismes susceptibles d’être extraits de l’échantillon étudié conjointement à la bactérie d’intérêt. Milieu nutritif gélosé ne contenant pas de substances inhibitrices de la croissance des micro-organismes. Tests consistant à inoculer une bactérie d’intérêt à une plante hôte afin d’observer le développement de la maladie causée par cette bactérie. LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 5/10 DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET BOUTURES DE PÉLARGONIUM Abréviation Origine PCR IF LFSAGx LNR AFSCA Signification « Polymerase Chain Reaction » pour Réaction en chaîne de la polymérase, consistant en la multiplication d’une séquence d’ADN ciblée de manière à la rendre détectable. La réaction se fait au moyen d’une enzyme Taq polymérase, d’amorces, de nucléotides, d’un tampon et d’un thermocycleur. Immunofluorescence. Test consistant à mettre en évidence les bactéries de manière visuelle, via microscopie à fluorescence, au moyen d’un marquage avec des anticorps couplés à un fluorochrome. Laboratoire National de Référence pour les maladies des plantes, section bactériologie, ILVO-PLANT, situé à Merelbeke en Belgique. 5 Principe La méthode s’appuie sur les étapes suivantes : - Prélèvement du talon des tubercules ou d’un segment à la base des tiges de boutures. - Extraction et concentration des bactéries. - Screenings via PCR (pour R. solanacearum et C. m. sepedonicus) et isolement sur milieu de culture (pour R. solanacearum uniquement). - Si suspicion au(x) screening(s) Selon les cas (bactérie(s) et screening(s) concerné(s) ; voir schémas en annexe) plusieurs actions possibles et non incompatibles : réitération de test de screening, tests supplémentaires comme screening immunofluorescence (pour C. m. sepedonicus) et PCR sur colonies (pour R. solanacearum), confirmation de contamination au LNR. 6 Caractéristiques de performance 3 La méthode permet de détecter un minimum de 5 10 CFU/ml récupérées par extraction à partir d’un échantillon de 200 tubercules de pommes de terre ou d’un échantillon de 25 à 100 boutures de Pélargonium. Pour les détails, voir le dossier de validation. 7 Consignes de sécurité et mesures spécifiques Les manipulations impliquant les bactéries actives sont réalisées dans des locaux de niveau de biosécurité L2Q dont l’accès est contrôlé, et le personnel est équipé de blouses de travail et de lunettes de sécurité, et dispose en outre de produits désinfectants. La manipulation des bactéries après extraction à partir des tubercules ou des boutures se fait sous hottes à flux laminaires. Tout LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 6/10 DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET BOUTURES DE PÉLARGONIUM matériel consommable ayant été en contact direct avec les bactéries ou l’ADN bactérien est jeté dans un container jaune pour enlèvement et incinération par une firme agréée ou décontaminé par autoclavage (eau de rinçage des tubercules uniquement). Tout matériel non-consommable ayant été contaminé par des bactéries ou de l’ADN est décontaminé au moyen d’un désinfectant adéquat ou exposé aux UV’s. 8 Réactifs Consulter les Instructions listées au point 13. 9 Appareillage Etuves, hottes à flux laminaires, réfrigérateurs, congélateur, spectrophotomètre, bain thermostatique, thermocycleur, microscope à fluorescence et autre matériel courant de laboratoire. 10 Méthode Voir les schémas en Annexe 1 et 2. Pour la confirmation de la présence de Ralstonia ou Clavibacter au LNR, procéder comme suit : 1) Prendre contact avec le LNR pour les informer du problème et planifier l’envoi du matériel à expertiser. 2) Préparer l’envoi selon l’instruction « Echange de matériel biologique entre le LFSAGx et les laboratoires externes ». ATTENTION : il s’agit de matériel de quarantaine dont le transport est soumis à législation ! 3) Dès réception du matériel, le LNR réalise l’expertise qui consiste principalement en un biotest sur plante (aubergine et/ou tomate). D’autres analyses sont réalisées conjointement comme par exemple de la PCR avec différentes amorces spécifiques, de l’isolement en culture, de l’IF. Cette expertise peut prendre jusqu’à 40 jours. 4) Dès connaissance des résultats, le LNR les communique au LFSAGx. Si le résultat est non conforme, une notification est faite par le LFSAGx selon la procédure en vigueur à la DG Laboratoires. 11 Contrôles de la qualité Consulter les Instructions listées au point 13. LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 7/10 DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET BOUTURES DE PÉLARGONIUM 12 Calcul et rapportage Calcul : pas d’application. Rapportage : - Résultats intermédiaires : bactérie suspectée ou bactérie non détectée. - Résultats finaux : bactérie présente ou bactérie absente. 13 Référence à des procédures afférentes, instructions, documents, formulaires ou listes - - Instruction LAB_21_I-MET-PHY-081-082-Extr : “Extraction et concentration de Clavibacter michiganensis sepedonicus et Ralstonia solanacearum à partir de tubercules de pomme de terre”. Instruction LAB_21_I-MET-PHY-081-082-PCR : « PCR en tant que screening pour le diagnostic de Clavibacter michiganensis sepedonicus et Ralstonia solanacearum ». Instruction LAB_21_I-MET-PHY-081-082-IF : « Immunofluorescence en tant que screening pour le diagnostic de Clavibacter michiganensis sepedonicus». Instruction LAB_21_I-MET-PHY-081-082-Isol : « Isolement de Ralstonia solanacearum par culture in vitro et identification par PCR sur colonies ». Fiche de suivi de l’analyse des échantillons de pomme de terre LAB_21_F-PHY-081-082-01 – SuiviRalsto-Clavi. Instruction « Echange de matériel biologique entre le LFSAGx et les laboratoires externes ». Fiche de suivi de l’analyse des échantillons de Pélargonium LAB_21_F-PHY-081-082-03 – SuiviRalsto-Boutures. Annexes Annexe 1 : schéma du mode opératoire pour Clavibacter michiganensis sepedonicus. Annexe 2 : schéma du mode opératoire pour Ralstonia solanacearum. LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 8/10 DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET BOUTURES DE PÉLARGONIUM Annexe 1 : Schéma d’analyse pour le diagnostic de Clavibacter michiganensis sepedonicus. Echantillon: 200 tubercules de pomme de terre Lavage (optionnel) Symptômes/ pourriture ? Examen visuel OUI >200 ? OUI NON ≠ 200 ? NON Prévoir remarque pour DG contrôle OUI Créer un bis avec les tubercules atteints Dénombrement NON Prélèvement des talons Suivre les instructions de la DG contrôle si présentes sinon sélectionner 200 au hasard Symptômes/ pourriture ? OUI Créer un bis avec les tubercules atteints NON Extraction et concentration des bactéries Extraction d’ADN et Screening PCR Echantillon CONFORME NON PCR positive ? OUI Refaire PCR NON PCR positive ? OUI Faire screening IF NON IF positif ? NON OUI Présence de la bactérie confirmée ? Confirmation au LNR (envoi macérat + lame IF) OUI Echantillon NON CONFORME LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 9/10 DIAGNOSTIC DE R. SOLANACEARUM ET C. MICHIGANENSIS SEPEDONICUS SUR TUBERCULE DE POMME DE TERRE ET BOUTURES DE PÉLARGONIUM Annexe 2 : Schéma d’analyse pour le diagnostic de Ralstonia solanacearum. Echantillon: 200 tubercules de pomme de terre ou 25 à 100 boutures de Pélargonium Lavage (optionnel) >nombre prévu ? OUI OUI NON Prévoir remarque pour DG contrôle ≠ nombre prévu ? OUI Symptômes/ pourriture ? Examen visuel NON Dénombrement Créer un bis avec les tubercules/ boutures atteint(e)s NON Prélèvement des talons/ segments de tige Suivre les instructions de la DG contrôle si présentes sinon sélectionner 200 tubercules ou 100 boutures au hasard Symptômes/ pourriture ? OUI Créer un bis avec les tubercules/ boutures atteint(e)s NON Extraction et concentration des bactéries Screening Etalement sur SMSA Extraction d’ADN et Screening PCR Observation de la morphologie des colonies PCR positive ? Séro-agglutination (guide) OUI OUI NON Colonies typiques ? NON Echantillon non suspect au screening Etalement Echantillon non suspect au screening PCR Echantillon CONFORME NON Refaire PCR PCR positive ? NON OUI Ré-étalement sur SMSA Colonies typiques ? OUI OUI Confirmation au LNR (envoi macérat + culture sur YPGA) Repiquage sur YPGA et PCR sur colonies PCR positive ? NON NON Présence de la bactérie confirmée ? OUI Echantillon NON CONFORME Echantillon suspect au screening PCR Echantillon suspect au screening Etalement LAB 21 I-MET-PHY081-082-v04 - 10/10
