Zoomsur les programmes bactéries - Bretagne

Contexte
Ralstonia solanacearum et Clavibacter
michiganensis sepedonicus sont des bac-
téries pathogènes sur pomme de terre,
respectivement responsables de la
pourriture brune et de la pourriture
annulaire. Ces deux bactéries sont clas-
sées dans la liste des parasites de qua-
rantaine. Comme la tolérance vis-à-vis
de ces organismes est nulle, il est
nécessaire d’éviter leur introduction,
notamment via les échanges internatio-
naux, et leur dissémination sur le terri-
toire. En l’absence de méthodes
directes de lutte, la prévention repo-
se essentiellement sur des métho-
des prophylactiques dont notam-
ment la détection précoce de la
bactérie dans les différents milieux
susceptibles de l’héberger (plantes,
tubercules, eau, sol…).
Ces dernières années ont montré la
persistance d’un risque important en
Europe et justifient de maintenir un
effort conséquent de dépistage pour
protéger les exploitations.
Contenu
Un programme de recherche sur ces
maladies a démarré en 1995 suite aux
différents cas de pourriture brune
découverts en Europe et est conduit
par Anne-Claire Le Roux-Nio, ingénieur
d’études à la FNPPPT.La détection pré-
coce de la bactérie dans les différents
milieux nécessite la possession de réac-
tifs sensibles, spécifiques et facilement
utilisables en routine. L’Immunofluo-
rescence étant la méthode officielle
reconnue pour la détection des bacté-
ries de quarantaine sur les lots de pom-
me de terre, le premier objectif de ce
travail a consisté à produire des réactifs
sérologiques performants pour les ana-
lyses. En effet, les réactifs commerciaux
disponibles à l’époque étaient relative-
ment peu spécifiques, conduisant à de
nombreuses réactions croisées néces-
sitant des confirmations par une 2e
technique, comme l’indexage sur
aubergine ou tomate, ce qui demandait
près d’un mois de délai et entraînait
une immobilisation prolongée des lots.
Dans un deuxième temps, les tech-
niques moléculaires telles que la
PCR étant de plus en plus utilisées en
phytopathologie, nous avons décidé de
développer ce type d’outil pour la
détection des deux bactéries de qua-
rantaine.Tout un travail de méthodolo-
gie a été réalisé afind’arriver à un test
PCR spécifique et sensible qui a ensui-
te été transféré dans les laboratoires
des EPR. La mise en place de cette
technique PCR a permis de raccourcir
considérablement les délais des tests
de confirmation (2-3 jours) et d’amé-
liorer leurs spécificité et sensibilité.
Recherche
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Symptômes de flétrissement
et de pourriture annulaire
causés par Clavibacter
michiganensis sepedonicus.
Zoomsur les programmes bactéries
Détection des bactéries de quarantaine:
des outils de plus en plus performants
NOUS POURSUIVONS DANS CE NUMÉRO
LA PRÉSENTATION DES ACTIONS
DE RECHERCHE RÉALISÉES
PAR LA FNPPPT ET LES 3 EPR.
Symptômes de flétrissement
et de pourriture brune
causés par Ralstonia solanacearum.

Les principaux résultats obtenus sur le
développement et l’optimisation des
outils de détection (moléculaires et
sérologiques) sont présentés dans le
tableau ci-dessous:
L’ensemble de ces programmes est
conduit en étroite collaboration avec le
Service de la Protection des Végétaux
et l’INRA de Rennes et Toulouse, dans
le cadre d’un réseau d’échanges et de
partenariat notamment pour toutes les
études portant sur les systèmes aqua-
tiques ou les sols.
Tous ces travaux de mise en place,
d’optimisation et de comparaison des
techniques de détection permettent de
disposer en France d’outils perfor-
mants et de pouvoir garantir des résul-
tats fiables à la filière.
Perspectives
Àcôté de leur rôle de protection du
territoire par la détection précoce des
bactéries dans les divers milieux, ces
différents outils sont également utilisés
pour mener des études épidémiolo-
giques. Ces dernières ont débuté
récemment (en 2002) et ont pour but
d’essayer de mieux comprendre les
conditions de manifestation des mala-
dies causées par Ralstonia solanacearum
et Clavibacter michiganensis sepedonicus.
Elles seront présentées lors d’un pro-
chain article.
Une veille technologique est
constamment assurée afin de se tenir
au courant des nouvelles techniques
susceptibles de contribuer à améliorer
la détection de ces bactéries (en terme
de sensibilité, spécificité et rapidité
d’exécution) comme par exemple ceux
permettant une quantification des bac-
téries ou une simplification des lec-
tures.
En conclusion
La France occupe une position privilé-
giée en matière sanitaire et la mise en
place de programmes conséquents de
surveillance et de moyens de détection
fiables sur les plants certifiés y contri-
bue fortement.
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éries
Technique PCR multiplexe qui permet de détecter
simultanément les bactéries Ralstonia (Rs)
et Clavibacter (Cms) en une seule PCR (gain de temps).
Recherche
1: Marqueur de taille
2: Échantillon contaminé par RS
3: Échantillon contaminé par RS et CMS
4: Échantillon contaminé par CMS
5: Échantillon sain
Observation de cellules bactériennes fluorescentes
après application du test d’immunofluorescence
(technique recommandée par l’Union Européenne).
Principaux résultats obtenus sur le développement
et l’optimisation des outils de détection (moléculaire et sérologique)
Optimisation
recherchée
Intérêts pour la filière Exemples de résultats
Sensibilité
-détection précoce de
la contamination (bactérie
àl’état latent) permettant
d’éviter une dissémination
importante du pathogène
-étude de l’intérêt d’une phase d’enrichissement pour
détecter Ralstonia solanacearum
-comparaison et sélection d’amorces
-amélioration de l’extraction de l’ADN
(facteur 100)
Spécificité
-éviter les réactions croisées
(faux positifs)
-obtention et évaluation de sérums performants
(Rs et Cms)
-PCR: définition d’amorces plus spécifiques des souches
présentes en Europe
Rapidité de la
technique
-raccourcissement des délais
des tests de confirmation
-simplification des analyses
-mise en place d’une confirmation rapide par PCR (2
jours au lieu d’un mois pour l’indexage)
-mise au point d’une PCR multiplexe permettant de
détecter en même temps les 2 bactéries
Applications
sur divers
milieux
-meilleure connaissance
des sources d’inoculum
potentielles
-mise en place d’une technique d’extraction
à partir des sols
-optimisation de la détection des bactéries
dans l’eau et les adventices par les techniques d’isole-
ment et PCR.
Anne-Claire Le Roux-Nio,
ingénieur d’études à la FNPPPT,
conduit le programme
de recherche sur les bactéries.