Protein Unfolding - an important process in vivo

Protein Unfolding - an
important process in vivo
Andreas Matouschek
Dépliement In Vivo
• Translocation des protéines
• Digestion des protéines
• Elasticité passive des muscles striés
Translocation des protéines chez les
mitochondries
• À travers les complexes TOM et TIM (diamètre <
26 Å)
Les protéines passent TIM/TOM repliées?
In vitro-expériences:
• DHFR liée à son ligand Methotrexat (un complexe
très stable) ⇒ pas d ’importation
• BPTI avec des ponts disulfures pas réduits ⇒ pas
d’importation
⇒les protéines passent les complexes non-repliées
Elles sont repliées avant?
In vivo-expériences:
• DHFR exprimée dans la levure ⇒ importation
• addition d ’un analogue de substrat dans le
cytosol ⇒ pas d ’importation
⇒ Oui, elles peuvent être repliées avant
Le mécanisme du dépliement
La séquence signal/ le N-terminus est
tiré par une machinerie cellulaire
⇒ changement du chemin de
dépliement (en comparaison avec
le dépliement par la température,
etc.)
⇒ la structure est démêlée par son Nterm
Qui tire?
Deux facteurs:
• mtHsp70: démêle les protéines avec
une longue séquence signal; mais elle
est nécessaire pour le dépliement de
toutes les protéines
• potentiel électrique: tire les séquences
signal (chargées ++) de protéines avec
une séquence signal courte vers la
matrice
Comparaison de deux protéines
Barnase avec son ligand
• est dépliée et importée
DHFR avec son ligand
• n’est pas dépliée et pas
importée
Mais:
Elles ont des affinités similaires
Barnase est in vitro plus stable que DHFR
Explication par la structure
Barnase avec son ligand
• N-terminus
est une
hélice-α
superficielle
⇒ collapse de la structure
DHFR avec son ligand
• N-terminus est
un brin-β dans
un feuillet-β,
en plus intégré
par deux
hélices-α
⇒ la séquence signal est
quand la machinerie
enfouie, la machinerie cellulaire
cellulaire tire la préséquence n’arrive pas à tirer la séquence
signal
⇒ le dépliement est dépendant de la structure locale au N-term
Translocation dans d’autres compartiments
• Dans les mitochondries, les chloroplastes et le RE on
trouve des homologues de la chaperone Hsp70 ⇒
probablement le dépliement joue un rôle similaire
• RE: normalement les protéines ne sont pas repliées
avant la translocation
• chloroplastes: il y a deux voies de translocation:
– ΔpH: des protéines repliées peuvent passer
– sec-pathway: seulement des protéines dépliées
peuvent passer
Digestion des protéines
• Par le Protéasome ou des protéases similaires (Lon,
ClpXP, ClpAP, HslUV):
– marquage d ’une
protéine
– dégradation
Le mécanisme du dépliement
• Mêmes in-vitro-exp. Avec Barnase et DHFR
comme chez les mitochondries ⇒ mêmes résultats
• Dégradation des permutants
circulaires de DHFR
⇒dépliement plus facile, si le
signal est lié à une hélice-α
ou une boucle à la surface
⇒dépliement moins facile, si le signal est lié à un
brin-β
Importance de la structure locale près du signal
⇒les protéases démêlent les protéines à leur signal
D’autres experiences pour la vérification
• Dégradation des protéines chez
ClpAP:
Expériences avec FRET
⇒la protéine entre dans la cavité
d ’abord avec la partie avec le signal
Spécificité
• Certains domaines peuvent être dégradé séparés
• Dégradation partiellement ⇒ activation des
protéines p. ex. des facteurs de transcription
• il y a des maladies à cause d’accumulation des
aggrégats protéiques, qui ne contiennent que des
feuillets-β, éventuel encore avec Ubiquitin ⇒ les
cellules n ’arrivent pas à dégrader les protéines
Elasticité passive des muscles striés
• Longueur: >1µm
• 300 domaines:
– 90% Ig ou fibronectin-fold
– 10% séquences uniques,
p.ex. PEVK:
1000 aa, n’a pas une
structure globulaire unique
⇒ Titin a une structure étendue
Qu’est-ce qu’il se passe quand on tire le Titin?
• Peu force de traction ⇒ conformation disordonnée de la molécule
étendue résist à cause des effets entropiques
• Plus de force de traction ⇒ PVEK déform, résistance à cause des
effets entropiques
• Encore plus de force de traction ⇒ des domaines Ig et fibronectin se
déplient reversiblement
Résumé
• Dans les cellules les protéines sont dépliées par des
machines cellulaires (Hsp70, ΔpH,...) qui trouvent
autres voies de dépliement
• les états dépliés sont capturés dans les canals
• il y a des structures avec des feuillets-β, où les
machines cellulaires ne peuvent pas tirer la séquence
signal de la protéine
⇒ p.ex. certaines maladies