in vitro - Development

J. Embryo/, exp. Morph., Vol. 14, Part 2, pp. 119-128, October 1965
Printed in Great Britain
Differentiation des epitheliums du tube digestif
in vitro
par LUIS SORIANO1
Institut d'Embryologie et Teratologie experimentales du College de France
et du
C.N.R.S. (Directeur: Professeur Etienne Wolff)
AVEC TROIS PLANCHES
Nous avons demontre que l'epithelium de l'oesophage de l'embryon de Souris,
preleve
a 12 jours de gestation et cultive in vitro, montre une differentiation
acceleree par rapport
a celle observee dans le developpement normal (Soriano
et coll., 1964). Ces resultats ont ete obtenus en utilisant une modification de la
methode de Trowell (1954).
Nous nous sommes d'abord demandes si cette acceleration de la differenciation
etait due
a l'utilisation d'une methode particuliere de culture, ou si elle etait
independante de
la methode utilisee. Nous avons alors refait ces experiences
avec une autre methode (Wolff et Haffen, 1952) pour voir si on obtiendrait les
memes resultats.
D'autre part, nous avons fait des experiences de dissociation et reassociation
des ebauches embryonnaires a l'aide de la trypsine et de la hyaluronidase. Dans
une premiere partie, nous avons utilise les ebauches cesophagiques d'embryon
de Souris prelevees
a 12 et 19 jours de gestation et celles de la trachee explantees
a
19 jours de gestation. Dans la deuxieme partie du travail, nous avons preleve
les ebauches
du tube digestif d'embryon de Souris a differents stades du
developpement embryonnaire: a 16,15,14 et 13 jours de gestation. Nous avons
choisi les ebauches d'oesophage, celles de l'estomac anterieur et posterieur et de
l'intestin parce que les epitheliums de ces organes sont de types differents. Ainsi
l'epithelium d'oesophage montre les premiers signes
de keratinisation apres
4 a
5 jours de culture, comme le fait d'ailleurs l'epithelium de l'estomac anterieur
(Wolfsberg, 1964). Par contre, l'epithelium de l'estomac posterieur et celui de
l'intestin montrent une structure cylindrique avec fonction secretoire, quand ils
sont cultives dans les memes conditions et pendant la meme periode. Done avec
ces deux groupes differents d'organes on peut realiser des associations hetero-
logues, qui pourront nous permettre
de savoir si la destinee originale d'un
epithelium a ete modifiee par le contact avec un mesenchyme etranger.
1
Adresse de Vauteur: Institut d'Embryologie et Teratologie experimentales du College de
France et du C.N.R.S., 49 bis Avenue de la Belle Gabrielle, Nogent-sur-Marne (Seine),
France.

120 L. SORIANO
MATERIEL ET METHODES
La dissociation des ebauches embryonnaires a ete faite a l'aide de la trypsine
(Trypsine Difco) a
2 % dans le Tyrode sans Ca ni Mg (Moscona, 1952) en ajoutant
encore 0,4 g de hyaluronidase (Zwilling, 1955). Les ebauches sont immergees
pendant 10 a 15 min. dans cette solution a 37° C. La dissociation est ensuite
poursuivie mecaniquement avec des pinces fines. Pour inactiver la trypsine, les
explants sont ensuite deposes dans un melange 1/1 de Tyrode et de serum de
Cheval.
Les ebauches sont cultivees pendant 5 a
12 jours selon la methode de culture
d'organes mise au point par Wolff et Haffen (1952). Le milieu est compose de:
Gelose a 1,5
% dans le liquide de Gey 7 parties
Extrait embryonnaire 3 parties
Serum de Cheval 2 parties
Les explants sont enveloppes dans la membrane vitelline de l'ceuf de Poule non
incube, selon une technique mise au point par Wolff (1960).
RESULTATS DE LA PREMIERE PARTIE
Developpement in vitro de
Ve'bauche cesophagique
Apres 5 jours de culture les ebauches cesophagiques d'embryon de Souris de
12 jours de gestation, presentent un epithelium epaissi, c'est-a-dire forme de 3
ou 4 couches de cellules (Planche 1, Fig. A). Cet epaississement correspond au
debut de la keratinisation.
Experiences de dissociation et reassociation
La dissociation de l'cesophage preleve a 19 jours de gestation, et la reassociation
des fragments qui ensuite sont cultives pendant 5
jours, determine la keratinisation
de l'epithelium oesophagique (Planches 1, Fig. B et C).
L'association du mesenchyme de trachee de 19 jours de gestation avec l'epi-
thelium d'cesophage du meme age, determine apres 7 a 12 jours de culture la
keratinisation de l'epithelium oesophagique (Planches
1 et 2, Fig. D, E, F et G).
L'association complexe du mesenchyme de trachee, mesenchyme d'oesophage
et epithelium oesophagique de 19 jours de gestation, determine aussi apres
7 jours
de culture, la keratinisation de l'epithelium oesophagique (Planche 2, Fig. H).
Le meme resultat est obtenu lorsque l'epithelium d'cesophage est cultive entre
deux fragments de trachee comme le montre la Figure I (Planche 2).
DISCUSSION DE LA PREMIERE PARTIE
L'acceleration de la differentiation de l'epithelium oesophagique observee
quand il est cultive avec la methode de Wolff et Haffen
(1952), permet de supposer
qu'une telle acceleration ne depend pas de la methode de culture utilisee; en

/. Embryol. cxp. Morph. Vol. 14, Part 2
PLANCHE 1
FIG. A. CEsophage embryonnaire de Souris de 12 jours de gestation cultive pendant 5 jours.
Debut de la keratinisation. M: mesenchyme. E: epithelium pluristratifie. x 294.
FIG. B. CEsophage d'embryon de Souris de 19 jours de gestation au moment de l'explantation.
E: epithelium. M: mesenchyme. x371.
FIG. C. Reassociation de l'epithelium et du mesenchyme d'oesophage preleve a 19 jours de
gestation et cultives pendant 5 jours. Debut de la keratinisation. E: epithelium. M:
mesenchyme. x 126.
FIG. D. Trachee d'embryon de Souris de 19 jours de gestation au moment de l'explantation.
E: epithelium cylindrique et secretoire. M: mesenchyme sous-epithelial. C: cartilage.
Me: mesenchyme externe. x 294.
FIG. E. Trachee d'embryon de Souris de 19 jours de gestation, apres action de la trypsine.
On constate l'absence de l'epithelium. M: mesenchyme sous-epithelial. C: cartilage.
x294.
LUIS SORIANO{Facing page 120)

TABLEAU
1
Age des
explants
(en jours
de
gestation)
16eme 15eme 14eme
13eme
As.
He'te'r.
Mes.:
Est.post.
Epith.:
Oesophage
Kerat. Negat.
10 15
As.
Heter.
Mes.:
Intestin.
Epith.:
Est. ant.
As.
Heter.
Mes.:
Intestin.
Epith.:
Oesophage
As.
Heter.
Mes.:
Est. ant.
Epith.:
Intestin
Epith.
Epith.
Pluris.
+
cylind.
pluris.
cylind.
Epith.
Epith. Epith.
cylind.
Negat. Kerat. Negat.
cylind. cylind.
Negat.
—
— 5 2 1 — —
3
10
4
As.
Heter.: Association Heterologue
Mes.:
Mesenchyme
Epith.: Epithelium
Kerat.: Keratinisation Epith. cylind.: Epithelium cylindrique
Total
des
explants
etudies
36
20
27 20
103
Negat.: Negatifs (aucune differenciation de l'epithelium)
Epith. pluris.: Epithelium pluristratifie
Pluris.
+ cylind.: Epitheliums pluristratifie et cylindrique
Est. ant.: Estomac anterieur
Est. post.: Estomac posterieur
I
OS. s:

122L. SORIANO
effet, il pourrait y avoir des facteurs inhibiteurs de la differenciation de l'epithelium
oesophagique pendant le developpement normal 'in vivo'. Nous avons deja
envisage cette possibility (Soriano et
coll., 1964) et nous pensons maintenant
que cette interpretation est un peu plus valable. D'ailleurs Planel et
coll. (1964)
ont trouve une acceleration semblable dans le cas particulier du vagin de Rat qui
acquiert in vitro en quelques jours seulement une structure de type adulte.
Les resultats presents ont demontre que l'association de l'epithelium oesopha-
gique d'embryon de Souris de
19 jours de gestation, soit avec le mesenchyme de
trachee soit avec un fragment de la trachee, determine toujours la keratinisation
d'un tel epithelium, apres une periode variable de culture de 7 a
11 jours. Done
nous pouvons tirer comme premiere conclusion que l'epithelium d'oesophage est
TABLEAU 2
Age des
Explants
{en jours
de
gestation)
16eme
15eme
14eme
13eme
Temoin
Estomac
Anterieur
Temoin
Estomac
Posterieur
Kerat.
10
6
Epith.
cylind.
2
2
Epith.
pluris.
Epith.
cylind.
Negat.
Temoin
Intestin
Epith.
c. et sec. Negat.
10 2
Kerat.: keratinisation
Epith. cylind.: epithelium cylindrique
Epith. pluris.: epithelium pluristratifie
Negat.: negatifs (aucune differenciation de l'epithelium)
Epith. c. et sec.: epithelium cylindrique et secretaire
Les chiffres correspondent au nombre d'explants etudies
deja determine quand il est preleve a ce stade-la et qu'il est associe dans differentes
conditions experimentales. Par consequent, la destinee de cet epithelium ne peut
pas Stre modifiee par
1'influence d'un mesenchyme etranger.
On doit se detnander si on peut preciser
l'age de la determination embryon-
naire de cet epithelium et d'autres epitheliums voisins par la methode de dissocia-
tion et reassociation des ebauches embryonnaires. En effet, differents auteurs
ont demontre largement que le mesenchyme embryonnaire exerce une influence
inductrice sur l'epithelium avec lequel il est en contact en culture organotypique;
e'est-a-dire le type de differenciation d'un epithelium peut etre change s'il est
associe a un mesenchyme heterologue, a condition que les ebauches soient
indeterminees quand elles sont prelevees (Sengel, 1958; McLoughlin, 1960,1961a
et b; Moscona, 1961; Sengel et Abbott, 1962; Sigot, 1962,1963).
Cette influence inductrice pourrait-elle se produire dans le cas de nos
experiences si nous utilisions des ebauches embryonnaires plus jeunes que celles
employees jusqu'a present
?