Initiation à la Biologie Cellulaire
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Cap d’Agde 2016 Initiation à la Biologie Cellulaire 1 Les modèles expérimentaux pour la biologie Les cellules en culture Les animaux de laboratoire • Cancéreuses 10 µm Cap d’Agde 2016 Cap d’Agde 2016 • Normales Black 6 Nude Vérifier que les nanoparticules ne soient pas toxiques Faire pousser des tumeurs humaines et les traiter Début des expériences in vitro, les meilleurs candidats sont testés in vivo 2 Les voies cellulaires empruntées par les nanoparticules Devenir des nanoparticules dans la cellule (in vitro) Transport dans la cellule Imagerie subcellulaire Ciblage des cellules cancéreuses Devenir des nanoparticules chez la souris nude (in vivo) Cap d’Agde 2016 Trajet et barrières biologiques Biodistribution, biocompatibilité Accumulation dans la tumeur 3 La culture des cellules Incubateur, enceinte humide, 5% CO2, 37°C Cap d’Agde 2016 Cellules cultivées en flasque + milieu 4 La culture des cellules Observation au microscope à transmission Cap d’Agde 2016 Manipulation sous PSM 5 La cellule animale C’est l’unité fonctionnelle du corps, de chaque organe, de chaque tissu ‐ RE: synthèse des protéines et lipides ‐ appareil de Golgi: maturation protéines et lipides venant du RE ‐ mitochondries: fournie l’ATP pour les réactions cellulaires ‐ lysosomes: dégradation des organites HS et des particules endocytées ‐ endosomes: étape avant le lysosome ‐ peroxisomes: compartiment d’enzymes spécialisées dans l’oxydation Golgi Réticulum Endoplasmique Endosome Peroxisome Membrane plasmique Noyau ADN génome Cap d’Agde 2016 Cytoplasme Lysosome Mitochondrie 6 Cap d’Agde 2016 L’expression des gènes ADN transcrit en ARN ARN traduit en protéines 7 Les différents modes de transport membranaires I. Transport membranaire de petites molécules Molécules hydrophobes Petites molécules polaires non chargées Cap d’Agde 2016 Grosses molécules polaires non chargées O2 CO2 N2 hormones H2O urée glycérol Certaines molécules traversent la membrane plasmique (bicouche lipidique) D’autres ont besoin de Glucose saccharose transporteurs: perméases ou canaux protéiques avec dans certains cas besoin d’ATP pour Ions H+, Na+ HCO3‐, K+ Ca2+ , Cl‐ Mg2+ Milieu extracellulaire faire traverser la molécule. Milieu intracellulaire 8 Les différents modes d’internalisation II. Transport de macromolécules: endocytose Nanoparticules Milieu extracellulaire Invagination de la membrane plasmique Noyau Cap d’Agde 2016 ADN génome Vésicule dérivée de la membrane plasmique Endosome précoce Endosome tardif Lysosome 9 L’endocytose Deux grands catégories d'endocytose : la phagocytose et la pinocytose. Cap d’Agde 2016 La phagocytose : réalisée essentiellement par des cellules spécialisées comme les macrophages, les monocytes, les neutrophiles et les cellules dendritiques. La phagocytose fait intervenir des protéines particulières, les opsonines, qui vont s'adsorber sur l'élément étranger et déclencher la phagocytose (intervient essentiellement dans le système de défense de l'organisme et entraîne la destruction de l'élément absorbé). La pinocytose : mécanisme qui existe chez toutes les cellules. Il semble impliquer des zones particulières des membranes cellulaires. C'est la voie normale d'absorption d'éléments indispensables comme le cholestérol transporté par les LDL ou le fer transporté par les transferrines. De nombreux points restent encore inconnus mais plusieurs voies de pinocytose sont décrites et classées en fonction des protéines et des médiateurs impliqués : •pinocytose dépendant de la clathrine •pinocytose indépendant de la clathrine : cette catégorie rassemble plusieurs voies: ‐ endocytose faisant intervenir la caveoline ‐ macropinocytose : endocytose dépendant d'une tyrosine kinase ‐ endocytose clathrine et caveolae indépedant 10 Culture cellulaire et traitement Cellules cultivées dans une atmosphère humide, 37°C, 5% CO2 Ajouter les nanoparticules dans le milieu Internalisation des nanoparticules dans les cellules Microscopie, toxicité intrinsèque, toxicité induite,… Boîte de culture Cap d’Agde 2016 Milieu de culture Cellules Nanoparticules 11 Cap d’Agde 2016 Tests in vitro avec les nanoparticules TEM pour connaître l’internalisation des nanoparticules par les cellules Microscopie à fluorescence sur cellules vivantes pour déterminer leur localisation dans la cellule Mesure de la non toxicité des nanoparticules après 3 jours de traitement et des concentrations croissantes Mesure de la toxicité induite dans le cas de MSN encapsulant des PS ou des drogues 12 Nanoparticules cœur magnétique Cellules fixées et inclues en paraffine Observation en TEM de coupes faites au microtome Observation de nanoparticules internalisées Cap d’Agde 2016 Control Nanoparticules 6 h Cellules Hep‐G2 traitées par 50 µg.mL‐1 de nanoparticules Rascol E et al, RSC adv, 2016 13 Cap d’Agde 2016 Nanoparticules luminescentes endocytées 14 Etude de cytotoxicité sur lignées cellulaires Nanoparticules autonomes pH sensibles pour la délivrance de médicaments Principe Camptothécine ou analogue 5-FU Bouchon Lien acido-labile pH 7.4 Résultats Noyaux Survie cellulaire (%) Cap d’Agde 2016 120 pH 5 Np Merge 100 Np + IP 80 60 40 Np vides 20 Np + CPT Np + RhoB 0 0 20 40 60 80 Concentration (µg.mL-1) Théron C et al, RSC adv, 2015 15 Etude de cytotoxicité sur cultures primaires Nanoparticules autonomes pH sensibles pour la délivrance de médicaments Des prélèvements de cancer du colon ont été récupérés à l’hôpital, les cellules cancéreuses ont été isolées et remises en culture. Ensuite, des colonies se sont formées et ont été traitées par 10 µg/ml de nanoparticules contenant soit un fluorophore rouge (iodure de propidium) soit des médicaments anti‐cancéreux. Une fois dans le lysosome, les bouchons des nanoparticules qui sont sensibles au pH, sautent et libèrent la drogue dans les cellules cancéreuses. Noyaux Lysosomes NP Superposition Anti-cancéreux ou fluorophore Bouchon Disparition de la colonie de cellules cancéreuses 10 µg/mL Cap d’Agde 2016 Lien acido-labile pH 7.4 pH 5 0 2 Jours 4 8 Théron C et al, RSC adv, 2015 16 Toxicité photo‐induite Cas des MSN encapsulant des PS monophotoniques Contrôle Contrôle irradié 650 nm, 14 J cm‐2 48 h MSN non irradiées MSN irradiées Cap d’Agde 2016 Irradiation des cellules MTT colore les cellules vivantes 17 Vectorisation des nanoparticules Cap d’Agde 2016 pour un meilleur ciblage 18 Délivrance contrôlée de médicaments Cancers à foyers polydisperses Besoin de chimiothérapie ciblée : ‐ augmentation de l’efficacité thérapeutique dans la zone tumorale ‐ limitation des effets secondaires Cancer colon: nanoparticules encapsulant une drogue de référence pour cibler des foyers cancéreux par une reconnaissance ligand/récepteur (HA/CD44) Camptothecin 5-FU Cap Cap d’Agde 2016 Stalk Hyaluronic acid CD44 receptor 19 Internalisation de nanoparticules vectorisées • Endocytose par l’intermédiaire de récepteurs membranaires: augmentation de l’incorporation de ligands ex: nanoparticules vectorisées par du mannose pour la PDT des cancers Laser Ciblage sélectif Cellule cancéreuse Internalisation Cytotoxicité Cap d’Agde 2016 • Même principe pour des nano « Drug Delivery » contenant un cytotoxique: ‐ diffusion passive ‐ libération activable par la lumière, l’hyperthermie, pH… 20 Traitement de lignées cellulaires par des MSN MSN 120 Monophotonique MSN-man 100 14 J cm‐2 Living cells (%) * 80 * 60 40 20 * Cap d’Agde 2016 Biphotonique 0 MSN (24 h) - - + + - - + + Irradiation - + - + - + - + Zone contrôle Zone irradiée 1. Brevet mondial, PCT/Fr2009/001090 CNRS, 2008 2. Brevet D, et al. Chem Commun, 2009 0.24 J cm‐2 3. Brevet européen, N° EP 09 306 238.8, CNRS, 2009 21 Nanoparticules pour l’imagerie noyaux MSN-FITC MSN-man-FITC Cap d’Agde 2016 MSN-man-FITC + excès de mannose lysosomes MSN-FITC superposition % coloc. 29% 77% 35% Marquage des membranes cellulaires Hocine O et al, Int J Pharm, 2010 22 Un exemple de nanoparticules vectorisées pour le traitement Cap d’Agde 2016 du cancer de la prostate 23 Ciblage du cancer de la prostate Identification de cibles moléculaires ex: lectines surexprimées par des cellules cancéreuses Synthèse de ligands avec une forte affinité pour le récepteur identifié 5 Unité liant le M6P Unité liant le M6P M M M M M 10 M 1 Unité liant l'IGF-II N Développement de nanoparticules pour le traitement et l’imagerie leurs propriétés seront fonction du cancer à traiter 15 Milieu Extracellulaire Milieu Intracellulaire Greffage des ligands synthétiques sur les nanoparticules Cap d’Agde 2016 Tests biologiques, in vitro sur lignées cancéreuses puis ex vivo sur cultures primaires. 24 Surexpression du RM6P dans les cancers de la prostate • Marquage immunohistochimique du RM6P • 84% des cancers de la prostate surexpriment le RM6P Tissus cancéreux Normal Cancer 16 31 22 100 Tissus hyperplasique 31 % de cellules marquées 0-10 10-30 30-60 60-100 • Spécificité du marquage du tissu cancéreux Cap d’Agde 2016 + RM6P libre Surexpression du RM6P comme diagnostic du cancer de la prostate. Etude réalisée sur 126 cas. Brevet CNRS 2015 25 Synthèse de molécules permettant de cibler le RM6P Analogues du Mannose 6‐phosphate: M6C ‐ Molécules synthétiques avec une meilleure affinité pour le RM6P que le M6P ‐ Les analogues ont une plus grande stabilité plasmatique Couplage des AMFA sur les nanoparticules Cap d’Agde 2016 MSN‐M6C pour la thérapie photodynamique (PDT) Brevet n° EP 09305647, 03/07/2009 et licence NanoMedSyn 26 Efficacité des MSN‐M6C sur le cancer de la prostate Etablissement de la culture primaire à partir des biopsies, traitement Laser Laser Control No laser MSN-M6C Living primary cells (%) par 20 µg/ml de nanoparticules et irradiation à 650 nm, 10 min (6,5 120 J/cm²) 100 70% de mort cellulaire 80 60 40 * 20 0 Control MSN MSN-M6C Lignées cellulaires LNCaP traitées avec 20 µg/ml de MSN‐M6C, irradiées (3x1.57 sec) par un laser multiphotons à 760 nm Living LNCaP cells (%) Cap d’Agde 2016 120 100 60% de mort cellulaire 80 * 60 • ↑ résolution 3D • ↑ pénétration tissulaire * 40 • ↓ photo-dommages 20 0 Control MSN MSN-M6C Vaillant O et al, Angewandte 2015 27 Réaliser des preuves de concept Cap d’Agde 2016 sur des modèles animaux 28 Tester le potentiel anticancéreux des nanoparticules in vivo Faire pousser des tumeurs sous‐cutanées sur souris nude: Cap d’Agde 2016 injection sous la peau des cellules cancéreuses (1 mois) Injection intraveineuse d’une solution contenant les nanoparticules Passage des barrières biologiques (foie, rate,…) Opsonisation (captées par les cellules immunitaires présentes dans la circulation sanguine et dans les organes) Si nanoparticules recouvertes de PEG : les cellules immunitaires ne les voient pas comme un corps étranger elles les assimilent au « soi » et les laissent passer 50 nm < nanoparticules < 350 nm: accumulation zone tumorale 29 Nano‐objets pour la PDT des cancers focalisés Laser Principe: Ciblage sélectif Internalisation Cytotoxicité Cellule de cancer du sein Laser Ciblage multiple: Tissu sain h • EPR • Ligand/ Récepteur Si Y Si • Laser Si Si 1O 2 Cap d’Agde 2016 1O Si 2 Cellule cancéreuse Zone tumorale 30 MSN‐mannose pour la thérapie biphotonique in vivo Fluorescence (unité arbitraire) Internalisation cellulaire des MSN-man HCT-116 120 Tumeur souscutanée HCT-116 MDA-MB-231 100 MCF-7 Fibroblastes 80 Xenogreffes 60 40 20 Injection iv MSN-man, 16 mg/kg excitation 2 photons, 9 mn, 760 nm 0 0 10 20 30 40 MSN-FITC-man (µg/mL) Traitement Cap d’Agde 2016 Sérum physiologique MSN-man MSN-man + Laser Nombre de Poids tumeurs souris/groupe (grammes) Souris avec métastases hépatiques Souris avec métastases coliques 3 1,39 ± 0,49 3 2 4 1,33 ± 0,72 2 2 4 0,40 ± 0,28 0 0 Première évidence de PDT 2 photons in vivo utilisant des nanoparticules Gary-Bobo M et al, Angewandte 2011 31 Nanoparticules de polymères de coordination Eu/Gd Propriétés de photoluminescence (Europium) Nuclei Np Lysosomes Chelebaeva E et al, Nanoscale 2011 Merge Europium: lexc: 340‐370 nm lem: 610 nm Capan-1 Hoechst 33258: lexc: 352 nm lem: 461 nm HCT116 HUVEC Lysotracker red: lexc: 577 nm lem: 590 nm Cap d’Agde 2016 Fibroblasts Propriétés magnétiques pour l’IRM (Gd) ‐ agent de contraste ‐ complexe non toxique Gd Perrier M et al, Nanoscale 2015 32 Autre modèle pour les études in vivo: le zebrafish Embryon de zebrafish Injection intramusculaire de 20 nl de PMON‐2PS (50 µg/mL) Injection dans le cytoplasme au stade 1 cellule (1 nl) PMONs Cap d’Agde 2016 Control Embryon de zebrafish GFP 33 Exemple d’étude avec des nanoparticules de silice + or Abstract: Cap d’Agde 2016 A two‐photon photosensitizer with four triethoxysilyl groups is synthesized through the click reaction. This photosensitizer allows the design of bridged silsesquioxane (BS) nanoparticles through a sol–gel process; moreover, gold core BS shells or BS nanoparticles decorated with gold nanospheres are synthesized. An enhancement of the two‐photon properties is noted with gold and the nanoparticles are efficient for two‐photon imaging and two‐photon photodynamic therapy of cancer cells. Croissant J et al, Small 2015 Croissant J et al, Frontiers in molecular biosciences 2016 34
