Corrigé "Biotechnologies environnementales"

U.E.
Biotechnologies et Environnement
(LV376)
Première session de 2013
Sujet d’Annie Martel
Les sujets doivent être composés sur des copies différentes
Des bactéries comme agents de détection (durée 45min)
Plusieurs équipes de recherche se sont intéressées au développement de bio-senseurs basés sur des
cellules entières. Avec des bactéries deux types de bio-senseurs ont été obtenus, que nous
appellerons type 1 et type 2.
Dans le type 1, les gènes de l’opéron luxCDABE ont été fusionnés à un promoteur constitutif, dans le
type 2 ils ont été fusionnés à un promoteur inductible.
Corrigé. Les commentaires en italique ne sont pas demandés dans les réponses. Ils vous sont donnés
à titre informatif.
Question 1 : pour quelles fonctions codent les gènes de cet opéron (on ne demande pas une
identification de la fonction de chaque gène), en quoi sont-ils nécessaires pour la détection ?
Les gènes de cet opéron codent pour les enzymes nécessaires à l’expression de la luminescence.
C'est-à-dire pour la luciférase qui catalyse la libération de lumière et pour les enzymes qui catalysent
la synthèse des substrats de la luciférase.
La bioluminescence est produite par une enzyme: la luciférase bactérienne qui catalyse l’oxydation
de la flavine mononucléotide réduite (FMNH2) et d’un aldéhyde gras à longue chaîne, en présence
d’oxygène, avec émission de lumière bleu-verte (490nm), suivant la réaction ci-dessous :
Luciférase
FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O + lumière
Les gènes luxA et luxB codent les sous unités de la luciférase, qui est une enzyme hétérodimérique.
Les gènes C, D, E codent pour les enzymes responsables de la synthèse de l’aldéhyde gras à longue
chaîne (substrat de la luciférase) à partir d’acide gras. Cette synthèse nécessite trois enzymes
(transférase, synthétase, réductase).
Pour info la synthèse du substrat commence à partir d’un acyl-ACP (R-CO-S-Acyl Carrier Protein) ou
d’un acylCoA. Le groupe acyl est transféré sur une sérine de la transférase, la synthétase active l’acide
gras grâce à l’ATP pour former un anydride mixte : R-CO- AMP. Cette activation permet de transférer
le groupement acyl sur une cystéine de l’enzyme (en présence de la réductase qui s’est associée à la
synthétase), puis la réductase réduit la fonction thioester en fonction aldéhyde.

Si l’opéron est sous la dépendance d’un promoteur constitutif, les bactéries placées dans un milieu
de culture seront fluorescentes. Ce type de construction permet en général d’évaluer les effets
toxiques de produits qui inhibent la croissance des bactéries.
Si l’opéron est placé sous la dépendance d’un promoteur inductible la fluorescence apparaîtra en
réponse à la présence d’un composé inducteur. Ces biosenseurs sont dits spécifiques.
Deux exemples de bio-rapporteurs sont donnés ci-dessous, l’un pour la détection de l’argent, l’autre
pour la détection de composés phénoliques.
A) Bio-rapporteur pour la détection de nanoparticules d’argent.
a. La bactérie utilisée est Pseudomonas putida BS566::luxCDABE. Elle est cultivée dans
un milieu riche. A des suspensions de 108 cellules en phase exponentielle de
croissance on ajoute des concentrations croissantes de nanoparticules d’argent.
Après 240 min d’incubation, la bioluminescence de chaque solution est mesurée.
Question2 : Déterminer les zones de détection du polluant, pensez-vous que le milieu dans
lequel sera prélevé un échantillon sur le terrain aura une influence sur le dosage ?
La zone de détection ou une quantification des nanoparticules d’argent est possible, est
comprise entre <0 et<100 mg/mL. Avec une détection précise entre 10 et ~80 mg/mL. Au dela
de 100mg/mL la présence de nanoparticule d’argent est détectée puisqu’il y a inhibition
complète de la fluorescence, mais des essais avec des dilutions de ces échantillons seront
nécessaires à la quantification. La BSA, qui est une protéine, influence la forme de la courbe
étalon, il est probable qu’avec un milieu naturel qui peut contenir différents éléments dont
notamment des protéines, on observe un effet de matrice. De plus dans un échantillon de sol ou
d’eau, d’autres polluants ayant une toxicité sur les bactéries peuvent être présents et perturber
la réponse.
Que recommandez-vous pour la courbe étalon ?

On observe sur la figure donnée que les dosages réalisés en présence de BSA conduisent à une
amplitude de réponse supérieure et une réponse plus linéaire que ceux réalisés sans agent
stabilisateur des particules d’argent. Nous recommanderons donc de réaliser une courbe étalon
et un dosage en présence de BSA.
Quel est le type de ce bio-rapporteur 1 ou 2 ?
Il correspond à un bio-rapporteur de type 1, la baisse de fluorescence est due à la toxicité de
l’argent (ou des particules d’argent) qui est un agent antimicrobien.
Note : les nanoparticules d’argents sont rencontrées dans des produits de consommation
courante : antiseptiques, additifs pour textiles, cosmétiques, surfaces métalliques…
B) Bio-rapporteur pour la détection de composés phénoliques
La bactérie utilisée est Pseudomonas OS8 qui héberge le plasmide pDNdmpRLux . Cette
bactérie possède la voie métabolique dmp pour la dégradation des composés phénoliques.
Les gènes de cette voie sont régulés par le produit du gène dmpR. L’activité de DmpR dépend
de la fixation de molécules effectrices comme les substrats de la voie catabolique des
phénols. DmpR est un activateur transcriptionnel exprimé de façon constitutive qui régule
positivement le promoteur de l’opéron dmp en présence de composés phénoliques. Sur le
plasmide pDNdmpRLux qui contient le gène dmpR, l’opéron luxCDABE a été placé sous le
contrôle du promoteur de l’opéron dmp.
Information complémentaire donné le jour de l’examen : Les lixivats produits par l’industrie
des schistes bitumineux contiennent environ 200mg/L de phénols.
Des courbes étalons ont été réalisées avec ce bio-senseur pour différents composés
phénoliques et sont présentées dans les graphes ci-dessous

Question3 : Ce bio-senseur vous semble-t-il adapté à la détection de composés
phénoliques ?
D’après les résultats de la figure A, ce bio-rapporteur est adapté à la détection de composés
phénoliques portant ou non un groupe méthyle, puisque des réponses positives seront
obtenues pour des concentrations de l’ordre de 0.1 à 1 mg/L. Il est cependant à noter que la
zone de concentrations qui permet une quantification est assez étroite. Si un résultat positif
est obtenu il faudra faire des tests avec plusieurs dilutions pour obtenir une valeur
compatible avec les valeurs de la courbe étalon.
Dans le cas des composés portant deux fonctions hydroxyles (résorcinol) la limite de
détection se situe entre 1 et > 10mg/l suivant la substitution par un groupe méthyle.
Il est peu probable que des concentrations de cet ordre soient présentes naturellement. Des
réponses positives indiqueront une pollution.
D’après l’information complémentaire sur la pollution due au lixivats des schistes bitumineux
qui contiennent environ 200mg/Lde composés phénolique, on observe que le biosenseur est
adapté à une détection d’une pollution par ces lixivats, les composés phénoliques pouvant
être détectés même après une dilution de 10 à 100 fois.
Note : Une source importante de pollution par des composés phénoliques (phénol, méthyl-
phénol,résorcinol) est l’industrie des schistes bitumineux. Les lixivats des résidus solides provenant de
la production de pétrole à partir de schistes bitumineux contiennent jusqu'à 200 de mg/L de phénols.
Est-ce un bio-senseur de type 1 ou de type 2 ?
C’est un biosenseur de type 2. La réponse spécifique sera induite par la fixation d’un
composé phénolique à la protéine DmpR. Le complexe activera le promoteur des gènes dmp
et par conséquent ceux de l’opéron lux qui ont été placés sous sa dépendance.
Pensez vous que le bio-senseur décrit pour la détection des nanoparticules d’argent puisse
réagir avec les composés phénoliques ?

Il est probable que le biosenseur de type 1 qui mesure une bio-toxicité puisse réagir en
présence de phénols si ces composés sont à des concentrations toxiques pour la bactérie.
Les composés phénoliques sont toxiques pour les bactéries. Les limites de toxicité varient en
fonction des souches bactériennes et des durées d’exposition. Des bio-senseurs de type 1
ont d’ailleurs été développés pour mesurer des toxicités dans des environnements
susceptibles d’être pollués par des composés phénoliques.
Dans l’exemple choisi dans la première partie pour la détection des nanoparticules d’argent
les auteurs avaient choisi une souche de Pseudomonas putida adaptée à la dégradation des
phénols. Cette souche était donc peu sensible pour des concentrations inférieures à 200mg/L
de phénols. Ceci leur permet d’utiliser leur bio-senseur dans des stations de traitement d’eaux
usées pour lesquelles existent des possibilités de pollution par des particules d’argent.
Même chez des souches de pseudomonas adaptées à la dégradation de phénol on peut
observer une toxicité sur les bactéries pour des concentrations > à 200 mg/mL.
Antérieurement à la détection de nanoparticules d’argent la souche de Pseudomonas putida
BS566::luxCDABE avait été utilisée pour la détection de phénol