Étude du transport de l`acide linoléique dans le placenta humain

UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À MONTRÉAL
ÉTUDE DU TRANSPORT DE L"ACIDE LINOLÉIQUE
DANS LE PLACENTA HUMAIN :
INFLUENCES DES PROFILS LIPIDIQUE ET HORMONAL MATERNELS
AINSI QUE DE L'INDICE DE MASSE CORPORELLE MATERNEL
MÉMOIRE
PRÉSENTÉ
COMME EXIGENCE PARTIELLE
DE LA MAÎTRISE EN BIOLOGIE
PAR
ARIANE GRAVEL
MARS 2008
UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À MONTRÉAL
Service des bibliothèques
Avertissement
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le formulaire Autorisation de reproduire et de diffuser un travail de recherche de cycles
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commercialiser ou non ce travail dont [il] possède un exemplaire.»
REMERCIEMENTS
Je remercie Julie Lafond Ph.D. de m'avoir introduit à la recherche dans un domaine
qui me fascine toujours autant. Je la remercie pour sa patience, sa confiance et son
soutien. Je la remercie pour toutes les opportunités qu'elle m'a offertes ainsi que pour
l'enthousiasme de la recherche qu'elle a su me léguer. Je serai forte de mon
expérience en son laboratoire et j'emmènerai ce bagage partout avec moi. Merci
beaucoup Julie d'avoir cru en moi!
Je remercie Marie-Claude Charest qui a su gérer habilement le Projet Lipides.
Je remercie Georges Daoud Ph.D. pour toutes les discussions et les précieux conseils.
Je remercie Docteur André Masse (Chef du service de gynécologie-obstétrique du
CHUM Hôpital St-Luc), Madame Nicole Garceau ainsi que toutes les infirmières du
département de gynécologie et d'obstétrique du CHUM pour leur étroite
collaboration à toutes heures du jour et de la nuit dans la cueillette des trois cents
quelques placentas du Projet lipides...
Je remercie Caroline Bellerose pour la cueillette des échantillons sanguins.
Merci à Mathilde Riols B.Sc. pour toutes ces nuits et ces petits matins où elle a pu me
remplacer pour la cueillette des placentas!
Merci à mon père et ma mère d'être toujours là pour moi et d'être si formidables, à
mes sœurs qui m'inspirent et à ma cousine qui n'est toujours pas très loin ...
Et. .. enfin, merci à mon copain, Marc Amyot B.Sc. (presque M.Sc! !), pour ses
encouragements, sa complicité, son humour, son amour et sa présence de tous les
instants et sans qui la vie serait beaucoup moins douce.
JE DÉDIE CET OUVRAGE Ji MA MÈRE,
CELLE POUR QUI JE ME DÉPASSE ...
TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES FIGURES
vi
LISTE DES ABBRÉVIATIONS
viii
RÉSUMÉ
x
INTRODUCTION
1
CHAPITREI
ÉTAT DES CONNAISSANCES
1.1
1.2
Les changements physiologiques durant la grossesse
Le métabolisme des nutriments durant la grossesse
1.1.2
L'importance de l'lMC et du gain de poids
1.1.3
L'importance du profil en acides gras et de l'insuline 8
7
9
Le placenta humain
Un organe d'échange
11
13
Les acides gras
1.3.1
L'importance des acides gras comme nutriments
transportés
1.4
.4
1.1.1
1.2.1
1.3
.4
15
Le transport des acides gras
1.4.1
14
Les protéine de liaison des acides gras
.19
1.4.1.1
L'albumine
19
1.4.1.2
L'AFP
19
1.4.1.3
La FABPpm
20
v
1.4.2
Les protéines de transports des acides gras
20
1.4.2.1
La famille des FATP
.21
1.4.2.2
La FAT/CD36
22
1.4.3
Les autres protéines de transport des acides gras
23
1.4.3.1
LesCAV
23
1.4.3.2
L'adipophiline
24
1.5
Buts du projet.
25
1.6
Choix du modèle
27
1.6.1
Le modèle de différenciation tfophoblastique
in vi/ro
CHAPITRE
II
ARTICLE SCIENTIFIQUE
CHAPITRE
27
29
III
CONCLUSION
60
CHAPITRE IV
PERSPECTNES ET RÉSULTATS PRÉLIMINAlRES
63
RÉFERENCES
67
LISTE DES FIGURES
Figure
Page
1.1
Organisation des structures d'échange du placenta humain
9
1.2
Représentation schématique du développement du placenta humain
10
1.3
Micrographie électronique d'une villosité placentaire
12
1.4
Organisation des cellules de la zone d'échange
entre la circulation maternelle et fœtale
12
Schéma illustrant le métabolisme des acides gras essentiels:
l'acide linoléique et l'acide a-linoléique
13
Distribution syncytiotrophoblastique des protéines impliquées
dans le transport et la liaison des acides gras
18
1.5
1.6
1.7
3.1
3.2
4.1
4.2
Expression des ARJ'Jm de l'hormone lactogène placentaire (hPL),
de hCG et de hCGf3 durant la différenciation in vitro
des cellules humaines cytotrophoblastiques
28
Schéma montrant les causes possibles de la diminution
du transport de l'acide linoléique dans les syncytiotrophoblastes
lors d'obésité pré-grossesse maternelle
61
Schéma montrant les causes possibles de la diminution
du transport de l'acide linoléique dans les syncytiotrophoblastes
lors de maigreur pré-grossesse maternelle
61
Graphiques illustrant l'influence d'une incubation d'une heure
avec des concentrations croissantes d'insuline sur le transport
à 3 minutes de l'acide linoléique dans A) les cytotrophoblastes et
dans B) les syncytiotrophoblastes
64
Courbe d'incorporation de l'acide linoléique dans
des trophoblastes placentaires après A) 1 jour de culture
(cytotrophoblastes) et B) 4 jours de culture (syncytiotrophoblastes)
vu
4.3
4.4
selon le traitement avec l'insuline
64
Présence des gènes de différentes protéines de transport des acides
gras dans placenta total
65
Présence des gènes de différentes protéines de transport des acides
gras dans les cytotrophoblastes (Cyto) et dans les
syncytiotrophoblastes (Sync)
66
LISTE DES ABRÉVIATIONS
ADRP
Adipophiline
AFP
Alphafétoprotéine
AGE
Acide gras essentiel
AGL
Acide gras libre
AGLC
Acide gras à longue chaîne
AGPI-LC
Acide gras polyinsaturé à longue chaîne
AL
Acide linoléique
AMPc
Adénosine mono-phosphate cyclique
ARNm
Acide ribonucléique messager
ATP
Adénosine tri-phosphate
CAV
Cavéoline
CT
Cholestérol total
FABPpm
Protéine de la membrane plasmique liant les acides gras
FAT
Translocase des acides gras
FATP
Protéine de transport des acides gras
g
Grammes
GLUT
Transporteur de glucose
HDL
Lipoprotéine de haute densité
hPL
Hormone lactogène placentaire humaine
IX
IMC
Indice de masse corporelle
KDa
Kilodalton
LDL
Lipoprotéine de faible densité
LPL
Lipase des lipoprotéines
M
Molaire
PKA
Protéine kinase A
PPAR
«Peroxisome-proliferator-activated recepteur»
PPRE
«Peroxisome-proliferator-responsive element»
SREBP
Protéine de liaison de l'élément de réponse aux stérols
T3
Tri-iodothyronine
T4
Thyroxine
TBG
Globuline liant la T4
TG
Triglycéride
TNF
Facteur de nécrose tumorale
TSH
Thyréostimuline
VLDL
Lipoprotéine de très faible densité
RÉSUMÉ
La prévalence accrue de surplus pondéral et d'obésité chez les femmes en âge de
procréer est un problème de santé publique. De nombreuses études ont démontré
qu'un poids maternel trop faible ou trop élevé peut influencer le poids du nouveau-né
et ainsi influencer son état de santé actuelle et future. Durant la grossesse,
l'accumulation de gras fœtal survient au dernier tiers. La disponibilité des acides gras
essentiels pour le fœtus ne dépend pas seulement de l'apport maternel en acide gras
mais aussi de la fonction placentaire elle-même ainsi que des changements et des
adaptations physiologiques et biochimiques qui surviennent durant la grossesse. Afin
de vérifier l'influence d'un poids maternel hors norme sur ces facteurs de
disponibilité des acides gras, l'isolation de cellules trophoblastiques a été effectuée à
partir de placenta frais provenant de femmes ayant une masse corporelle au-dessous
de la normale (IMC<20 kg/m 2), de femmes ayant une masse corporelle normale (20
kg/m2 <IMC<26 kg/m 2) et de femmes obèses (BMI>30 kg/m 2). Ces femmes faisaient
partie d'une banque de femmes recrutées pour participer au Projet Lipides de notre
laboratoire de physiologie materno-fœtale. Des études de transport d'acide linoléique,
un acide gras essentiel, ont ensuite été effectuées sur des syncytiotrophoblaste et des
cytotrophoblastes isolées à partir des placentas des femmes recrutées pour le projet.
Par la suite, ce transport d'acide linoléique a été mis en relation avec les dosages
maternelles lipidiques et hormonaux des deuxième et troisième tiers ainsi qu'avec les
dosages lipidiques et hormonaux fœtaux à la naissance. Cette étude met en évidence
une diminution du transport syncytiotrophoblastique de l'acide linoléique par la
maigreur et l'obésité pré-grossesse maternelle. En fait, le transport de l'acide
linoléique est davantage perturbé dans les syncytiotrophoblastes, que dans les cellules
trophoblastiques précurseurs, les cytotrophoblastes. De plus, l'obésité (lMC>30) pré­
grossesse a été corrélée à une augmentation des niveaux maternels d'insuline lors du
deuxième et troisième tiers ainsi qu'à une diminution des concentrations de TSH et
d'AFP. D'autre part, la maigreur (lMC<20) pré-grossesse diminue les niveaux d'AFP
et de T3 du troisième tiers et du sang fœtal à terme. Ces importantes altérations des
niveaux hormonaux qui surviennent durant les grossesses de femmes obèses et de
femmes maigres pourraient expliquer la diminution du transport placentaire de l'acide
linoléique, un acide gras essentiel.
Mots clés: grossesse, placenta, obésité, indice de masse corporelle, trophoblaste.
INTRODUCTION
Les maladies cardiovasculaires sont aujourd'hui la première cause de mortalité dans les
pays industrialisés. Le facteur de risque le plus important et imposant de ces maladies est
sans contredit l'obésité. Dans les pays riches, entre 10% et 20% de la population est
obèse. L'obésité correspond de façon épidémiologique et anthropométrique à un indice
de masse corporelle (IMC) supérieur à 30 kg/m 2 (World Health Organization, 2000). Plus
de 50% des canadiennes (Statistiques Canada, 2005) et plus 60% des américaines (Flegal
et al., 2002) ont un poids supérieur à leur poids santé, leur IMC étant supérieur à 26
kg/m 2 , La prévalence accrue de surplus pondéral et d'obésité chez les femmes en âge de
procréer est un problème de santé publique. Des données américaines révèlent que 26%
des femmes entre 20 et 39 ans ont un surplus pondéral (IMC entre 25 et 30 kg/m 2) et 29%
sont obèses (IMC > 30 kg/m 2) (Hedley et al., 2004). Les femmes avec un surplus
pondéral ou les femmes obèses courent des risques accrus de problèmes de santé
chroniques tels les maladies cardiovasculaires (Pi-Sunyer, 1993; U.S. Department of
Health and Human Services, 2001; U.S. Department of Health and Human Services,
1998) et le diabète ainsi que des problèmes d'infertilité et d'irrégularités menstruelles
(Balen et al., 1995; Zaadstra et al., 1993).
L'obésité et les désordres métaboliques qui y sont reliés sont des problèmes prévalents
dans la société moderne et imputables au mode de vie ainsi qu'aux facteurs nutritionnels.
Cependant, les mécanismes par lesquels les facteurs environnementaux modulent les
systèmes physiologiques contrôlant la régulation du poids et l'étiologie des désordres
métaboliques, qui se manifestent à l'âge adulte, prennent racines avant la naissance.
L'influence de la programmation par les conditions nutritionnelles in utero sur la
croissance fœtale et sur la susceptibilité de développer des maladies à l'âge adulte est
maintenant reconnue (Barker, 1994; Hales, 1997; Godfrey & Robinson, 1998; Godfrey &
2
Barker, 2000). En effet, l'empreinte métabolique fœtale a des effets permanents sur la
croissance et le développement post-nataux (Strauss, 1997; Davenport et al., 1990;
Gallaher et al., 1998; Garofano et al., 1998). Les fonctions métaboliques placentaires
n'échappent pas à cette empreinte. Ainsi, les cellules placentaires subissent, lors de la
grossesse, des changements irréversibles qui auront des répercussions sur les différentes
fonctions du placenta (Godfrey & Robinson, 1998). Le fœtus subit donc pleinement les
excès ou les carences de sa mère car une nutrition pauvre et/ou inadéquate peut résulter
en une augmentation du taux d'obésité (Ravelli et al., 1999) ainsi qu'en une résistance à
l'insuline (Hofman et al., 1997) chez J'enfant.
Le profil lipidique de la mère, c'est-à-dire la composition en lipides (cholestérol total,
VLDL, LDL, HDL, triglycérides, acides gras totaux et acides gras libres) du sang
maternel, a des impacts certains sur le bon développement ainsi que sur la croissance
fœtale étant donné que, pour certains acides gras, le fœtus dépend entièrement de l'apport
maternel O'!ettleton, 1993; Jumpsen et Clandinin, 1995). Le transport de ces lipides à
travers le placenta reste encore aujourd'hui mal connu et ce, malgré son importance sans
équivoque. En effet, le transport des lipides demeure le transport de nutriments le moins
bien caractérisé en général. De plus, la façon précise dont les acides gras entrent dans les
cellules n'est pas encore caractérisée et les mécanismes clairs par lesquels les acides gras
traversent les cellules du placenta le sont encore moins. Pourtant, les acides gras sont
cruciaux pour une diversité de processus cellulaires plus importants les uns que les autres
tels la signalisation cellulaire, la formation des membranes, la perméabilité et l'intégrité
membranaires. Les perturbations dans le transport puis le métabolisme des acides gras
sont impliquées dans le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline dans
plusieurs tissus (Frayn, 2002).
3
Dans une société souffrant de la « mal bouffe» et où la prévalence de l'obésité est sans
équivoque, les impacts du profil lipidique et de l'IMC maternels sur l'être à naître
gagnent à être connus. En connaissant davantage l'étiologie de l'obésité, il est possible de
mieux cerner les déterminants de ce véritable fléau, d'y trouver des solutions, voire de le
prévenir
CHAPITRE 1
ÉTATS DES CONNAISSANCES
1.1
LES CHANGEMENTS PHYSIOLOGIQUE DURANT LA GROSSESSE
1.1.1
Métabolisme des nutriments durant la grossesse
Au cours de la grossesse, on assiste à des modifications métaboliques dont le but est de
préserver les besoins énergétiques de la mère et du foetus. Ces modifications
métaboliques sont en relation avec des changements hormonaux liés à la présence du
foetus et du placenta, qui deviennent un site supplémentaire de production hormonale et
de métabolisation des hormones maternelles. Ces modifications hormonales comportent
une augmentation progressive en cours de grossesse des hormones hPL (<<human
placental lactogen»), de la progestérone, de la prolactine et du cortisol. La hPL est une
hormone polypeptidique, produite par les cellules du syncytiotrophoblaste placentaire. A
partir de la 22 éme semaine d'aménorrhée, c'est elle qui prend la relève du couple
oestrogène-progestérone afin de maintenir la grossesse. Avec l'augmentation du volume
du placenta, la hPL s'élève pour atteindre un maximum à la 38 éme semaine, puis diminue
juste avant l'accouchement. La hPL a comme fonction d'augmenter la lipolyse au cours
du jeûne et ainsi la production d'acides gras libres, permettant à la mère de les utiliser
comme source d'énergie, alors que le glucose et les acides aminés sont conservés pour les
besoins du foetus (Hare & Brown, 1995). Ceci explique qu'en cas de jeûne prolongé (12­
16 h), du fait du passage transplacentaire facilité du glucose et des acides aminés, on
assiste chez la mère à une hypoglycémie, une hypoalaninémie et (à cause de
l'augmentation de la lipolyse) à une hypercétonémie. Cette triade d'altérations présente
chez la femme enceinte lors du jeûne, a été nommée par Freikel et coll.
(~eûne
accéléré»
5
(<<accelerate starvation») (Hare & Brown, 1995). En plus de ce mécanisme relativement
défavorable pour l'économie énergétique de la mère, Freikel et coll. en ont décrit un autre
en 1991, qui lui, favorise la mère et qu'ils ont appelé « anabolisme facilité» (<<facilitated
anabolism»). En effet, selon ces auteurs, lorsque des femmes enceintes ingèrent 1OOg de
glucose, on assiste à une augmentation des taux de glucose, d'insuline, des triglycérides
ainsi qu'à une suppression de la sécrétion du glucagon. Ceci entraîne une augmentation
du glucose disponible pour le foetus, une augmentation des triglycérides pour la mère
(car ils passent peu la barrière placentaire) et une diminution de la stimulation de la
néoglucogénèse, de la glycogénolyse et de la cétogénèse. En outre, ils observent lors de
la nutrition une diminution des taux de l'hPL permettant une réduction de la lipolyse. En
résumé, la grossesse, du fait de son status hormonal particulier, est caractérisée par la
rapidité des séquences de mise en réserve et de mobilisation de ces réserves. Ceci se
manifeste chez la femme enceinte par de plus grandes oscillations du taux de glucose et
d'insuline. La glycémie à jeun est normalement plus basse qu'en dehors de la grossesse et
est habituellement comprise en 3,3 et 3,9 mmoll1. On constate que la première moitié de
la grossesse est caractérisée par la prédominance de l'anabolisme: la mère met en réserve
des nutriments. A partir de la 22 ème semaine d'aménorrhée, c'est le catabolisme qui
prédomine.
Chez la femme, la fonction thyroïdienne subit d'importants changements durant la
grossesse. L'élévation des taux d'œstrogènes provoque une hausse marquée du taux de
globuline liant la thyroxine (TBO), une protéine de transport (Olinoer, 1993). Cette
augmentation de la synthèse de la TBO a pour effet d'abaisser la concentration en
thyroxine (T4) et d'accroître la sécrétion de la thyréostimuline (TSH) par l'hypophyse. Il
en résulte une demande accrue exercée sur la thyroïde et donc un accroissement de la
production et de la sécrétion de triiodothyronine (T3) et de T4 (Becks & Burrow, 1991).
Des études récentes ont démontré que toute perturbation de la fonction thyroïdienne chez
la mère durant le développement du fœtus peut nuire au développement normal du fœtus
(Abalovich et al., 2007). De plus, les changements physiologiques associés à la grossesse
nécessite une augmentation de la disponibilité des hormones thyroïdiennes de l'ordre de
6
40 à 100% afin de palier aux besoins de la mère et du fœtus durant la grossesse
(Smallridge et al., 2005).
Lors de l'état non gravide, les hormones thyroïdiennes exercent un effet marqué sur le
métabolisme des lipides et des glucides. La T4 et la T3 sont les deux hormones
thyroïdiennes. Ces deux hormones sont stockées dans la colloïde de la glande thyroïde
jusqu'à ce qu'il y ait stimulation de cette glande par la TSH, une hormone hypophysaire.
Dans le sang, la principale représentante des hormones thyroïdiennes est la T4. Celle-ci
est convertie en T3 active dans les cellules par des déiodinases. La T3 et la T4 agissent en
augmentant le métabolisme basal en stimulant l'activité métabolique dans la plupart des
tissus. Chez l'humain, il existe par ailleurs une corrélation inverse entre les taux
d'hormones thyroïdiennes et les concentrations de triglycérides et de cholestérol dans le
plasma (Tulloch et al., 1973). La mobilisation des graisses est stimulée par la hausse des
taux d'hormones thyroïdiennes, ce qui entraîne une augmentation des concentrations
plasmatiques d'acides gras. Ces hormones favorisent également, dans bien des tissus,
l'oxydation des acides gras. Quant au métabolisme des glucides, les hormones
thyroïdiennes augmentent la néoglucogénèse et stimulent l'entrée du glucose dans les
cellules (Tortora & Grabowski, 2001).
La grossesse implique donc de profonds changements métaboliques ainsi que des
modifications dans le profi 1plasmatique de différentes hormones et nutriments. En outre,
la grossesse humaine est caractérisée par une hyperlipidémie physiologique prononcée
(Belo et al., 2004). Durant une grossesse normale, les triglycérides plasmatiques
s'accroissent de deux à quatre fois et le cholestérol, pour sa part, augmente de 25 à 50%
(Alvarez et al., 1996; Potter & Nestel, 1979; Ordovas et al., 1984; Piechota &
Staszewski, 1992). Cette augmentation sert à compenser les dépenses énergétiques
maternelles mais surtout à supporter l'immense chantier en construction que représente le
fœtus (Hornstra et al., 1995) ainsi qu'à préparer le corps de la femme à l'accouchement et
l'allaitement.
7
1.1.2
Importance de l'IMC et du gain de poids
Dans une grossesse nonnale unipare, le gain de poids normalisé de la mère est de Il à 18
Kg et correspond principalement au contenu intra-utérin incluant le fœtus, le liquide
amniotique et l'utérus gravide mais aussi à l'augmentation du dépôt des graisses, du
volume sanguin et des seins (Udal et aL, 1978; Williams, 1989). La femme, pour survenir
aux besoins grandissants de l'embryon puis du fœtus, doit avoir un gain de poids adéquat.
En fait, si le gain de poids de la mère est trop faible (Ogunyemi et aL, 1998; Williams,
1989) ou trop élevé (Zhou & Olsen, 1997), le poids du nouveau-né peut être hors normes,
ou pire encore, la santé de ce dernier peut être compromise.
En effet, il a été démontré qu'un gain de poids excessif avant la grossesse, donc un IMC
pré-grossesse supérieur à la normal, peut entraîner l'accroissement significative de 1)
l'adiposité de l'enfant (Abrams & Laros, 1986; Field et al., 1995; Johnson et al., 1992;
Nahum et a1., 1995; Rossner & Ohlin, 1990; Udal et aL,1978), 2) de désordres
métaboliques tels que le diabète de type 11 (Osmond & Barker, 2000) et 3) de risques de
malformations fœtales (Patel & Klein, 1995). Encore, une prise de poids excessive au
cours de la grossesse a des effets délétères sur le déroulement de la grossesse et de
l'accouchement en favorisant la macrosomie fœtale (Deruelle et aL, 2004). D'autres
études démontrent que si le gain de poids durant la grossesse est excessif chez des
femmes ayant un poids nonnal avant leur grossesse, il ya augmentation du risque d'avoir
un nouveau-né avec un poids supérieur à la normale (plus de 4 kg) (Johnson et aL, 1992;
Thorsdottir & Birgisdottir, 1998; Zhou & Olsen, 1997). Au contraire, si le gain de poids
durant la grossesse est inférieur à la nonnale (moins de Il kg), il peut en résulter des
nouveaux-nés avec un poids sous la normale (moins de 2,5 kg) (Johnson et aL, 1992;
Osmond, 2000). Des études montrent une relation inverse entre le poids à la naissance et
le risque de développer des maladies cardiovasculaires et un métabolisme lipidique
anormal à l'âge adulte (Barker et aL, 1993; Barker, 1995; Barker, 1996).
8
1.1.3
Importance du profil en acides gras et de l'insuline
L'insuline augmente le flux d'acides gras dans les cellules comme les adipocytes en
activant la lipoprotéine lipase qui elle libère les acides gras pour qu'ils puissent être pris
par les cellules et en inhibant la lipase hormono-sensible, l'enzyme responsable de
l'hydrolyse des gras des adipocytes.
La grossesse s'accompagne d'une résistance à l'insuline graduelle débutant à la ml­
grossesse et qui progresse jusqu'au troisième trimestre pour se situer approximativement
au niveau d'un individu souffrant d'un diabète de type II. Cette résistance à l'insuline
semble être le résultat de la combinaison de l'accroissement de l'adiposité maternelle et
des effets des hormones produites par le placenta qui désensibilisent l'organisme
maternel à l'insuline (Buchanan & Xiang, 2005). De plus, les niveaux de glucagon ne
sont pas réprimés durant la grossesse car il y a une diminution de la sensibilité des
cellules a du pancréas (Beis et al., 2005). Une résistance à l'insuline est aussi remarquée
chez les individus souffrant d'obésité (Pietlilainen et al., 2004).
En outre, des études effectuées sur des rats obèses ont démontré que le transport des
acides gras est augmenté dans le cœur, les muscles et dans le tissu adipeux (Luiken et al.,
2001). L'accumulation intramusculaire de triglycérides (Anderwald et al., 2002; Pan et
al., 1997) et des esters d'acyl-CoA à longues chaînes (Ellis et al., 2000) et l'augmentation
des acides gras à longues chaînes (AGLC) circulants (Boden, 1996; Boden & Chen,
1999) sont associées à la résistance à l'insuline dans les muscles squelettiques chez des
rats et des humains obèses et/ou souffrant de diabète de type 2.
L'obésité durant la grossesse (IMe au premier tiers grossesse de plus de 30 kg/m 2) peut
donc exacerber cette résistance à l'insuline et avoir un impact sur le transport des acides
gras étant donné que les changements dans le transport et dans les transporteurs des
acides gras sont reliés à la sévérité de la résistance à l'insuline (Luiken et al., 2002a).
9
1.2 LE PLACENTA HUMAIN
Le placenta humain dérive du blastocyte en développement dès le moment de
l'attachement ainsi que de l'implantation à la paroi utérine (Benirschke, 1998). Le
placenta se développe de concert avec l'embryon et il lui fournit un environnement
nourricier. Le placenta sert d'interface entre les circulations maternelle et fœtale (Novak,
1991) (Figures 1.1 et 1.4). Ainsi, il représente un « filtre» hautement sélectiffacilitant le
transport de molécules spécifiques, de gaz et d'ions de la circulation maternel vers la
circulation fœtale et vice-versa en même temps qu'il restreint le mouvement d'autres
molécules (Munro, 1986; Schneider, 1991 a,b; Schroder, 1995).
Zone d'échanges
,
Muscle
utérin
Veinule
maternelle...h"!!~""'Il
Veine
''''-_-"_''''l'I::r'~ ombilicale
Artère
ombilicale
Capillaires
ombilicaux
Placenta 1Artériole
!
i
Paroi utérine
maternelle
__~='J
Sang maternel /t::!!~=
Veinule
maternelle
Portion foetale
du placenta
Figure 1.1 Organisation des structures d'échange du placenta humain (Modifiée de
Lewis et al., 2002 Life 4th edition). Le fœtus humain baigne dans le liquide amniotique qui est
délimité de l'utérus maternel par la membrane amniotique. Cette membrane entoure les deux artères
ombilicales ainsi que la veine ombilicale pour fonner le cordon ombélical. Le cordon relie le fœtus à la
zone d'échanges qu'est le placenta, comprise dans la paroi utérine. C'est à ce niveau que les échanges
entre la circulation maternelle (artérioles et veinules maternels) et la circulation foetale (capillaires
ombilicaux) prennent place.
la
La cellule syncytiotrophoblastique est une cellule multinucléée mature résultant de la
fusion
de
plusieurs
cellules
précurseures
qui
se
différencient,
les
cellules
cytotrophoblastiques (King, 1993). Le schème de différenciation trophoblastique est
exposé un plus en détail dans le paragraphe suivant.
Durant l'embryogenèse mammalienne,
blastocyste
la première étape de différenciation du
mène à la formation des cellules trophoblastiques. Avant ce stade de
développement, les blastomères sont pluripotents et peuvent former soit des cellules
trophoblastiques ou des cellules de la masse interne, lesquelles formeront l'embryon. La
cellule souche placentaire se divise en cytotrophoblaste villeux, qui est le précurseur du
syncytiotrophoblaste, puis en trophoblaste extravilleux, qui lui, est le précurseur de la
colonne de cellules trophoblastiques invasives qui s'insère dans le myomètre de l'utérus
gravide et qui sert d'ancrage au placenta. Une représentation schématique de ce schème
de différenciation
ainsi que de plusieurs facteurs connus induisant ou inhibant la
différenciation cytotrophoblastique sont exposés dans la figure 1.1 ci-dessous.
0
H
/
U
Cellule de la masse interne
--~)
Foetus
Cellule souche placentaire
Blastocyte
Blastomère
Cytotrophoblaste villeux
j
+
IGF-1
CSF-1
Fibronectine
Glucocorticoïdes
GM-CSF-1
EGF
Collagène 1
L1F
Lepline
AMPc
TGF~
hCG
l
Cytotrophoblaste extravilleux
TGF~1
TGF~2
Glucocorticoïdes
Hypoxie
+
Activine
L1F
IL-1~
Trophoblaste invasif
Syncytiotrophoblaste
Figure 1.2 Représentation schématique du développement du placenta humain.
Quelques facteurs régulant la différenciation du cytotrophoblaste villeux et
extravilleux sont indiqués. Le signe « + » indique les facteurs stimulant la différenciation; le
signe « - » indique les facteurs inhibant la différenciation. IGF-I, «insulin-like growth factor-I»; CSF­
1, «colony-stimuJating factor-I »; GM, «granulocyte/macrophage»; EG F, «epidermal growth factor»;
TGFI3, «transforming growth factor beta»; hCG, «chorionic gonadotropin»; L1F, «Ieukemia inhibitory
factor»; IL, «interleukin». [Adaptée de Handwerger et Aronow, 2003]
Il
Plusieurs revues de la littérature résumant en détail le processus de différenciation ont
d'ailleurs été publiées (Morrish et al., 1998; Cross, 2000; Knofler et al., 2001).
L'organisation du syncytiotrophoblaste correspond à celle d'une structure impliquée dans
le transport actif. En effet, la surface d'échange du syncytiotrophoblaste est augmentée
par les microvilli et elle est remplie de structures vésiculaires de différentes tailles (Jones
& Fox, 1991).
1.2.1
Un organe d'échange
Le placenta est un organe temporaire comprenant des cellules trophoblastiques hautement
spécialisées. Ces cellules forment une barrière permissive mais sélective entre l'utérus
maternel et le fœtus. Les cellules trophoblastiques régulent de façon directionnelle le
transport des nutriments de la circulation maternelle vers la circulation fœtale (Knipp et
al., 1999) ainsi que le transport en sens inverse à l'intérieur des villosités placentaires
(Figures 1.3 et lA). D'ailleurs, toute substance traversant du sang maternel au sang fœtal
doit franchir le trophoblaste villeux, un véritable syncytium d'une épaisseur de 4 flm. Ce
syncytium
est
le
syncytiotrophobJaste.
Le
syncytiotrophoblaste
comporte
deux
membranes: une membrane microvilleuse baignant dans le sang maternel et une
membrane basale faisant face au sang fœtal (Sideri et al., 1983; Lafond et al., 1988;
Robidoux et al., 1998; Kaufmann & Scheffen, 1998).
Les échanges materno-fœtaux s'établissent dans cette matrice élitiste qui s'accroît en
surface de 830 cm 2 à trois semaines jusqu'à environ 125 000 cm2 à terme (Kaufmann &
Scheffen, 1999). Le placenta représente donc un formidable organe de transfert pour les
divers nutriments, ions, vitamines, déchets et autres molécules nécessaires à la croissance
fœtale et à l'homéostasie de la circulation fœtale à la circulation maternelle et vice-versa.
12
Figure 1.3 Micrographie électronique d'une villosité placentaire. lVS, espace intervilleux
(contenant le sang maternel); S, syncytiotrophoblaste; C, cytotrophoblaste; E, endothélium; Fe,
lumière du capillaire fœtal (contenant le sang fœtal). Grossissement, x 500. [Dans Knobil et Neill,
1998]
nssu conjonctif
d. la viNosité
EndothéUum
du c::apRlal.re
foetal. . .
~
Cytotrophoblaste
_ _'l>!'l
Sang maternel
dans l'.spac.
IntervRleux
Figure 1.4 Organisation des cellules de la zone d'échange entre la circulation
maternelle et foetale. La zone d'échange prend place dans les villosités chorioniques. Les
échanges de la mère vers le fœtus
s'effectuent donc du sang maternel, à travers le
syncytiotrophoblaste, puis le tissu conjonctif de la villosité chorionique puis l'endothélium du
capillaire fœtal pour rejoindre le sang fœtal. (Modifiée de Anonyme 2003)
13
1.3 LES ACIDES GRAS
L'acide linoléique (18 :2(06) et l'acide a-linoléique (18 :3(03) sont les deux acides gras
essentiels (AGE) parents de tous les autres acides gras tel que schématisé dans la figure
1.3 de la page suivante. L'équilibre entre les acides gras 006 et 003 dans la diète est
important étant donné leur nature moléculaire compétitive et leurs rôles biologiques
différents. Les deux AGE parents sont métabolisés en acides gras polyinsaturés à longue
chaîne (AGPI-LC) de 20 ou 22 atomes de carbone. Les enzymes qui gouvernent cette
synthèse sont les désaturases et les élongases (Sprecher & Chen, 1999). (Figure 1.3)
===:::j~=====:::::==-
~=====i~===~::::==-
Figure 1.5 Schéma illustrant le métabolisme des acides gras essentiels: l'acide
linoléique et l'acide a-linoléique. (Dans Das, 2003) Les acides gras essentiels sont cruciaux
pour le développement fœtal et les fonctions placentaires. Les enzymes de désaturation et d'élongation
assurent la conversion placentaire et fœtale des AGLC. Ces enzymes se retrouvent dans le foie fœtal et
dans le placenta mais les activités hépatique fœtale et surtout placentaire de ces enzymes sont plutôt
faibles. Les prostaglandines, essentielles à plusieurs processus cruciaux de la grossesse (implantation,
parturition plus particulièrement), sont synthétisées à partir des AGLC.
14
Les acides gras sont des nutriments de première importance durant toute la grossesse. En
plus de représenter une source énonne d'énergie métabolique entreposable pour la mère,
le fœtus et le placenta (Hornstra et al., 1995; Shekhawat et al., 2003), les acides gras sont
précurseurs de plusieurs molécules importantes dans les processus de la grossesse telles
les prostaglandines, véritables hormones, jouant des rôles prépondérants au niveau de
l'utérus et du placenta autant de manière paracrine que autocrine au moment de
l'implantation et de la parturition en particulier (Allen & Harris, 2001).
Durant le troisième trimestre de la grossesse, les AGPl-LC sont très importants pour la
croissance et le développement du système nerveux, pour la fonnation des membranes
cellulaires ainsi que pour divers processus physiologiques essentiels au fœtus (Neuringer
et al., 1986; Crawford et al., 1989; Bourre et al., 1990; Holman et al., 1991). Récemment,
il a été démontré que le placenta lui-même tire de l'énergie de l'oxydation des acides gras
pour sa croissance et son développement (Shekhawat et al., 2003), ce qui réitère
l'importance des acides gras durant la grossesse. De plus, la disponibilité des AGPl-LC
pour le fœtus dépend non seulement de l'apport diététique maternel mais aussi de la
fonction
placentaire ainsi
que des
nombreuses adaptations
physiologiques et
biochimiques qui surviennent durant la grossesse (Haggarty, 2004).
1.3.1
L'importance des acides gras comme nutriment transporté
Un apport maternel en AGE et en AGPl-LC est crucial au bon développement fœtal et à
la croissance intra-utérine. De plus, il est connu que les AGE destinés au foetus doivent
obligatoirement être puisés à même la diète maternelle car l'humain est incapable
d'introduire les doubles liens présents aux carbones 3 et 6. Les AGPl-LC quant à eux
peuvent être synthétisés par la mère et le fœtus, mais la forte mobilisation maternelle de
AGPl-LC durant la grossesse montre l'importance de leur apport.
15
En outre, il a été démontré que le placenta possède des activités désaturases et élongases
beaucoup moindres que celles des foies maternel et fœtal (Booth et al., 1981; Chambaz et
al., 1985; Haggarty et al., 1997; Cho et al., 1999). 11 Y a donc très peu de conversion
placentaire de AGE en AGP1-LC. Le transport placentaire de ces AGE et AGP1-LC est
donc indispensable pour combler les besoins grandissants du fœtus, besoins qui
deviennent immenses au troisième tiers de la grossesse et qui coïncident avec la période
critique du développement du cerveau (Campbell et al., 1997). La composition en acides
gras de la diète maternelle à un effet direct sur la disponibilité de chaque acide gras
retrouvé dans la circulation fœtale (Haggarty, 2004).
1.4 LE TRANSPORT DES ACIDES GRAS
L'étape du transport des acides gras est fortement susceptible d'être la cible d'une
régulation étant donné que ce transport limite le taux de métabolisme cellulaire. Des
études de captation des acides gras suggèrent que les acides gras exogènes sont
métabolisés au même taux qu'ils entrent dans la cellule et que le transport d'acides gras
est activé en présence d'adénosine tri-phosphate (ATP) (Abumrad et al., 1981; Abumrad
et al., 1986; Melki & Abumrad, 1992; ). D'autres études démontrent que la contraction
musculaire est associée à l'accroissement de l'influx d'acides gras dans la cellule
(Turcotte et al., 1998; Luiken et al., 1999; Bonen et al., 1999). Un point intéressant est
que l'augmentation du taux de transport des acides gras dans le sarcolemme musculaire
n'est pas associée à un accroissement de l'expression des transporteurs d'acides gras
mais est plutôt associée à une augmentation de la présence de FAT/CD36 au niveau de la
membrane plasmique (Bonen et al., 2004). Le taux de transport des acides gras devient
un facteur limitant le métabolisme des acides gras. 11 est donc intéressant de s'attarder à
l'influence du profil maternel en acides gras sur la captation des acides gras par les
cellules du placenta et cela autant au niveau de l'expression génétique des protéines
impliquées dans le transport des acides gras qu'au niveau de la captation même des
acides gras.
16
Les AGE ou AGPI-LC de la circulation maternelle peuvent être transportés vers le
placenta soit sous la forme d'acides gras libres, liés à l'albumine, ou sous la forme de
triglycérides dans les lipoprotéines. Il est important de noter que seuls les acides gras non
estérifiés sont assimilés par la membrane plasmique des syncytiotrophoblastes (Haggarty,
2002). Ainsi, les triglycérides contenus dans les lipoprotéines sont transformés, sous
l'action d'une lipase membranaire, en acides gras non estérifiés avant de traverser le
placenta.
La captation des acides gras par les membranes cellulaires (dans ce cas, membranes
cellulaires des cytotrophoblastes ou des syncytiotrophoblastes) peut être décortiquée en
plusieurs étapes différentes: 1) la dissociation des acides gras de l'albumine (ou de
l'alphafoetoprotéine (AFP)); 2) l'adsorption, c'est-à-dire la diffusion à travers la barrière
de diffusion (l'espace entre les cellules dans le tissu) et l'association au feuillet externe
de la membrane plasmique ou 2') l'association à une protéine impliquée dans le transport
des acides gras; 3) le mouvement à travers la membrane plasmique; 4) la dissociation du
feuillet interne de la membrane pour entrer dans le cytosol; 5) la diffusion, sous forme de
monomères ou liés au FABP, à travers le cytosol vers les sites de liaison et d'utilisation
(mitochondries, peroxisomes, réticulum endoplasmique); et 6) le métabolisme (Hamilton
& Kamp, 1999). Toutes ces étapes définissent le transport des acides gras mais la
présente étude n'observera prioritairement que les étapes 1 à 4.
Pour gagner le fœtus, les acides gras de la circulation maternelle traversent une véritable
matrice régulatrice, le syncytiotrophoblaste. Les acides gras peuvent traverser les
membranes trophoblastiques de surface soit par diffusion simple ou par transport facilité
médié par des protéines de transport et de liaison des acides gras, qu'elles soient
membranaires ou cytosoliques.
17
Il est connu que les protéines de liaison et de transport des acides gras entrent
constamment en compétition avec des flux de diffusion simple très rapides
(tJ/2~
20ms) à
travers la membrane de phospholipides (Kamp et al., 1995; Hamilton & Kamp, 1999).
C'est pourquoi les transporteurs membranaires du placenta doivent, pour justifier leur
présence sur les membranes syncytiotrophoblastiques maternelles et foetales, remplir une
fonction efficace et unique. Les protéines de liaison et de transport semblent en fait
occuper des rôles directs dans le transfert privilégié de AGE et des AGPI-LC, lesquels
étant cruciaux au bon fonctionnement de l'unité foeto-placentaire (Haggarty, 2004). La
prise préférentielle des AGE et AGLC médiée par des transporteurs est démontrée par la
saturabilité du transfert placentaire des acides gras. Il existe, en effet, une inhibition
compétitive du transport entre différents acides gras (Campbell et al. 1997). Cette
compétition entre différents acides gras pour la prise sélective par la cellule a été
démontrée dans de nombreux autres systèmes cellulaires tels les adipocytes (Abumrad et
al., 1984), les hépatocytes (Stremmel & Berk, 1986), les myocytes (Stremmel, 1988) et
les cellules intestinales (Stremmel, 1988; Trotter et al., 1996; Chen et al., 2001).
Par ailleurs, il a été démontré qu'une protéine de la membrane microvilleuse des
syncytiotrophoblastes, la «plasma membrane fatty acid-binding protein (FABP pm ), joue
un rôle critique dans l'incorporation préférentiel des AGPI-LC du pool maternel
plasmatique d'acides gras libres (AGL) (Campbell & Outta-Roy, 1995; Campbell et al.,
1997). Ce pool maternel contient moins de 4,5% de AGPI-LC contre 76,7% d'acides gras
non essentiels (Campbell et al., 1997) et pourtant ces AGPI-LC sont incorporés de façon
prioritaire. La fonction des protéines membranaires de liaison et de transport des acides
gras résiderait donc dans la régulation de l'apport maternel en acides gras pour l'unité
foeto-placentaire.
18
M'e,mbrarie
basalë
Membra~e
microvnlëuse
Figure 1.6 Distribution syncytiotrophoblastique des protéines impliquées dans le
transport et la liaison des acides gras. (Fatty acid transfert prote in : FATP; fatty acid
translocase: FAT; plasma membrane fany acid binding protein: FABP pm ) sur la membrane
microvilleuse et la membrane basale des syncytiotrophoblastes. Seulement les acides gras non
estérifiés (ou acides gras libres) (AGL) peuvent être incorporés dans la membrane plasmique puis être
utilisés (AG) ou réestérifiés et entreposés. Ces AGL proviennent de l'hydrolyse des triglycérides (TG)
circulants de la mère sous l'action d'une lipase placentaire membranaire.
19
1.4.1
Les protéines de liaison des acides gras
1.4.1.1 L'albumine
L'albumine est une protéine synthétisée par le foie et elle assure en grande partie la
pression oncotique du plasma. Elle est constituée d'une chaîne polypeptidique de 584
acides aminés et a un poids moléculaire de 66 kDa (Peters, 1975). L'albumine sert au
transport de plusieurs médicaments et composés hydrophobes endogènes comme les
AGL, les hormones thyroïdiennes et autres honnones liposolubles ainsi que la bilirubine
non conjuguée. Aussi, l'albumine lie de manière compétitive les ions calcium (Ca 2+) et
joue un rôle tampon du pH sanguin.
La proportion d'AGL en circulation et d'albumine est de l'ordre de 4 :1 (mole: mole) et
l'albumine possède la capacité intrinsèque de liaison de six AGL avec une affinité
décroissante avec J'addition d'un AGL (Abumrad, Coburn et Ibrahimi, 1999).
1.4.1.2 L'AFP
L'albumine ne représente toutefois pas le seul transporteur des AGL. En effet, l'AFP est
un transporteur important des AGL (Courtois et al., 1992). L'AFP est une glycoprotéine
constituée d'une chaîne simple d'un peptide globulaire ayant une masse moléculaire de
70 kDa et fonnée de 590 acides aminés. L'AFP et l'albumine partagent 40%
d'homologie (Morinaga et al., 1983). Elle est synthétisée au départ par le sac vitellin,
ensuite par le tractus gastro-intestinal fœtal, puis par le foie fœtal. Les niveau d'AFP dans
le plasma foetal augmentent jusqu'au terme du premier tiers puis diminuent durant les
deux derniers tiers. Étant donné que le fœtus excrète l'AFP dans ses urines, les niveaux
d'AFP dans le liquide amniotique sont le reflet des niveaux d'AFP dans le plasma fœtal.
Les niveaux d'AFP maternels pour leurs parts sont beaucoup plus faibles que les niveaux
foetaux mais continuent d'augmenter jusqu'à la
3ième semaine de grossesse. L'AFP peut
migrer du compartiment fœtal et vers le compartiment maternel soit par diffusion via la
circulation transplacentaire soit par le liquide amniotique à travers les membranes fœtales
(Gitlin, 1975).
20
L'AFP et J'albumine peuvent contenir des quantités comparables d'AGL à 14-18 atomes
de carbone mais pour ce qui est des AGPI-LC, l'AFP peut en contenir 16 fois plus que
l'albumine. Il est aussi reconnu que l'AFP possède une affinité plus importante que
l'albumine pour l'acide palmitique ainsi que pour acide linoléique et une affinité
beaucoup plus importante encore pour l'acide arachidonique. En outre, l'AFP joue un
rôle primordial dans le métabolisme fœtal des AGPI-LC (Carlsson et al., 1980).
1.4.1.3 La FABP pm
La
FABP pm
est
ancrée
dans
la
membrane
microvilleuse
maternelle
des
syncytiotrophoblastes seulement (Campbell & Outra-Roy, 1995). Aussi, il a été démontré
que la FABP pm favorise le transfert unidirectionnel des AGPI-LC vers la circulation
fœtale (Campbell et al., 1997; Campbell et al., 1998; Outra-Roy, 2000). Les fonctions
précises des protéines de liaison aux acides gras et de transport des acides gras restent
toujours à clarifier. Il est probable que la FABP pm agirait comme un accepteur
extracellulaire d'acides gras et ainsi faciliterait la diffusion des acides gras à travers la
bicouche de phospholipides en augmentant localement le gradient d'acides gras
extracellulaires/intracellulaires et en diminuant la distance de diffusion dans la bicouche
homogène (Glatz & van der Vusse, 1996; Hamilton & Kamp, 1999; Haggarty, 2002).
Ces protéines sont régulées à la hausse par les acides gras via l'élément de réponse du
proliférateur péroxisomal (PPRE) (Tontonoz et al., 1994a ; Issemann et al., 1992) ou par
d'autres région du promoteur ou par d'autres mécanismes qui restent encore inconnus
(Schachtrup et al., 2004).
1.4.2
Les protéines de transport des acides gras
Contrairement au flux directionnel engendré par la présence de la FABP pm, la présence de
la translocase des acides gras (FAT/C036) et des protéines de transport des acides gras
(FATP) dans la membrane plasmique implique un flux bidirectionnel des acides gras
(Haggarty, 2002). La présence des ces protéines de transport des acides gras sur les deux
membranes révèlent clairement une symétrie propre au transport bidirectionnel des acides
21
gras non-estérifiés. En effet, les FAT/CD36 et FATP se retrouvent autant dans la
membrane microvilleuse que dans la membrane basale (Haggarty, 2002; Larque et al.,
2002). Il est probable que la FAT/CD36 et les FATP soient des protéines membranaires
fonctionnant à la façon de translocases ou de transporteurs proprement dit (Haggarty,
2002).
1.4.2.1 La famille des FATP
Les FATP sont une famille de protéines membranaires de 63 KDa. À date, six membres
de cette famille ont été décrits chez l'humain (FATPI-6) (Hirsh et al., 1998). Les FATP
sont composées d'un domaine transmembranaire (deux anneaux dans le feuillet interne)
et de deux longues extensions de résidus non membranaires portant le site de liaison à
l'adénosine mono-phosphate cyclique (AMPc) ainsi que du domaine C-terminal (Lewis
et al., 2001). Les FATP ne sont pas glycosylées et elles possèdent une activité Acyl CoA­
synthétase dans leur région cytoplasmique (Steinberg et aL, 1999; Frohnert & Bernlorh,
2000). Les différentes FATP ont été localisées dans divers compartiments subcellulaires
ainsi que dans divers types cellulaires. Différents types cellulaires avec des besoins
métaboliques diversifiés révèlent des patrons de FATP spécifiques. De cette façon, une
adaptation et une régulation fines du métabolisme des acides gras, conformément aux
besoins spécifiques d'une cellule, sont possibles. Les FATP sont régulés à la hausse par
l'insuline, les agonistes des récepteurs activés par le «Peroxisome-proliferator-activated
recepteur» (PPAR), le facteur a de nécrose tumorale (TNFa) et par l'adiponectine (Stahl,
2004; Pohl et al., 2004). La translocation des FATP du pool intracellulaire vers la
membrane plasmique est aussi activée par l'insuline (Stahl et aL, 2002). De plus, il a été
rapporté que le niveau d'ARNm de la FATP 1 est diminué chez les sujets obèses,
présentant ou non un diabète de type II (Binnert et aL, 2000). Il a été démontré en outre
que les FATP peuvent être colocal isées avec FAT/CD36, ce qui laisse croire à des
interactions entres protéines aux fonctions analogues ainsi qu'à des interactions
fonctionnelles (Gimeno et al., 2003).
22
1.4.2.2 La FAT/CD36
La translocase d'acides gras/ Cluster of differentiation 36 (FAT/CD36) est une
glycoprotéine intégrale membranaire de 88 KDa retrouvée à la surface d'une grande
variété de cellules telles les mégakaryocytes, les plaquettes, les monocytes, les cellules
dendritiques, les adipocytes, les myocytes, les cellules épithéliales de la rétine et de la
glande mammaire, les cellules endothéliales des cellules microvasculaires et du petit
intestin (Febbraio et al., 2001) et enfin, les cellules trophoblastiques. La FAT/CD36
aurait deux domaines transmembranaires, de très petits domaines N- et C- terminaux
intracytoplasmiques et enfin un anneau extracellulaire glycosylé (Abumrad et al., 1993;
Abumrad et al., 1999). Le rôle premier de la FAT/CD36 serait d'accélérer la dissociation
des acides gras de l'albumine et de catalyser l'intégration des acides gras protonés dans la
bicouche externe de phospholipides de la membrane plasmique. Cette accumulation
d'acides gras crée un gradient de diffusion à travers la membrane plasmique qui est suivi
par un flip-flop des acides gras dans le feuillet interne (Ibrahimi et al., 1996). La
FAT/CD36 est co-localisée avec la protéine cavéoline-I (CAV-I) dans les cavéoles,
domaines membranaires dynamiques spécialisés dans le transport, ce qui impliquerait
que la FAT/CD36 pourrait interagir avec les CAV pour le transport intracellulaire des
acides gras. L'expression de la FAT/CD36 est spécifique à chaque tissu et est sous
contrôle métabolique (Abumrad et al., 1993). Son expression est modulée à la hausse
durant la différenciation des préadipocytes en adipocytes. Il a été démontré dans les
fibroblastes que l'expression de la FAT/CD36 est induite par les acides gras ainsi que par
d'autres molécules lipophiles telles les proliférateurs peroxisomaux (Amri et al., 1995),
ce qui suggère que le gène codant pour la FAT/CD36 est contrôlé par les PPAR. Dans le
muscle squelettique et dans le cœur, la translocation de la FAT/CD36 est induite par
l'insuline (Bonen et al., 2000 ; Luiken et al., 2002b ; Luiken et al., 2002c ; Luiken et al.,
2003) de la même façon que FATP-I et FATP-4 dans les adipocytes (Stahl et al., 2002).
23
1.4.3
Les autres protéines pouvant transporter les acides gras
La présence d'autres protéines impliquées dans le transport d'acides gras a été démontrée
dans le placenta. Les CAV sont des protéines retrouvées dans les cavéoles et la présence
de la cavéoline-l a été démontrée dans le trophoblaste vi lieux humain à terme (Linton et
al., 2003). Les cavéoles sont une sous-classe de rafts lipidiques formant des structures
dynamiques bourgeonnantes de la membrane plasmique (Couet et al., 1997) présentant
deux confonnations, ouverte et fermée. Aussi, l'adipophiline, une protéine associée aux
gouttelettes lipidiques, est exprimée dans le trophoblaste humain (Bildirici, et al., 2003).
Cette protéine joue un rôle prépondérant dans le transport des acides gras dans les
adipocytes (Gao & Serrero, 1999).
1.4.3.1 Les CAV
Les CAV sont des protéines intégrantes de la membrane de 21-24 KDa. 11 en existe trois
gènes; les CAV-l et -2 qui sont co-exprimées et peuvent former des hétéro-oligomères
dans une grande variété de tissus (Scherer et al., 1997) et la CAV-3 qui est
principalement restreinte aux cellules musculaires (Song et al., 1996). Des résultats
préliminaires du laboratoire ont montrés que les trois gènes (Cav-l, -2, et -3) sont
exprimés dans le tissu placentaire humain.
La CAV-l est la principale protéine composant les cavéoles. Gerber et al. 1993 ont
proposé que les acides gras libres diffusent à travers les cavéoles ouvertes et que ces
acides gras sont liés par les CAV. Le pH de la cavité décroît lorsque la cavité cavéolaire
se ferme, ce qui résulte en la protonation de ce lipide, la libération de la CAV puis son
partitionnement subséquent dans la membrane plasmique, favorisant ainsi la diffusion du
lipide à travers la bicouche (Gerber et al., 1993). La formation d'une cavéole dépend de
la capacité de la CAV à fonner des homo-oligomères (Sargiacomo et al., 1995; Monier et
al., 1996) ainsi qu'à interagir directement avec le cholestérol (Murata et al., 1995; Monier
et al., 1996) et les glycosphingol ipides (Fra et al., 1995). La CAV-1 et la CAV-2 sont
régulées à la hausse par PPAR-y dans les carcinomes humains et elles sont largement
exprimées dans diverses lignées cellulaires différenciées (Burgermeister et al., 2003). En
24
outre, les voies de signalisation mitogéniques et la voie de la PKAJAMPc régulent à la
baisse la transcription des gènes de la CAV-1 et -2 (Engelman et al., 1999; Yamamoto et
al., 1999).
1.4.3.2 L' adipophiline
L'adipophiline est l'orthologue humain de la protéine murine reliée à la différenciation
du tissu adipeux (ADRP), une protéine de 50 KDa (Jian & Sorrero, 1992). Elle est
fortement exprimée à la surface des gouttelettes lipidiques dans une variété de cellules et
de tissus entreposant ou synthétisant des lipides (Heid et al., 1998). En augmentant le
taux de captation d'acides gras initial, l'ADRP facilite la captation des acides gras libres
à longues chaînes (Gao & Serrero, 1999) et cela supporte le rôle de l'ADRP comme
protéine de transport des acides gras. Les AGLC stimulent l'expression de l'ADRP (Gao
et al., 2000). En effet, PPAR-y pourrait induire l'expression de l'ADRP (Tontonoz et al.,
1994; Buechler et al., 2001) malgré qu'aucun PPRE n'est été encore identifié sur la
région proximale du promoteur de l'ADRP (Eisinger & Serrero, 1993). Récemment, il a
été démontré que, dans les membranes fœtales humaines, la quantité d'ADRP augmente,
suivant la progression et de la grossesse et de J'accouchement (Meadows et al., 2005).
25
1.5 BUTS DU PROJET
Est-ce que l'obésité maternelle ou la maigreur maternelle altère le transport placentaire
d'un AGE? Dans d'autres tissus, il a été démontré que le transport des acides gras est
influencé par l'adiposité présente chez un individu, en particulier chez la femme. Le but
premier de cette étude est d'identifier l'effet d'un IMC hors norme sur le transport
placentaire de l'acide linoléique. Le transport des acides gras de la mère à son fœtus
pourrait en outre être influencé par divers facteurs plasmatiques tels les hormones
(insuline, TSH, T3, T4), la concentration en acides gras libres et en acides gras totaux, les
triglycérides, la glycémie ainsi que par les différentes apolipoprotéines plasmatiques. Le
but second de cette étude est d'identifier l'effet de ces facteurs plasmatiques maternelles
et fœtaux sur le transport placentaire de l'acide linoléique (AL). Enfin, est-ce qu'un IMC
hors norme influence le transport de l'AL dans les cytotrophoblastes ou dans les
syncytiotrophoblastes? Le dernier but de cette étude est de vérifier si un IMC hors
normes influence le transport de AL cytotrophoblastique ou le transport de AL
syncytiotrophoblastique ou les deux.
Il a été démontré que dans le muscle squelettique d'un sujet obèse les taux de transport
des acides gras étaient augmentés (Bonen et al., 2006). Dans le même ordre d'idée, il a
été démontré que certains transporteurs d'acides gras, tels la FAT/CD36 et les FATPs,
sont régulés à la hausse dans le muscle squelettique chez les sujets obèses (Bonen et al.,
2004). Cependant, étant donné l'exacerbation de la résistance à l'insuline durant la
grossesse chez une femme obèse, il est possible de croire à une diminution de l'induction
de l'expression des différentes protéines de transport des acides gras par l'insuline. Plus
particulièrement, en se basant sur des études sur les FATP, il est possible de croire que
les niveaux d'ARNm des protéines de transport seront diminués dans le placenta d'une
mère obèse. Cependant, selon d'autres études (Berk et al., 1997; Berk et al., 1999;
Luiken et al., 2002a; Lu.iken et al., 2002c) affirmant que les niveaux d'ARNm des
transporteurs d'acides gras ne reflètent pas adéquatement le transport des AGLC ni
l'expression des protéines de transport, il est possible de penser que le transport sera
26
autrement influencé par cette résistance à l'insuline. Une étude récente démontre que la
résistance à l'insuline engendre une diminution de l'expression de gènes, tels le PPAR-y,
le transporteur de glucose 4 (GLUT-4), l'adiponectine et la protéine de liaison de
l'élément de réponse aux stérols lc (SREBP-Ic), impliqués dans la différenciation des
adipocytes (McLaughlin et al., 2007).
27
1.6 CHOIX DES MODÈLES
Le transport d'un acide gras essentiel, l'acide linoléique, à travers le placenta humain sera
étudié à partir de cellules cytotrophoblastiques isolées, puis différenciées in vitro en
syncytiotrophoblastes, de placentas frais prélevés après la l'accouchement chez des
femmes de poids normal, des femmes obèses et des femmes au dessous du poids normal.
1.6.1 Le modèle de différenciation trophoblastique in vitro
La dynamique de la différenciation cytotrophobJastique a été étudiée à l'aide de cultures
primaires de cellules trophoblastiques humaine (KI iman et al., 1986; Ringler and Strauss,
1990, Richards et al., 1994). Des préparations extrêmement purifiées de cellules
cytotrophoblastiques peuvent être isolées à partir du tissu placentaire à terme ou avant
terme en utilisant une dispersion enzymatique. Les cellules ainsi isolées du tissu
placentaire s'agrègent spontanément dans le milieu de culture et fusionnent entre elles
pour former un syncytiotrophoblaste multinuclé synthétisant et sécrétant des hormones
telles la «human placental lactogen» (hPL), la gonadotropine chorionique (hCG) ainsi
que des hormones stéroïdes (Figure 1.5). Ces changements in vitro, qui récapitulent
adéquatement d'importantes activités accomplies par les cellules cytotrophoblastiques
normales durant la maturation in vivo, impliquent une relation critique et essentielle entre
la différenciation du cytotrophoblaste en syncytiotrophoblaste et l'induction de la hPL, de
la hCG ainsi que de nombreuses autres hormones placentaires (Hoshina et al., 1984; lia
et al., , 1991).
28
~\0
@
Jovr2
JovrO
Jovr~
hPl
hCGp
hCGa
Jovr
0
2
3
-fi
Figure 1.7 Expression des ARNm de l'hormone lactogène placentaire (hPL), de
hCGc:r et de hCGI3 durant la différenciation in vitro des cellules humaines
cytotrophoblastiques. Au jour l, les cytotrophoblastes isolés commencent à s'agréger. Au jour 2,
plusieurs cellules ont fusiOlmées et commencent à former un syncytium; au jour 4, la syncytialisation
est pratiquement complétée. Les niveaux d'ARNm des HPL, hCGlY, and hCGB ont été determines par
analyse Northem blot. [Adaptée de Richards et al., 1994].
CHAPITRE II
ARTICLE SCIENTIFIQUE
J'ai effectué l'entièreté de cet article, c'est-à-dire: les manipulations, les
expérimentations, la recherche bibliographique ainsi que la rédaction du manuscrit. Les
co-auteurs sont des collaborateurs précieux au projet global de mon laboratoire.
L'article mentionné dans ce mémoire est soumis au journal scientifique Bi%gy of
Reproduction et il s'intitule:
INFLUENCE OF PRE-PREGNANCY MATERNAL UNDERWEIGHT AND
OBESITY ON PLASMA HORMONAL AND LIPID PARAMETERS DURING
PREGNANCY AND THEIR IMPACT ON TROPHOBLAST LINOLEIC ACID
UPTAKE
(Influence de l'obésité et de la maigreur maternelles sur les paramètres
hormonaux et lipidiques durant la grossesse et leurs effets sur le
transport trophoblastique de l'acide linoléique)
A. Gravel l ,2, 1.-C. Forese, Y. Giguère3 , A. Masse4 and 1. Lafond l ,2,5.
lLaboratoire de Physiologie materno-fœtale, Département des Sciences Biologiques,
Université du Québec à Montréal, Montréal, Québec, Canada, H3C 3P8. 2Centre de
recherche Biomed, Université du Québec à Montréal, Montréal, Québec, Canada,
H3C 3P8. 3Hôpital St-François d'Assise, Québec, Canada. 4CHUM-St-Luc, Montréal,
Canada.
30
INFLUENCE
OF
PREPREGNANCY
MATERNAL
UNDERWEIGHT AND OBESITY ON PLASMA PARAMETERS
DURING
PREGNANCY
AND
THEIR
IMPACT
ON
TROPHOBLAST LINOLEIC ACID UPTAKE
A. Gravel i ,2, 1.-c. Foresr3, Y. Giguère 3, A. Masse4 and 1. Lafond i ,2,5.
1Laboratoire
de Physiologie materno-fœtale, Département des Sciences Biologiques,
Université du Québec à Montréal, Montréal, Québec, Canada, H3C 3P8. 2Centre de
recherche Biomed, Université du Québec à Montréal, Montréal, Québec, Canada, H3C
3P8. 3Hôpital St-François d'Assise, Québec, Canada. 4CHUM-St-Luc, Montréal, Canada.
Running title: EfJect of underweight and obesity during pregnancy on maternai and
newborn plasma parameters and ils influence on placental fatty acid transport
5To whom correspondence should be addressed:
Julie Lafond PhD ; Laboratoire de Physiologie Materno-Fœtale
Université du Québec à Montréal, Centre de Recherche BioMed
c.P. 8888, Succursale Centre-ville; Montréal, Canada H3C 3P8
Phone: (514) 9873000 ext 7857; Fax: (514) 987 4647
Email: [email protected]
Key words: Placenta, linoleic acid transport, trophoblast, underweight, obesity, insulin
resistance
* Abbreviations: BMI, body mass index; AFP, alpha-fetoprotein; T3, triiodothyronine;
T4, thyroxine; TSH, thyroid stimulating hormone; LA, linoleic acid; DMEM-HG,
Dulbecco modified Eagle medium high glucose; PSN, penicillin, streptomycin,
neomycin; HBSS, Hanks balanced salt solution; FFA, free fatty acid; BSA, bovine serum
albumin; BCA, bicinchoninic acid; HDL, high density lipoprotein; LDL, low density
lipoprotein; TG, triglycerides; FBS, fetal bovine serum; PBS, phosphate buffered saline;
FA, fatty acid; ApoB 100, apolipoprotein BIaO; ApoA l, apolipoprotein AI; hCG, human
chorionic gonadotropin; LPL, lipoprotein lipase.
31
ABSTRACT
Acute prevalence of overweight and obese woman in age of being pregnant is a public
health issue that should be addressed. Studies have shown that either low or high
maternai weight can influence newborn weight and health but also long term overall
health of the chi Id. Fetal fat accretion occurs du ring the last trimester of pregnancy. The
availability of fatty acids for the fetus depends not only on the maternai dietary
contribution through the placental transport but also on the placental function itself, and
on the numerous physiological and biochemical adaptations that take place during
pregnancy. To address this issue, trophoblast cells were isolated from placenta of pre­
pregnancy underweight (BMI < 20 kg/m 2), nonnal weight (20 kg/m 2 < BMI < 26 kg/m 2 )
and obese (BMI > 30 kg/m 2) women participating to a project of our Laboratory. Linoleic
acid transport studies were then carried in cytotrophobJasts and syncytiotrophoblasts.
This transport was furthennore correlated to maternai second and third trimester, and
fetal plasmatic honnonal and lipid profiles. This study shows that syncytiotrophoblast
linoleic acid transport was diminished in pre-pregnancy underweight and obesity. AIso,
syncytiotrophoblast cells were more influenced by extreme weight than their
undifferentiated counterparts. Furthennore, pre-pregnancy obesity was correlated with an
augmentation of second and third trimester insulin and triglycerides plasma concentration
and to a diminution ofTSH and AFP concentrations in mothers. Likewise, pre-pregnancy
underweight diminished third trimester and newborn AFP and T3 levels. Those important
alterations in honnonal levels seen in underweight and obese pregnancies could impede
on the placental uptake of the linoleic acid, an essential fattyacid.
32
INTRODUCTION
Today, cardiovascular diseases are the number one cause of death in industrial countries.
Without a doubt, the most important and preponderant risk factor of these diseases is
obesity. In rich countries, between 20 and 30% of the population is obese. Obesity
corresponds both epidemiologically and anthropometrically to a body mass index (BMI)
superior to 30 kg/m 2 (World Health Organization, 2000). More than 50% of Canadian
women and more than 60% of American women are overweight, their BMI being
superior to 26 kg/m 2 • Acute prevalence of overweight and obese woman in age of being
pregnant is a public health issue that should be addressed.
American data revealed that 26% of women between 20 and 39 years old are
overweight (BMI between 25 and 30 Kg/m 2) and 29% of them are obese (BMI > 30
Kg/m 2) [1]. Overweight women are more 1ikely to be subjected to chronic health issues
such as cardiovascuIar diseases [2], diabetes, infertility problems and menstrual
irregularities [3,4]. A maternaI prepregnant overweight can cause significative increases
offetal adiposity [5-10] early onset ofmetabolic disorders such as type II diabetes [11]
and risk offetal malformations [12].
Although the prevalence of overweight women is increasing in most countries,
the proportion of underweight women stays the same or increases, and the proportion of
underweight adult in Canada is approximately 2% (Statistics Canada, 1998), but women
are actually more likely than men to be underweight. There seems to be an association
between maternai prepregnant underweight and the risk of a spontaneous abortion [13].
Prepregnant underweight is also likely to cause newborn thinness and numerous studies
have shown inverse relation between birth weight and the risk of developing
cardiovascular disease and abnormal lipid metabolism (Syndrome X) in the adult life
(The Barker hypothesis) [14-16]. In sum, if maternai weight is too low [17, 18] or too
high [19], newborn weight is infiuenced and its health can be compromised.
33
Fatty acids, and essentials fatty acids in particular, are crucial for embryo and
fetal development [20-23]. The availability of fatty acids for the fetus depends not only
on the maternai dietary contribution through the placental transport but also on the
placental function itself, and on the numerous physiological and biochemical adaptations
that take place du ring pregnancy [24]. The lipid deposition in human fetus increases
exponentially with gestational age, reaching an accretion rate of about 7g/day before term
[25]. This augmentation is correlated with an increase of syncytiotrophoblast percentage
in the human placenta during the third trimester of pregnancy [26]. The placental fatty
acid transport is likely to be the target of important maternai and fetal regulation due to
its preponderant contribution in the weight control of the newborn by either promoting or
limiting fatty acid transfer to the fetus [27]. It is the placental trophoblast cells that are
regulating the fatty acid transport in a directional way from maternai circulation towards
fetal circulation and vice-versa (reviewed in [28]).
A number of transversal studies have shown relations between prepregnant
weight and later onset of pregnancy problems or fetal and newborn problems, but no
study as yet looked at the mechanisms by which these problems take place in relation to
the maternaI BM! or maternai and fetal lipid (such as fatty acids, triglycerides,
lipoproteins) levels and hormone (such as insulin and thyroid hormones) profiles. Ali
these plasma parameters can play raies in fetal in utero programming. Programming is an
epigenetic phenomenon by which nutritional, hormonal, physical, psychological and
other stressful events acting in a critical period of life, such as pregnancy, modifies in a
prolonged way certain physiological functions [29].
34
Based on this information, we hypothesized that maternaI prepregnancy BMI
influences placental fatty acid transport. We also surmised that lipid and hormonal profile
of mother during pregnancy and of newborn impacted the placental fatty acid transport in
a programming manner. To test these hypotheses, we measured the cytotrophoblasts and
syncytiotrophoblasts linoleic acid transport in placentas of underweight, normal and
obese women participating in a project of our laboratory. Interestingly, we found that
trophoblast cells purified from placentas ofboth underweight and obese women showed a
significant diminution of linoleic acid transport and that this diminution can be related to
augmented pregnancy insulin Jevels in obese women and to diminished pregnancy T3
Jevels in underweight women.
35
MATERIALS AND METHODS
Materials- Dulbecco modified Eagle medium (high glucose) (DMEM-HG), calf serum,
and PSN (penicillin, streptomycin, neomycin) were purchased from
Invitrogen
(Burlington, ON, Canada). Hanks balanced salt solution (HBSS), trypsin, DNAse,
PercolI, and Linoleic Acid (LA) were from Sigma (Oakville, ON, Canada). Free Fatty
Acids (FFA) dosage kit was from Roche Applied Science (Laval, QC, Canada). Bovine
serum albumin (BSA)(defatted) was purchased from MP Biomedicals (Aurora, OH,
USA). Radiolabeled [1_14C] LA was from GE Healthcare (Baie d'Urfée, QC, Canada).
Bicinchoninic acid (BCA) reagent was purchased from Pierce (BrockviIle, ON,
Canada).The 24-well plates were obtained from Sarstedt (Montreal, QC, Canada).
Subjects- This study was carried on 148 women participating to a project of our
laboratory and those women were selected from St-Luc Hospital of the CHUM in
Montreal, Quebec, Canada, before their tenth week of pregnancy. Of those women,
placentas of five underweight (BMI < 20 Kglm 2), three normal weight (20<BMI<26) and
seven obese (BMI>30) women were used for the trophoblast isolation and linoleic acid
uptake. Ail participating women were considered healthy (except for obesity). Data
conceming age, weight, height, smoking status were collected. Women enrolled in this
study were informed of project modalities and signed a writing consent. Antenatal
foIlow-up was made to get blood samples from each trimester, the last sample being at
the delivery day, and from the venous cord blood at the delivery. Post natal follow-up
was then made to monitor the weight gain of the mother and to assess newborn health
status as weil as collecting data relative to the weight and height, and the subcutaneous
fat of the baby.
Lipid, protein, and hormonal dosages- The cholesterol (total cholesterol and esterified
cholesterol in HDL and in LDL), triglyceride, insulin and glucose dosages were realized
with commercial dosage kit from Roche Diagnostics according to manufacturer
36
indications. Total plasma fatty acids were measured by gas phase chromatography.
Plasma insu lin and alphafetoprotein (AFP) were measured by an automatic enzymatic­
immunological method using an Elecsys automate from Roche Diagnostics while plasma
album in was analysed bya Hitachi 717 device by Roche Canada.
Human placental cytotrophoblast cells isolation- Cytotrophoblast cells were isolated
from human term placentas according to the procedure of KI iman et al. [30]. Human term
placenta from underweight (BMI<20 kg/m 2), normal weight (20 kg/m 2 <BMI<26 kg/m 2 )
and obese (BMI>30 kg/m 2) women from 38 to 41 weeks gestation were obtained
immediately after spontaneous vaginal delivery, in accordance with established
guidelines of the ethical committee of CHUM Hôpital St-Luc (QC, Canada) and of
Université du Québec à Montréal (QC, Canada). Immediately after delivery, placentas
were immersed in DMEM-HG containing antibiotics (0.12 mg/ml penicillin, 511g/ml
amphoterycin and 50 llg/ml gentamycin). Briet1y, fetal membranes and maternaI
deciduas were removed; villous tissue was cut into approximately 1 inch cubes and
washed extensively with NaCI (0.9%) to remove blood cells. The tissue was minced and
incubated four times in a digestion medium composed of HBSS containing 0.1 mM
CaCb, 0.8 mM MgCb, 1.5 mg/ml trypsin and 0.2 mg/ml DNAse at 37°C for 30 min.
After each incubations, the supernatant was collected and replaced by fresh digestion
medium. The supernatant of the first digestion was discarded, the followings were kept
and layered onto calf serum and centrifuged at 1215 X g for 15 min. Pellets were pooled
and suspended in DMEM-HG containing PSN (2 X), deposited on top of a discontinuous
5-70% (v/v) Percoll gradient, and centrifuged at 507 x g for 25 min. Layers containing
cytotrophoblast cells were collected and washed in DMEM-HG containing PSN (2 X).
Finally, cells were seeded at a density of approximately lA x 106 cells/well in a 24-well
plate. The culture medium, constituted of DMEM-HG, 2mM glutamine, 10% FBS and
PSN, was refreshed daily. Cells were cultivated for four days. At day four, cells were
considered as syncytiotrophoblasts following their levels of hCG secretion according to
the results obtained by KI iman et al. and by many other experimentations of our
laboratory.
37
Preparation of radiolabeled LA- LA was coupled with defatted BSA for introduction to
cells as described in Cambell et al. [31]. Typically, 14C_LA was evaporated under N 2 and
dissolved in 50 JlI of 0.1
M NaOH. Thereafter, appropriate quantities of the
corresponding unlabeled LA were added in order to achieve the desired final
concentrations (200 JlM). Defatted BSA dissolved in PBS was added to obtain the
desired FAIBSA molar ratios (1:1), the pH was adjusted to 7.4 and the FAIBSA solution
was diluted to its final concentration with PBS.
LA uptake studies- Radiolabeled LA uptake studies were performed on trophoblast cells
after 1 or 4 days of culture according to the method described by Campbell et al. [31].
Briefly, culture medium was removed and cells were washed twice with 0.5 ml PBS at
37°C. Both cells and radiolabeled LA solution were brought to 37 oC by incubation in a
water bath. The cells were then incubated with 250JlI radiolabeled LA solution at 37°C
for different time laps. The uptake was stopped by the addition of 1 ml ice-cold 0.5%
BSA/PBS, and cells were washed three times with the same solution and twice with 0.9%
NaCJ to remove any surface-bound FA. The cells were solubiJized by the addition of 0.5
ml NaOH (0.5 M) and left ovemight at 4°C. The cell-associated radioactivity was
measured by
~-scintillation.
The cellular protein content of each weil was evaluated by
spectrophotometric quantification using the micro-BCA reagent with BSA as standard.
STATISTICAL ANALYSIS
Data were analysed with PRISM 3.0 and Student T-test, ANOVA and Bartlett's test were
performed to assess statistical significance. Dosage results are expressed as values ± SE
and transport resuJts are expressed as values ± SEM.
38
RESULTS
As shown in Table 1, 148 women used for this project were separated in four groups:
underweight n=29 (BMI<20), normal weight n=87 (20<BMI<26), overweight n=20
(26<BMI<30) and obese n=12 (BMI>30) women. Ail groups were significantly different
for their prepregnant BMI but had similar weight gain (Table 1). Women were
comparable in age and gestational age. Within these groups, five underweight, three
normal weight and seven obese women were used for placental fatty acid uptake studies
(the overweight group was not retained for the uptake studies because of pratical
reasons). Their characteristics are shown in Table 2, and are representative of the total
subjects' characteristics as for their prepregnant BMI, weight gain, age and gestational
age. For the purpose of this study, comparisons will be made between findings on those
15 women and lipid and hormonal profile of the total subjects (n=148).
Second and third trimester hormonal profile such as insulin, glucose, thyroid stimulating
hormone (TSH), triiodothyronine (T3), thyroxine (T4), albumin and AFP and lipid
profile are depicted respectively in Tables 3 and 4. Hypertriglyceridemia and
hyperinsulinemia were observed in obese women (Tables 3 and 4). Consequently, in
obese women, a 75% increase in the second trimester and a 200% increase in the third
compared to the normal weight group were noted for insulin concentration (Tables 3 and
4). Interestingly, the third trimester insulin profile seems to augment gradually following
the augmentation of the BMI (Table 4). Concomitantly, the augmentation in maternai
triglycerides concentration at second and third trimesters follows the increasing BMI.
Triglyceride concentration was augrnented by 135% in third trimester plasma of obese
women in comparison with concentration in plasma of normal weight women (Table 3).
Conversely, the direct impeder on fatty acid transport in other tissue, the FFA
concentration, was not influenced by change in BMI. Glucose concentration was
significantly different between underweight and obese women at second trimester and
also seems to increase with increasing BMI (Table 3). However, third trimester glucose
concentration and newbom glucose concentration were not affected by the increasing
BMI (Tables 4 and 5).
39
MaternaI and fetal thyroid functions were assessed by measuring T3, T4 and TSH
concentrations. Whilst second (Table 3) and third (Table 4) trimester T4 profile was the
same in ail women, T3 and TSH concentration were influenced by the BMI. T3 was
slightly (by ;:::;10%) diminished by underweight in second trimester (Table 3) and in
newborn plasma (Table 5) but was augmented by overweight (;:::;120%) and by obesity
(;:::;125%). An important diminution (;:::;40%) of TSH concentration was seen in plasma
from second (Table 3) and third (Table 4) trimesters and in newborn plasma of obese
women compared to ail other weight group.
Concentrations of plasma transport proteins important for placental transport such as
albumin and AFP were also measured. Maternai AFP concentration is influenced by
underweight and obesity. In fact, there was a 30% reduction in AFP concentration
between underweight and obese women at second trimesters (Table 3). We also noted a
trend for diminution (;:::;15%) in plasma AFP concentration of newborns (Table 5) from
overweight women as weIl as AFP plasma levels of newborns from obese women (data
not shown because of not enough AFP concentrations values were recovered to conduct a
statistical analysis). In underweight women, third trimester AFP plasma concentration
falls of 40% (Table 4) and newborn AFP plasma concentration was reduced by 20%
when compared to concentrations measured in normal weight women or newborn from
normal weight women (Table 5). Furthermore, there is a 50% diminution between second
trimester (Table 3) AFP levels and third trimesters (Table 4) levels in underweight
women compare to a 20% diminution in normal weight women. While AFP
concentrations obviously changed within BMI, albumin concentration profiles did not
change within changing BMIs.
Neither total cholesterol, nor LDL nor ApoB 100 concentrations were affected by the
BMI in those pregnant women and their newborns. However, inverse cholesterol
transport was altered with the augmentation in BMI as shown by the 20% diminution of
both HDL and ApoA 1 plasmatic concentrations (Table 3).
40
Influence of underweight and obesity on in vitro cytotrophoblast and syncytiotrophoblast
linoleic acid transport kinetics may be visualized in figures 1 and 2. Cytotrophoblast cel1s
fatty acid transport is not as influenced by maternai weight as the syncytiotrophoblast cell
transport (Fig. 3). In fact, only the syncytiotrophoblast linoleic acid transport curve was
globally lowered by either underweight (BMI < 20 kg/m 2) (Fig. 3B) or obesity (BMI > 30
kg/m 2 ) (Fig. 3C). As depicted in figure 2 inset, initial rate of transport ( 1 minute) was
much more higher in the placentas from normal weight women than in the placentas from
either underweight or obese women.
41
DISCUSSION
In this study, we found that underweight and obese women showed a diminution of their
in vitro linoleic acid trophoblastic transport compare to normal weight women and we
also found that this diminution is related to different mechanisms in underweight and
obese. Furthermore, in both underweight and obese women, the syncytiotrophoblast cells
showed a lower transport rate than syncytiotrophoblast cells of normal weight women.
To explain these findings we investigated the lipid and hormonal profiles ofthose women
and of other women with same pregnancy conditions showed by their equivalent pre­
pregnancy SMI, pregnancy weight gain, and age and pregnancy length. We found that
the plasma insulin and triglycerides concentration were greatly increased but that HDL
concentration was diminished by obesity during pregnancy. These latter results on
triglycerides and HDL concentration are in accordance with previous study on serum
lipids during pregnancy [32]. We also found a diminution of the T3 and the AFP
concentrations in underweight women. We believe that high insulin and triglycerides
profiles during pregnancy lead to an alteration of essential fatty acid transport function of
trophoblast cells in obese women. We also believe that a different mechanism explain the
similar diminution in fatty acid transport in underweight women, mechanism that imply
low levels ofT3 levels and important third trimester decreased in AFP levels. Those low
levels might have lead to an alteration of the placental transport function.
Obesity causes insulin resistance [33-35]. In pregnancy, triglycerides rise because of an
increase in maternaI fat deposition during the early part of pregnancy and because of
increased plasma levels of lipolytic gestational hormones [36]. The resulting insulin
resistance of the mother preserves carbohydrates for the growing fetus. In obesity,
however, the FFA-induced insulin resistance is counterproductive because there is no
need to spare glucose. High insulin levels during the course of the second and third
trimesters may have led to at term insulin resistant trophoblast cells in such a way that, at
term, trophoblast cells showed a lower fatty acid uptake. In hypothyroidism,
characterized by high TSH levels, the elevation of triglycerides is caused by a reduced
removal rate of triglyceride from plasma due to a decrease in the activity of hepatic
42
triglyceride lipase (LPL) [37-39]. In this study however, high triglyceride levels are
present even with a strong TSH diminution. This latter result can be explained by the fact
the normal regulation of fatty acid metabolism by insulin does not take place in the
trophoblast, a peripheral tissue. The LPL activity is either very low or deficient and the
already non-esterified fatty acids are taken first by the trophoblast because of the insul in
resistance which resulted in fatty acid metabolism malfunction.
In this study, during the course of pregnancy in underweight women, T3 levels are
constantly lower than normal weight women T3 levels. Similarly, low levels of T3 are
also found in very low body mass index non-pregnant women such as patients with
anorexia nervosa [40]. During normal pregnancy, euthyroid women experience dramatic
changes in their thyroid physiology in order to accommodate the presence of placental
and fetal tissues [41]. These adaptations to the pregnant state make it crucial to develop
reliable trimester-specific intervals for thyroid parameters. The T3 is the active ligand for
thyroid hormone receptor [42], so its concentration in plasma can influence tissues that
expressed its receptor. Trophoblast cells express the thyroid hormone receptor. Thyroid
hormone receptors and iodothyronine deiodinases are present in the placenta and the fetal
central nervous system early in pregnancy, and thyroid hormone plays a crucial role both
in trophoblast function and fetal neurodevelopment [43]. During pregnancy, elevated
human chorionic gonadotropin (hCG) levels cross-react with the thyroid hormone
receptor [44]. The low T3 condition seen in underweight pregnancy combined with the
high hCG levels could lead to a diminution of fatty acid transport in cells du ring
pregnancy, because T3 is known to be a fatty acid synthesis, degradation and storage
regulator in lipogenic tissues [45]. The T3 also regulates cholesterol and lipoprotein
metabolism in the liver [46]. Interestingly, T3 is known to be transported by fatty acid
carriers such as FAT [47]. It is also known that T3 exerts a prepotent effect on gene
expression in human adipose tissue [48]. T3 and insulin are known to promote human
adipocyte differentiation [49] and de nova growth hormone synthesis [50]. In the human
placenta, T3 has been noted to stimulate production of 17[3 estradiol and epidermal
growth factor [51], indicating a possible role for T3 in the control of trophoblast growth
43
and development. These pieces of evidence may bring an explanation why the
syncytiotrophoblast cells of underweight women showed a decrease in fatty acid
transport.
In this study, during underweight and obese pregnancy, there is also a reduction in AFP
levels. AFP is a glycoprotein produced during fetal development. The normal
physiological role of AFP is not known but various functions have been postulated
including ligand binding and transport, regulation of growth and the immune system and
a role as an antioxidant [52, 53], indicating its potential significance for the growth and
development of a healthy fetus. In early pregnancy, AFP is synthesised primarily by the
yolk sac and, as pregnancy advances, the fetal liver becomes the principal site of AFP
synthesis [54, 55]. Low levels of synthesis have also been reported in the fetal
gastrointestinal tract and kidney [55]. Circulating levels of AFP in the fetus increase to a
peak at approximately 13 weeks of gestation and then decrease to term. AFP is thought to
reach the maternaI circulation primarily from the fetal circulation across the placenta and
from the amniotic fluid across the fetal membranes and decidua [56]. MaternaI serum
AFP levels are therefore sensitive to changes in the expression of AFP and to changes in
fetal serum and/or amniotic fluid levels of AFP. Furthermore, because of the absence of
de novo synthesis of AFP at term, AFP protein present in the placenta at term must be
derived from extracellular sources. This presence in the placenta at term presumably
reflects placental transport of AFP between the fetal and maternaI circulations [57].
According to this information, the diminution of AFP seen in plasma of underweight and
obese mothers is a consequence of the diminution of transport from the fetal circulation
across the placenta to the maternai circulation.
Moreover, besides acting as a fatty acid binding prote in/carrier, AFP may participate in
metabolic regulatory processes in fetal tissues such as fetal liver [58]. Its decrease might
play a role in the diminution of fatty acid transport in both underweight and obese
women. AIso, recent findings showed that AFP prevent's hepatocyte differentiation by
promoting fetal hepatocyte growth via insulin transduction [59, 60]. AFP could also
44
promote growth at the expense of differentiation of other type of cells such as
trophoblasts since early pregnancy trophoblasts themselves produced AFP [61]. Low
levels of AFP at term could by itself explain the lower fatty acid uptake by the
trophoblast cells since AFP is a strong fatty acid binding protein in fetal circulation as
weil as in the periphery of the placenta on the maternai side.
In conclusion, maternai prepregnancy underweight and obesity diminished in vitro
linoleic acid uptake by syncytiotrophoblast cells. ln syncytiotrophoblasts, the linoleic
acid uptake could be diminished by long term in utero exposition to hormonal and lipid
alterations seen in those underweight and obese women. ln obese women this diminution
in uptake might be explained by the long term exposition of high insulin levels together
with a significant rise in TG concentration in the second and third trimester maternai
plasma. The low levels of TSH might also have played an indirect role. In underweight
women the diminished uptake can be explained by the low T3 conditions during the
course of the pregnancy, which could have impeded on the overall placental transport
function. Furthermore, low maternaI levels of AFP seen in both obese and underweight
pregnancy compared to normal weight pregnancy could be an indicator of a poor
placental transport function, since the AFP levels seen at term reflect the ability of the
placenta to transport the AFP.
45
FIGURE LEGEND
Figure 1: Influence of underweight (BMI < 20 kg/m2) and obesity (BMI> 30 kg/m2)
on in vitro cytotrophoblast linoleic acid transport kinetics. Cytotrophoblast cells were
isolated from human term placenta from underweight (BMI < 20 kg/m 2) (light grey
squares), normal weight (20 kg/m 2 < BMI < 26 kg/m 2) (dark grey triangles) and obese
(BMI > 30 kg/m 2) (black inverted triangles) women and then incubated for different
periods of time at day one of culture with 250111 of radiolabeled LA solution at 37°C as
described under material and methods. Points on the graph represent the amount of
linoleic acid transported at a certain time; results showed are from 5 placentas from BMI
< 20 kg/m 2 women, 3 placentas from normal BMI women, and 7 placentas from BMI >
30 kg/m 2 women; bars indicate standard error of the mean (SEM).
Figure 2: Influence of underweight (BMI < 20 kg/m2) and obesity (BMI> 30 kg/m2)
on in vitro syncytiotrophoblast linoleic acid transport kinetics. Syncytiotrophoblasts
were differenciated (trophoblasts at day 4 of culture) from cytotrophoblast cells isolated
from human term placenta from underweight (BMI < 20 kg/m 2) (Iight grey squares),
normal weight (20 kg/m 2 < BMI < 26 kg/m 2) (dark grey triangles) and obese (BMI > 30
kg/m 2) (black inverted triangles) women and then incubated for different periods of time
at day four of culture with 250111 of radiolabeled LA solution at 37°C as described under
material and methods. Points on the graph represent the amount of linoleic acid
transported at a certain time; results showed are from 5 placentas from BMI < 20 kg/m 2
women, 3 placentas from normal BMI women, and 7 placentas from BMI > 30 kg/m 2
women; bars indicate standard error of the mean (SEM);
ANOVA, Dunnett's multiple comparisons Test.
***
p<O.OOO I, One-way
46
Figure 3: DifferentiaI influences of underweight and obesity on cytotrophoblast and
syncytiotrophoblast linoleic acid transport kinetics. A) Cyto- and syncytio- trophoblast
transport in placentas of normal weight women, B) Cyto- and syncytio- trophoblast
transport in placentas of underweight women, and C) Cyto- and syncytio- trophoblast
transport in placentas of obese women. Points on the graph represent the amount of
linoleic acid transported at a certain time; results showed are from S placentas from
BMI<20 women, 3 placentas from normal BMI women, and 7 placentas from BMI>30
women; bars indicate standard error of the mean (SEM); Panel B)
ANGYA, C)
** p=O.OOS, Two-way ANGYA.
** p<O.OOS, Two-way
47
Table 1. Characteristics concerning number of women in groups, BMI means, weight
gain means, and duration of pregnancy means, of total women (N=148) used for this
study.
Characteristics
Total women
BMI <20
20<BMI<26
26<BMI<30
BMI>30
underweight
normal weight
overweight
obese
n
29
87
20
12
BMI (Kg/m2 )
18.4 ± 0.8
**
22.6 ± 2.3
27.7 ± 1.0
**
36.4 ± 3.8
**
Weight gain (Kg)
13.2 ± 4.6
12.0 ± 5.2
11.3 ± 4.9
8.7 ± 6.8
Age (years)
29±4
32± 5
31 ± 6
29± 4
Pregnancy Iength
(weeks)
39± 2
39± 2
39 ± 1
38± 2
**
Different from normal weight if p<ü.ÜÜS, One-way ANOVA, Tukey's comparisons
Test.
48
Table 2. Characteristics concerning number of women in groups, BMI means, weight
gain means, and duration of pregnancy means, of women used for placental fatty acid
transport (N=I 5).
BMI <20
20<BMI<26
BMI>30
underweight
Normal weight
obese
n
5
3
7
BMI (Kg/m 2 )
18.3 ± 1.1 **
23.5 ± 1.9
35.1±4.2**
Weight gain (Kg)
10.8 ± 4
11.2 ± 4
10.4 ± 3
Age (years)
28 ± 4
31 ± 3
30 ± 4
39 ± 2
39 ± 2
38 ± 2
Characteristics
Transport women
Pregnancy length
(weeks)
**
Different from normal weight p<O.005, One-way ANOVA, Tukey's comparisons
Test.
49
Table 3. Second trimester plasma honnonal (insulin, glucose, T3, T4 and TSH) and lipid
prafiJe of underweight (n= at least 20), normal weight (n= at least 54), overweight (n= at
least 15) and obese women (n=:= at least 7) from total subjects (N= at least 96).
Plasma
parameters
2nd trimester
BMI<20
20<BMI<26
26<BMI<30
BMI>30
Insu lin (pM)
88.58 ± 17.24 a
81.57 ± 7.338 a
133.3 ± 16.08b
142.4± 17.81 b
Triglycerides (mM)
1.866 ± 0.1 oooa
2.003 ± Om08 a
2.137 ± 0.1278 ab
2.679 ± 0.21 lOb
Glucose (mM)
2.886 ± 0.2468<
3.235 ± 0.1431 cd
3.380 ± 0.2980 cd
3.700 ± 0.2895 d
T3 (nM)
2.432 ± 0.1046<
2.729 ± 0.0628 d
3.219 ± 0.1506"
3.413 ± 0.3170"
T4(nM)
J3.04 ± 0.2962 a
12.23 ± 0.2339 b
12.76 ± 0.5 191 ab
13.47 ± 1.420ab
TSH (mIU/L)
2.099 ± 0.2135 ab
2.121 ±0.1504 a
1.827 ± 0.2186 ab
J .525 ± 0.2226 b
Alpha-fetoprotein
(KIUlL)
154.9 ± 9.461<
154.6 ± 11.1 Ocd
119.7± 14.62cd
104.6 ± 7.889 d
Albumin (g/L)
35.73 ± 0.4614
35.95 ± 0.3256
35.80 ± 0.3546
36.29 ± 0.5654
Total Cholesterol (mM)
6.292 ± 0.1907
6.359 ± 0.1249
5.923±0.2314
6.040 ± 0.3575
LDL (mM)
3.516 ± 0.1904
3.553 ± 0.1105
3.244 ± 0.2044
3.298 ± 0.3660
0.0668 d
1.527 ± O.1352 d
HDL (mM)
1.884 ± 0.0571<
1.883 ± 0.0471<
1.689 ±
ApoAl (g/L)
2.077 ± 0.0503 cd
2.072 ± 0.0356<
1.987 ± 0.0570 cd
1.856 ± 0.1222 d
ApoBIOO (g/L)
1.203 ± 0.0541
1.204 ± 0.0307
1.172 ± 0.0621
1.354 ± 0.1667
Results are expressed as mean ± standard error (SE). a different from b (p<ü.ü5), Student
T-Test, c different from d or e (p<ü.ü5), Bartlett Test.
50
Table 4. Third trimester plasma hormonal (insulin, glucose, T3, T4 and TSH) and lipid
profile of underweight (n= at least 20), normal weight (n= at least 64), overweight (n= at
least 16) and obese women (at least 5) from total subjects (N= at least 105)).
Plasma
parameters
3 rd trimester
BMI<20
Insulin (pM)
118.2 ± 20.36
Triglycerides (mM)
2.764 ± 0.2118
20<BMI<26
26<BMI<30
BMI>30
a
172.6 ± 21.46
257.1 ± 59.87 bc
343.1 ± 75.97
ab
3.006± 0.1153
2.954 ± 0.3192
4.065 ± 0.5092
b
a
ab
c
b
Free Fatty Acids (mM)
0.6866 ± 0.0408
0.6288 ± 0,0323
0.6204 ± 0.0479
0.6718± 0.0852
Glucose (mM)
4.392 ± 0.3206
4.680 ± 0.2736
4.587 ± 0.3445
4.386 ± 0.6964
T3(nM)
2.658 ± 0.0911
2.827 ± 0.0620
3.091 ± 0.1959
2.951 ± 0.2326
T4(nM)
12.24 ± 0.3582
Il.93 ± 0.2355
Il. 90 ± 0.4552
12.22 ± 0.9811
TSH (mIU/L)
3.042 ± 0.3624
d
Alpha-fetoprotein
(K1U1L)
75.84 ± 4.569
a
Albumin (glL)
34.64 ± 0.4431
34.75 ± 0.3689
34.94 ± 0.4655
33.86 ± 1.079
Total Cholesterol (mM)
7.162 ± 0.2898
6.773 ± 0.1473
6.345 ± 0.3983
6.270 ± 0.5112
LDL(mM)
4.083 ± 0.2612
3.623 ± 0.1279
3.224 ± 0.2684
3.097 ± 0.5231
HDL(mM)
1.852 ± 0.0728
a
1.766 ± 0.0532
ab
1.731 ± 0.1358
ApoAl (glL)
2.176 ± 0.0524
a
2.150 ± 0.0453
ab
2.118 ± 0.1 115 ab
1.921 ±0.164Sb
1.261 ± 0.791
1.286 ± 0.1744
ApoBlOO (glL)
1.412 ± 0.0595
2.933 ± 0.1708
120.3 ± 8.364
d
b
1.336 ± 0.0341
2.945 ± 0.5711
107.4 ± 17.43
d
ab
ab
1.826 ± 0.3887
89.49± 19.13
e
ab
1.460 ± 0.2533
Results are expressed as mean ± standard error (SE). a different from b or c (p<O.OS)
Student T-Test, d different from e (p<0.05), Bartlett Test.
b
51
Table 5. Newbom plasma hormonal (insulin, glucose, T3, T4 and TSH), lipid and fatty
acid carriers profiles of underweight (n= at least ]4), normal weight (n= at least 53),
overweight (n= at least Il) and obese women (n= at least 4) from total subjects (N= at
least 82)).
MaternaI
BMI<20
MaternaI
20<BMI<26
MaternaI
26<BMI<30
MaternaI
BMI>30
Insulin (pM)
59.58 ± 7.377
63.13 ± 6.186
63.53 ± 7.384
n.a.
Triglycerides (mM)
0.5524 ± 0.0566
0.5747 ± 0.0353
0.4993 ± 0.0356
0.5050 ± 0.0746
Plasma
parameters
Newborn
Free Fatty Acids (mM)
0.1222±0.0091
a
0.1457±0.0101
b
Glucose (mM)
5.076 ± 0.4066
4.808 ± 0.2670
T3 (nM)
1.020 ± 0.0346 a
1.127 ± 0.0332
T4 (nM)
12.24 ± 0.3582
11.93 ± 0.2355
TSH (m1U/L)
11.23 ± 1.626
ab
Il.53 ± 0.9234
Alpha-fetoprotein
(KIUlL)
39092 ± 3254
a
48233 ± 3244
0.1352 ± 0.0123
ab
4.579 ± 0.5061
b
1.139 ± 0.0681
b
ab
4.550 ± 0.7288
ab
Il.90 ± 0.4552
a
0.1537 ± 0.0337
11.72 ± 2.314
ab
40648 ± 4494
ab
0.9460 ± 0.0920 ab
12.22 ± 0.9811
6.708 ± 0.2707
b
n.a.
Albumin (glL)
37.60 ± 0.6245
38.24 ± 0.4677
37.93 ± 0.9231
34.80 ± 1.241
Total Cholesterol (mM)
7.162 ± 0.2898
6.773 ± 0.1473
6.345 ± 0.3983
6.270 ± 0.5112
LDL(mM)
0.7620 ± 0.0583
0.7436 ± 0.0316
0.6573 ± 0404
0.6583 ± 0.13 12
HDL(mM)
0.6756 ± 0.0382
0.7519±0.0283
0.7113 ± 0.0872
0.8533 ± 0.2102
ApoAI (gIL)
2.176 ± 0.0524
2.150 ± 0.0453
2. 118 ± 0.1 115 ab
1.921 ± 0.1648
ApoBIOO (glL)
0.2764 ± 0.0220
0.2293 ± 0.0244
0.2050 ± 0.0492
a
ab
0.2679 ± 0.0121
b
Results are expressed as mean ± standard error (SE). a different from b (p<O.05), Student
T-Test.
52
Table 6. Summary of the effect of underweight, overweight and obesity on plasma
parameters
Plasma parameters
Underweight
2 nd
3 nd
NB
~
Insulin
Overweight
2 nd
3 nd
2 nd
3 nd
NB
=
7171
7171
n.a.
=
71
71
=
n.a.
=
r
=
71
=
=
=
=
=
=
~
~
~
=
..
~
..
n.a.
71
Triglycerides
Free Fatty Acids
n.a.
Glucose
..
T3
~
T4
71
.
..
~
TSH
Alpha-fetoprotein
~
~
n.a.
71
NB
r
=
Albumin
Total Cholesterol
Obese
=
LDL
=
HOL
~
.l.
ApoAl
~
..
ApoBlOO
..
=
Equal signs indicate no observed difference, solid arrows (~ or ") indicate a significant
augmentation or diminution, dotted line arrows (r or l) indicate a tendency towards
augmentation or diminution, n.a. = not available.
53
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57
Figure 1.
3
~
__
.L
1
O~-----.-----.---...,.------.-----,
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Tlme (min)
15
SMI < 20
• 20 < SM 1< 26
T
SMI> 30
o­
"---:----'
0.0
2.5
5.0
7.5
lime (min)
10.0
12.5
58
Figure 2.
3
-
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1
l
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0.50
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1.00
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lime (min)
15
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BM 1< 20
20 < BM 1< 26
BM 1> 30
7.5
lime (min)
10.0
12.5
Figure 3.
59
A)
-
15
• Cytotrophoblasts
• Syncytiotrophoblasts
c
t - ëii
o~]
Q.llCI Q.
10
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ccC)
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B)
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Time (min)
C)
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2.5
0.0
5.0
7.5
10.0
12.5
Time (min)
CHAPITRE III
CONCLUSION
En guise de conclusion, il est possible d'affirmer qu'un IMC pré-grossesse hors norme,
soit inférieur à 20 kg/m 2 ou supérieur à 30 kg/m 2, diminue le transport in vitro de l'acide
linoléique dans les cellules trophoblastiques, les syncytiotrophoblastes, lorsque comparés
au transport syncytiotrophoblastique dans le placenta d'une femme d'IMC normal avant
la grossesse. Dans ces cellules matures, le transport semble être diminué par une
exposition in utero prolongée à des profils maternels hormonaux et lipidiques anormaux.
Ainsi, chez les femmes obèses (IMC>30), cette diminution pourrait être expliquée par
une exposition prolongée à des niveaux maternels anormalement élevés d'insuline et de
triglycérides lors du deuxième et du troisième tiers de la grossesse. Aussi, l'exposition à
de faibles niveaux de TSH pourrait jouer un rôle indirect. Chez les femmes présentant un
IMC pré-grossesse faible (inférieur à 20 kg/m 2), la diminution du taux de transport de
l'acide linoléique dans les syncytiotrophoblastes pourrait être imputable aux faibles
niveaux de T3 maternels durant le deuxième et le troisième tiers de la grossesse. Ces
faibles niveaux de T3 pourraient avoir eu un impact négatif sur la fonction placentaire
globale.
De plus, les faibles concentrations maternelles d'AFP, mesurées à terme chez les femmes
obèses et les femmes de faibles poids, pourraient être un marqueur d'une fonction
placentaire déficiente, étant donnée que la quantité d'AFP maternel à terme reflète le
transport placentaire de l'AFP. Les deux figures suivantes illustrent les explications
plausibles de la diminution de transport syncytiotrophoblastique de l'acide linoléique
dans les placentas de femmes obèses et de femmes de faibles poids.
61
Obésité pré-grossesse
Réponse des
syncytiotrophoblas tes
à l'insuline ~
'------,
,---'
Transport de l'AL par les
syncytlotrophoblastes ~
Figure 3.1 Schéma montrant les causes possible de la diminution du transport de
l'acide linoléique dans les syncytiotrophoblastes lors d'obésité (IMC>30 kg/m 2) pré­
grossesse maternelle.
MaIgreur pré· grossesse
IMC < 20
T3 plasmatique ~
AFP plasmatique ~
+
D
hCG 71
D
Expression placentaire des
transporteurs d' AG ~
0::::>
liaison des AG
et transport
vers le placenta
T.a",po. de "AL pa"e.
syncytlotrophoblastes ~
~
<:D
Figure 3.2 Schéma montrant les causes possibles de la diminution du transport de
l'acide linoléique dans les syncytiotrophoblastes lors de maigreur (IMC<20 kg/m 2)
pré-grossesse maternelle.
62
Enfin, de façon plus générale, ces résultats réitèrent l'importance, pour les femmes en âge
d'avoir des enfants, de viser ou de conserver un poids santé. En effet, selon cette étude
l'indice de masse corporelle maternel pré-grossesse exerce un effet important sur les
paramètres sanguins lipidiques et hormonaux, et ce, durant toute la durée de la grossesse.
Le profil sanguin maternel influence le profil sanguin fœtal à travers la barrière
placentaire. Les échanges materno-fœtaux sont en fait les fondations d'un fœtus en santé.
Une dysfonction placentaire se révèle délétère pour ces échanges et compromet
grandement la santé globale du fœtus et donc de l'enfant à naître.
CHAPITRE IV
PERSPECTIVES ET RÉSULTATS NON PUBLIÉS
Étant donné le temps alloué pour la réalisation de ces travaux de maîtrise, certaines
manipulations intéressantes ont dues être avortées. En effet, dans le cadre de cette
maîtrise, des manipulations ont été entreprises afin de vérifier: 1) si l'insuline favorise
ou inhibe le transport de l'acide linoléique dans notre modèle cellulaire et 2) la présence
des gènes de protéines impliquées dans le transport des acides gras.
Ainsi, des cytotrophoblastes isolés de placentas de femmes participant à notre projet ont
été soumis à des tests in vitro en utilisant de l'insuline. Les premiers tests ont vérifié si
les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes provenant de placentas de femmes de
poids normal réagissaient à une incubation d'une heure à différentes concentrations
d'insuline.
64
A)
B)
3
-­
.:>f. .....
.:>f. .....
CC
CC
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QI
QI
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0.01
0.1
0.00
10
0.01
0.10
1.00
10.00
[lnsuUn] nM
[lnsuUn] nM
Figure 4.1 Graphiques illustrant l'influence d'une incubation d'une heure avec des
concentrations croissantes d'insuline sur le transport à 3 minutes de l'acide linoléique
dans A) les cytotrophoblastes et dans B) les syncytiotrophoblastes. Ces expériences
ont été effectuées sur deux placentas de femmes de poids normal.
A)
~
c
.
4
:Qi
•
;tQ 3
ta.
o "0Cl>
B) ~
Avec insuline
Sans insuline
2
•
c
•
:Qi
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Sans insuline
Avec insuline
•
ta.
o "0Cl>
~Cl2
~ Cl 1
CE
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"'0
"'0
oS
oS
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E l
E
0
0
2
Temps
3
4
(minutes)
5
6
2
Temps
3
4
5
6
(minutes)
Figure 4.2 Courbe d'incorporation de l'acide linoléique dans des trophoblastes
placentaires après A) 1 jour de culture (cytotrophoblastes) et B) 4 jours de culture
(syncytiotrophoblastes) selon le traitement avec l'insuline. Les trophoblastes étaient
incubés à 37°C avec un ratio de ALiBSA de 1: 1 (200 mM) et incubé a priori avec de
l'insuline 10 nM durant une heure. Ces expériences ont été effectuées sur deux
placentas de femmes de poids normal.
65
Ces résultats (Figures 4.1 et 4.2) suggèrent que les syncytiotrophoblastes ne réagissent
pas de la même façon à la régulation par l'insuline que les cytotrophoblastes. De plus,
selon ces résultats, l'insuline n'influence pas le transport cytotrophoblastique mais
influence plutôt le transport syncytiotrophoblastique de l'acide linoléique sur des femmes
d'IMC normaux. Davantage de manipulations seraient nécessaire afin de vérifier
l'influence réelle de l'insuline sur le transport de l'acide linoléique et afin de valider
l'influence à l'aide de tests statistiques. D'autres expériences sur l'influence de l'insuline
sur des cytotrophoblastes et des syncytiotrophoblastes provenant d'un placenta d'une
femme obèse ont aussi été effectuées (résultats non montrés).
En outre, la présence des différentes protéines de transport des acides gras dans le tissu
placentaire total puis dans les cellules cytotrophoblastiques et syncytiotrophoblastiques a
été visualisée en extrayant l'ARNm du tissu placentaire ou des cellules, puis en
effectuant une retrotranscription suivie d'une amplification de séquences codantes des
gènes de protéines de transport des acides gras par PCR et enfin une migration des
produits de PCR dans gel d'agarose pour visualisation.
FATP-l
FAT/CD36
CAV l
CAV2
CAV 3
ADRP
FATP-2
FATP-3
FATP-4
FATP-S
FATP-6
Figure 4.3 Présence des transcrits de gènes de différentes protéines de transport des
acides gras (FAT/CD36, CAVI, 2, 3, ADRP et FATP 1 à 6) dans le placenta total.
L'ARNm a été extrait du tissu placentaire à J'aide de la trousse RNeasy de QIAGEN puis une RT-PCR
a été effectuée.
66
FATP-2
FATP-4
Pla 1 Cyta
Pla 1 Cyta
Syne
Syne
Pla 2 Cyta
Pla 2 Cyta
Syne
Syne
Adipaphiline
FAT/CD36
Pla 1 Cyta
Pla 1 Cyta
Syne
Syne
Pla 2 Cyta
Pla 2 Cyta
Syne
Syne
Figure 4.4 Présence de transcrits de gènes de différentes protéines de transport des
acides gras (FATP-2 et -4, Adipophiline et FAT/CD36) dans les cytotrophoblastes
(Cyto) et dans les syncytiotrophoblastes (Sync) de deux placentas. L'ARNm a été extrait
des cellules trophoblastiques (Cyto = cellules au jour 1 de culture; Sync = cellules aujour 4 de culture)
à l'aide de la trousse RNeasy de QIAGEN puis une RT-PCR a été effectuée.
Ces résultats (Figures 4.3 et 4.4) démontrent la présence de transcrits de gènes de
différentes protéines impliquées dans le transport des acides gras dans le tissu placentaire
et dans les cellules trophoblastiques. La prochaine étape aurait été de quantifier
l'expression placentaire, en effectuant un PCR en temps réel utilisant le Light Cycler 480
System de Roche avec le système SYBR Green 1 Master, de ces différentes protéines
impliquées dans le transport placentaire de l'acide linoléique en fonction d'un IMC pré­
grossesse hors norme.
De plus, il aurait été appréciable de vérifier l'expression génétique des différentes
protéines
de
transport
des
acides
gras
dans
les
cytotrophoblastes
et
les
syncytiotrophoblastes des placentas utilisés pour le transport de l'acide linoléique. Il
aurait été possible de corréler le transport de l'acide linoléique avec les niveaux
d'expression génétique des différentes protéines de transport. Dans cet optique,
l'extraction de l'ARNm cytotrophoblastique et syncytiotrophoblastique a par ailleurs été
effectuée dans les placentas utilisés pour le transport de l'acide linoléique.
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