Historique - Généralités – Introduction (Chapitre 1)
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Copyright AFECAP 1 Historique - Généralités – Introduction (Chapitre 1) Auteurs : M.C. Rousselet, D. Hénin et P. Josset Mai 2005 Prérequis Programme d’histologie et d’embryologie du premier cycle des études médicales Objectifs : • Savoir expliquer le principe de la démarche diagnostique anatomo-clinique. • Savoir énumérer les différents types de prélèvements soumis à un examen anatomocytopathologique et les moyens pour obtenir ces prélèvements. • Savoir expliquer les principes de prise en charge des prélèvements selon les techniques de base d'un laboratoire d'anatomo-cytopathologie • Connaître le nom et les indications des techniques particulières réalisables sur les cellules et tissus. 1. Historique Malgré des progrès isolés et significatifs depuis la Renaissance, la médecine restait en France, ainsi que dans de nombreux autres pays européens, tributaire de croyances périmées et de systèmes sociaux peu propices au progrès des connaissances médicales. La médecine, jadis réservée aux clercs, continuait à être enseignée à l’Université alors que la chirurgie en avait été écartée pendant des siècles par une Faculté de Médecine intransigeante. → En SAVOIR PLUS sur l'intégraion des chirurgiens et le début de la médecine moderne En 1799, Bichat publia le Traité des membranes. Ce traité qui constitua l’ouvrage fondamental de l’anatomopathologique initia une nouvelle façon de voir l’anatomie. En effet, à côté d’une vision montrant des organes voisins les uns des autres, il proposait une conception de l’homme constitué par des enveloppes successives qui enveloppaient peu à peu les différents organes. Ce modèle se révéla étonnamment utile et permit de prédire de façon satisfaisante l’évolution d’un certain nombre de maladies. En réalité, elle était étroitement dépendante des pathologies couramment observées à l’époque comme la tuberculose. On observait alors très fréquemment des lésions des séreuses pleurales, péritonéales et péricardiques. → EN AVOIR PLUS entre Bichat et Laennec 2 Copyright AFECAP En 1819, Laennec publia son Traité sur l’auscultation médiate (c’est à dire avec un cylindre qui sera le précurseur du stéthoscope). Ces nouvelles méthodes donnèrent des résultats objectifs et fiables pour l’examen des organes internes. Cet ouvrage en principe consacré à la présentation et à la promotion de ce nouvel outil diagnostique comportait une très importante partie consacrée à l’examen post-mortem et à la pathologie macroscopique des tissus. Le lien entre l’auscultation et la percussion d’une part et les autopsies étaient très étroit. En effet, ces nouvelles méthodes d’examen ne trouvaient leur valeur que dans une corrélation étroite avec les autopsies. Tout ceci aboutit vers les années 1830 à la constitution d’un ensemble de connaissances qui se trouva alors brutalement confronté à un nouvel instrument : le microscope ! L’histoire de l’anatomie pathologique est exposée au Musée Dupuytren (Paris) → EN SAVOIR PLUS sur le Musée Dupuytren et l'histoire de l'anatomie pathologique 2. place de l’anatomo-cytopathologie dans la médecine moderne 2.1. La démarche diagnostique L'anatomo-cytopathologie (ou pathologie) est une discipline médicale qui étudie les lésions provoquées par les maladies ou associées à celles-ci, sur les organes, tissus ou cellules, en utilisant des techniques principalement basées sur la morphologie macroscopique et microscopique. Les lésions sont des altérations morphologiques des organes, décelables par tout moyen d'observation. Les lésions sont des signes des maladies, au même titre que les symptômes cliniques. Les lésions peuvent être le résultat de l’agression qui a déclenché la maladie ou celui des réactions apparues au cours du déroulement du processus morbide. La lésion élémentaire correspond à l'altération morphologique d'une structure analysée isolément. L'association de différentes lésions élémentaires constitue un ensemble lésionnel. Il n'y a pas forcément une corrélation étroite entre l'importance d'une lésion et son expression clinique ou biologique. Les causes des lésions sont variées : anomalies génétiques constitutionnelles ou acquises, agents infectieux (bactéries, virus, parasites, champignons prions), agents chimiques (toxiques, caustiques, médicaments) agents physiques (agression thermique, radiations, modifications de pression atmosphérique, traumatismes), déséquilibres circulatoires, nutritionnels ou hormonaux, troubles immunitaires innés ou acquis, sénescence. Copyright AFECAP 3 La démarche de l’anatomie pathologique est basée sur une analyse sémiologique qui compare les tissus normaux et les tissus pathologiques. Les lésions sont confrontées aux données cliniques, biologiques et d'imagerie : c’est la corrélation anatomo-clinique qui est indispensable pour permettre une interprétation synthétique qui aboutit à un diagnostic (certain, probable ou incertain). Les buts de l'anatomo-cytopathologie dans la pratique médicale sont : • de contribuer à l'élaboration du diagnostic par la démarche anatomo-clinique : les lésions sont analysées et décrites dans un compte-rendu puis l’anatomo-pathologiste doit intégrer l'ensemble des faits morphologiques et des renseignements cliniques pour, en conclusion du compte-rendu, affirmer un diagnostic ou proposer une hypothèse diagnostique. • d’apporter des éléments utiles pour préciser le pronostic, en particulier dans le domaine de la pathologie tumorale. • de contribuer à évaluer l'effet des thérapeutiques : les examens anatomocytopathologiques sont renouvelés au cours d’un traitement afin de juger de la disparition, de la persistance ou de l’aggravation des lésions. 2.2. Les différents types de prélèvements 2.2.1. Les prélèvements cytologiques Les cellules isolées, ou les petits amas cellulaires, peuvent être obtenus de diverses façons : • Recueil des liquide spontanément émis (urine, expectoration, fistule, drain,…) • Raclage, brossage, écouvillonage, aspiration de cellules desquamant spontanément (col utérin, bulle cutanéo-muqueuse, bronches, voies biliaires, aspiration après lavage bronchoalvéolaire) • Ponction à l’aiguille d’un liquide (épanchement de séreuse ou articulaire, liquide céphalorachidien, kyste, collection,…) avec ou sans contrôle écho-ou scannographique • Ponction à l’aiguille d’un organe ou d’une tumeur (ganglion, nodule thyroïdien ou mammaire,…) avec ou sans contrôle échographique ou scannographique • Apposition d’un organe (pièce opératoire, biopsie) sur une lame 2.2.2. Les prélèvements tissulaires Ils sont effectués selon trois modalités : Copyright AFECAP 4 a) La biopsie consiste à prélever un fragment de tissu sur un être vivant en vue d'un examen anatomo-pathologique. Par extension, ce terme peut désigner le fragment tissulaire. La biopsie peut être effectuée selon plusieurs modalités : • par ponction à l'aide d'une aiguille coupante ou d'un trocart (foie, rein, os...) : on obtient des cylindres de tissu de quelques mm à quelques cm de long (Voir placmed01 ci dessous). Les ponctions sont effectuées "à l'aveugle" lorsque l’ensemble de l’organe est malade ou sous repérage (échographie, scanner) lorsque la ponction doit être dirigée sur une lésion focale visible en imagerie. Carotte de ponction-biopsie hépatique. En haut : vue macroscopique de la lame : deux carottes de 1 cm. En bas : vue microscopique d'une carotte colorée (objectif 5) (placmed01) • par biopsie chirurgicale après anesthésie locale ou générale et sous contrôle de la vue : biopsie partielle, ou biopsie exérèse enlevant la totalité de la lésion. • au cours d'une endoscopie (pince montée sur l'endoscope) : fragments de 0,5 mm à 2 mm biopsie de muqueuse colique prélevée à la pince lors d'une endoscopie. En haut, vue macroscopique de la lame : elle présente 3 biopsies de 1 à 2 mm de diamètre, sur quatre coupes. En bas, vue microscopique d'une biopsie colorée (objectif 5) (placmed02) La valeur des biopsies repose sur : • leur taille (exemple : pour la recherche d’une artérite de Horton où les lésions sont segmentaires, une biopsie d'artère temporale représentative doit mesurer au moins 1,5 cm) • leur nombre : plus elles sont nombreuses, plus on a de chance de trouver du tissu tumoral, de rendre compte de l'hétérogénéité d'une tumeur, d'observer une lésion focale mais importante pour le diagnostic • le choix de la zone biopsiée : éviter les zones nécrotiques ou hémorragiques ; sur la peau ou une muqueuse éviter les prélèvements trop superficiels ; biopsier le ganglion ayant fait l'objet d'une ponction cytologique motivant la biopsie ... • la bonne préservation des tissus : ne pas étirer ou écraser les fragments, éviter le bistouri électrique "grillant" les tissus • le repérage topographique de biopsies multiples (flacons différents répertoriés). Copyright AFECAP 5 b) Les pièces opératoires : exérèse partielle ou complète d'un ou de plusieurs organes, séparés ou en monobloc. c) L'autopsie (ou nécropsie) correspond à l'examen anatomo-pathologique pratiqué sur un cadavre. Les autopsies médicales sont distinctes des dissections anatomiques qui sont pratiquées dans les Laboratoires d'Anatomie des Facultés de Médecine pour l'enseignement des étudiants en anatomie et pour la recherche, sur des cadavres qui sont des "dons de corps à la Science". Les autopsies médico-légales sont pratiquées sur ordre de la justice (réquisition du procureur ou ordonance d’un juge d’instruction). Elles les ont habituellement par un médecin expert inscrit sur les listes de la Cour d’Appel, mais tout médecin peut être désigné. Il n’existe pas de réelles exigences de compétences techniques. Les autopsies sont pratiquées dans tous les cas de mort suspecte, notamment lorsqu’il n’y a pas eu délivrance de permis d’inhumer (cf case « obstacle médico-légal » sur les certificats de décès. Les autopsies à but scientifique sont pratiquées dans les hôpitaux, généralement par les médecins anatomo-pathologistes, à la demande des médecins qui ont soigné le patient pendant son séjour à l'hôpital, éventuellement à la demande d'un médecin traitant pour un patient décédé à son domicile. → EN SAVOIR PLUS sur les autopties 2.3. Techniques d'étude morphologique des prélèvements cellulaires et tissulaires La qualité des prélèvements conditionne la qualité de l'étude anatomopathologique. Le médecin préleveur et prescripteur a une responsabilité dans l'acte anatomopathologique en s'assurant de la bonne réalisation technique du prélèvement, de son acheminement dans de bonnes conditions au laboratoire (dans des délais brefs, en respectant les règles de fixation, accompagné d'une demande d'examen correctement renseignée). 2.3.1. Enregistrement Lorsqu'un prélèvement parvient au laboratoire, il est enregistré et reçoit un numéro d’identification nique qui sera retranscrit sur les blocs et les lames qui seront examinées au microscope après le traitement technique du prélèvement. Chaque prélèvement doit être accompagné d'une fiche de renseignements remplie par le médecin prescripteur qui doit mentionner : • l'identité du patient : nom, prénom, date de naissance, sexe. • le siège, la date (jour et heure) et la nature du prélèvement (biopsie ou exérèse). Copyright AFECAP • 6 les circonstances cliniques et para cliniques qui ont motivé le prélèvement, éventuellement les hypothèses diagnostiques. • L'aspect macroscopique ou endoscopique des lésions (un compte-rendu opératoire peut être utilement joint) ; éventuellement l'aspect d'imagerie, en particulier pour les tumeurs osseuses. • les antécédents pathologiques du patient, en particulier, dans la mesure du possible, les antécédents d’examens anatomopathologiques effectués dans un autre laboratoire. La nature des traitements éventuellement administrés au malade. • le nom et coordonnées du médecin prescripteur et du préveleur, et éventuellement des autres médecins correspondants. 2.3.2. Techniques d’étude des cellules Etalement des cellules sur des lames de verre : l'étalement est fait par le préleveur lors des cytoponctions d'organes (voir placmed09), des frottis, écouvillonage, brossages ou appositions ; ce geste simple doit être bien maîtrisé pour éviter un écrasement des cellules ou des amas en plusieurs couches peu interprétables (voir placmed11) Techniques cytologiques : En haut : projection du produit de ponction cytologique à l’aiguille sur une lame ; en bas : la goutte est étalée, tirée à l’aide d’une autre lame ; à droite : lame d’un étalement cytologique (après coloration) (placmed09) Étalement du produit de cytoponction d’un ganglion lymphatique (coloration May-Grunwald-Giemsa) (placmed11) Etalement des cellules par cytocentrifugation sur lame de verre Le liquide (naturel ou d'épanchement (voir placmed10) ou de lavage) est acheminé au laboratoire ou il est centrifugé directement sur une lame de verre, sous forme d’une pastille. Cytocentrifugation d’un liquide d’ascite : A. cytocentrifugeuse. B. Spot de cytocentrifugation sur lame (après coloration) (placmed10) La fixation des étalements se fait soit par simple séchage à l'air pour la coloration de MayGrunwald-Giemsa (voir placmed12), soit par immersion dans l'alcool-ether ou par application d'un aérosol de laque fixante pour les colorations de Harris-Schorr ou de Papanicolaou (frottis cervicoutérins notamment (voir placmed13)). Copyright AFECAP 7 Étalement d ’un produit de cytoponction ganglionnaire. Diagnostic : lymphome hodgkinien (coloration May-GrunwaldGiemsa) (placmed12) Frottis cervico-utérin : présence de koïlocytes témoignant d'un condylome viral. coloration de Papanicolaou (placmed13) Afin d’éviter l’altération des cellules par autolyse, la fixation, la cyto-centrifugation et la coloration doivent être effectuées rapidement après l'obtention du prélèvement : fixation des frottis cervicoutérins par le médecin préleveur, acheminement rapide d’un liquide à l'état frais au laboratoire, coloration au MGG sans délai excessif de lames séchées à l'air. En cas de besoin (par exemple, recueil d'un liquide en dehors des heures d'ouverture d'un laboratoire) un liquide peut être provisoirement stocké dans un réfrigérateur à +4°C. Etalement des cellules en monocouche Cette technique moins répandue consiste à recueillir les cellules par ponction (séreuse, organe plein,…) ou frottis (col utérin) et à les transmettre au laboratoire dans un liquide conservateur. Les cellules présentes dans le flacon de fixateur sont ensuite remises en suspension (Vortex) et éventuellement soumises à une dispersion par gradient de densité, puis s'effectue un processus de concentration (par filtration et/ou centrifugation). Enfin, les cellules sont transférées en couche mince sur une lame, sur une pastille de taille déterminée. La technique de prise en charge d'un prélèvement cytologique étant rapide (environ une heure de technique), un résultat urgent peut être donné au médecin prescripteur de l’examen le jour même du prélèvement. Des colorations spéciales et des réactions immuno-cytochimiques peuvent être également effectuées, à condition de disposer du nombre de lames nécessaires (d'où l'importance des renseignements cliniques fournis à la réception du prélèvement). L’analyse d’un liquide peut également se faire après fixation et inclusion en paraffine d’un culot de centrifugation, qui est alors techniqué de la même façon qu’un prélèvement tissulaire. Un examen cytopathologique fournit des renseignements souvent partiels, voire sans certitude. Par exemple, les anomalies cytoplasmiques et nucléaires observées dans des cellules cancéreuses peuvent être difficiles à distinguer de modifications cellulaires induites par des phénomènes inflammatoires ou régénératifs ; en outre, lors de l’étude de cellules isolées, des critères importants du diagnostic d’un cancer tels que l’architecture du tissu néoplasique et ses relations avec le tissu 8 Copyright AFECAP sain ne sont pas analysables. L’examen cytopathologique est donc un examen de dépistage ou d'orientation diagnostique. Un contrôle par biopsie est presque toujours nécessaire avant toute thérapeutique. L’analyse d’un liquide peut égelement se faire à partir d’un culot de centrifugation qui est alors techniqué de la même façon qu’un prélèvement tissulaire (coupes au microtome,…). 2.3.3. Techniques d’étude des tissus La technique de base comporte plusieurs étapes : la fixation, l’inclusion en paraffine, la confection de coupes et leur coloration. Avant la fixation, il est possible d’effectuer sur le tissu frais des appositions sur lames pour une étude cytopathologique, et des prélèvements pour des techniques particulières : congélation, fixation adaptée à la microscopie électronique, mise en culture pour étude cytogénétique ou en suspension cellulaire pour étude par cytométrie en flux… En ce qui concerne les pièces opératoires, une étape d'analyse macroscopique est indispensable, avant (idéalement ) ou après la fixation de la pièce. 2.3.3.1. Etude macroscopique L'examen macroscopique détaillé est une partie essentielle de l'étude d'une pièce opératoire : la pièce est examinée (voir placmed03), mesurée (voir placmed04), pesée, palpée puis disséquée (voir placmed05). Examen macroscopique d’une pièce opératoire : exemple d’une pièce oesogastrectomie pour cancer du bas œsophage (flèche). A- pièce fraîche. B- pièce après fixation dans une solution de formol (placmed03) Examen macroscopique d’une pièce opératoire d' oesogastrectomie pour cancer du bas œsophage repérage des dimensions de la pièce (plamed04) Examen macroscopique d’une pièce opératoire : dissection d'une pièce d'oesogastrectomie et sélection des prélèvements destinés à l’étude microscopique (placmed05) Chaque lésion est repérée sur un schéma et éventuellement photographiée. Ces constatations sont confrontées aux documents cliniques et/ou radiologiques d’où l’importance des renseignements écrits fournis par le médecin clinicien. En cas de pièces opératoires complexes (exérèse monobloc de plusieurs organes ou pièce de résection selon une méthode non conventionnelle), le chirurgien 9 Copyright AFECAP devra adresser la pièce avec des indications de repérage topographique. Il peut être utile de marquer les berges d'une pièce de résection de tumeur avec une encre indélébile (voir placmed06): ceci ne nuit pas à l'étude histologique et permet d'apprécier exactement la distance entre la tumeur et la limite chirurgicale de la pièce (voir placmed07). Pièce d’exérèse de prostate et de vésicules séminales : A- surface tatouée à l’encre de chine, B- Tranche de section de la prostate : l’encre ne pénètre pas en profondeur (placmed06) Pièce d’exérèse de prostate tatouée à l’encre de chine : Lors de l ’examen microscopique, l ’encre permet de repérer exactement les limites de la résection chirurgicale (limite noire à gauche) (placmed07) L'examen macroscopique donne des indications pour le pronostic de la maladie (notamment taille et localisation d’un cancer) et il permet de sélectionner les territoires à prélever pour l'étude microscopique : zones lésées, zones d'aspect macroscopique sain et limites d'exérèse (voir placmed08). Exemple de prélèvement destiné à l’étude microscopique : jonction entre la paroi oesophagienne d’aspect sain (A) et la tumeur (B) (placmed08) Après le choix des prélèvements destinés à l'analyse microscopique, les restes de la pièce opératoire sont conservés pendant quelques jours ou semaines afin de pouvoir en cas de nécessité effectuer des prélèvements complémentaires. 2.3.3.2. Fixation Indispensable pour conserver la morphologie cellulaire, elle doit être immédiate ou au moins très rapidement débutée après l'obtention du prélèvement. Toute fixation défectueuse rend l'étude anatomo-pathologique difficile voire impossible (dessiccation et/ou autolyse du tissu). Si le laboratoire est situé à proximité immédiate du lieu de prélèvement, celui-ci peut être acheminé rapidement (moins d’une heure) et confié à l'anatomo-pathologiste qui choisira les conditions de fixation les plus adaptées. Sinon, la fixation doit être effectuée par le médecin préleveur. Trois précautions doivent être prises : le volume du fixateur doit représenter environ 10 fois le volume de la pièce. Le récipient doit être de taille suffisamment grande pour prévenir les Copyright AFECAP 10 déformations des pièces opératoires volumineuses. Avant fixation, les organes creux (tube digestif, vésicule biliaire, utérus..) doivent être ouverts et si nécessaire lavés de leur contenu afin de prévenir l'autolyse des muqueuses ; les organes pleins volumineux (foie, rate) doivent être coupés en tranches pour faciliter la pénétration rapide et homogène du fixateur ; les poumons peuvent être fixés par insufflation d’une solution de formol dans les bronches ou coupés en tranches. Seuls les cerveaux de nécropsies seront plongés dans une solution de formol sans être tranchés en raison de la fragilité de la substance cérébrale. La durée de la fixation dépend de la taille du prélèvement : au minimum 2 à 5 heures pour une biopsie et 48 heures pour une pièce opératoire. Nature du fixateur : le fixateur le plus habituellement utilisé est le formol à 10% tamponné. Pour les biopsies de petite taille, des fixateurs à base d'alcool peuvent être utilisés (fixation encore plus rapide mais effet délétère sur certains antigènes ce qui peut nuire à des techniques particulières d’immunohistochimie). Cas particuliers des tissus calcifiés : Les prélèvements calcifiés (os, certaines tumeurs) doivent être sciés, puis fixés, puis plongés dans une solution décalcifiante (acide) avant d'être inclus dans la paraffine, ce qui rallonge la durée de la technique. 2.3.3.3. Imprégnation et inclusion Les prélèvements ayant achevé leur fixation sont déposés dans des cassettes en plastique, directement s’il s’agit de biopsies ou, s’il s’agit de pièces opératoires, après l’étape d’examen macroscopique au cours de laquelle sont prélevés des fragments de petite taille (en moyenne 2x 2x 0,3 cm). Puis les tissus contenus dans les cassettes sont déshydratés par passage dans des alcools, l'alcool est éliminé par des solvants (xylène) puis la paraffine liquide à 56° imprègne les tissus et est refroidie. Ces étapes sont automatisées dans des appareils à inclusion (voir placmed14). L’étape finale de l’inclusion est manuelle et consiste à réorienter convenablement le fragment tissulaire dans le sens de la coupe dans un moule de paraffine (voir placmed15) (voir placmed16). Automate d’inclusion des tissus dans la paraffine (placmed14) Tissus déshydratés imprégnés de paraffine, avant l’inclusion Copyright AFECAP 11 (placmed15) Inclusion manuelle du tissu dans un moule de paraffine (placmed16) 2.3.3.4. Coupes et colorations. Le bloc solide de paraffine contenant le tissu est coupé grâce à un microtome, les coupes de 3 à 5 microns d'épaisseur sont étalées sur des lames. Technique histologique : étapes manuelles. A : refroidissement des blocs de paraffine ; B : coupe au microtome ; C : étalement (placmed17) Après dissolution de la paraffine, puis réhydratation, le tissu est coloré. automate à coloration (placmed18) A. Tissu dans le bloc de paraffine après la coupe. B Coupe du tissu étalé sur lame et coloré (placmed19) La coloration usuelle associe un colorant basique nucléaire (hématéine, hématoxyline) et un colorant acide cytoplasmique (éosine, érythrosine, ou phloxine) ; on y ajoute souvent du safran qui se fixe sur le collagène (voir placmed20). La coupe colorée est protégée par une lamelle de verre collée ou par un film plastique transparent. Elle est analysée au microscope par un médecin anatomo-pathologiste (voir placmed21)qui établit un compte-rendu. Les blocs et les lames sont ensuite archivés (voir placmed22). Coloration hématoxyline-éosine-safran sur une lame intéressant la jonction entre la paroi oesophagienne saine (A) et une tumeur (BC). A : muqueuse malpighienne saine de l'œsophage. B : adénocarcinome à moyen grossissement. C : adénocarcinome à fort grossissement (placmed20) Plateau de lecture : Les lames colorées accompagnées des renseignements cliniques sont préparées pour le médecin pathologiste qui les observe au microscope : détection et interprétation des lésions pour établir un diagnostic (placmed21) Archivage des lames et des blocs (placmed22) 2.4. Techniques particulières morphologiques 2.4.1. Examen histologique extemporané Copyright AFECAP 12 Il s'agit d'un examen anatomopathologique pratiqué dès que le prélèvement est effectué, non fixé, pendant une intervention chirurgicale, afin de fournir rapidement au chirurgien un diagnostic susceptible de modifier le déroulement de l’acte chirurgical. La technique utilise la macroscopie et, le plus souvent, des coupes au microtome à congélation et une coloration rapide, ce qui permet un résultat en moins de 30 minutes (voir placmed23) (voir placmed24). Examen histologique extemporané d’une lésion mammaire : A - prélèvement frais. B - examen macroscopique. C - un échantillon de la lésion est mis à congeler sur un portoir (placmed23) Examen histologique extemporané: coupe au microtome à congélation puis coloration rapide au bleu de toluidine (placmed24) Mais la morphologie tissulaire n'est pas d'aussi bonne qualité qu'après une fixation et inclusion en paraffine, en raison de la congélation qui altère la morphologie cellulaire (voir placmed24bis). En outre, pour respecter un délai de réponse court, il n'est pas possible d'examiner en totalité une lésion volumineuse. Le diagnostic fourni par un examen extemporané n’est donc pas aussi fiable qu’un diagnostic histologique conventionnel : il ne doit être considéré que comme un diagnostic de présomption. Les tissus calcifiés ne peuvent être coupés dans un cryostat et ne peuvent donc faire l'objet d'un examen histologique extemporané. Coupe d ’examen histologique extemporané colorée au Bleu de toluidine (placmed24bis) → EN SAVOIR PLUS sur l'examen histologique extemporané 2.4.2. Colorations histochimiques spéciales Des colorations spéciales ont pour but de mettre en évidence des constituants particuliers des cellules (glycogène, mucus, pigments…) ou de la matrice extracellulaire (collagènes, fibres élastiques, amylose...) ainsi que des agents infectieux (bactéries, parasites, champignons). Ces colorations sont très variées et leur mise en œuvre, le plus souvent manuellement, rallonge le processus technique. → EN SAVOIR PLUS sur les colorations spéciales Copyright AFECAP 13 2.4.3. Histoenzymologie Certains enzymes peuvent être mis en évidence sur des coupes congelées ou parfois après inclusion dans la paraffine. La coupe est incubée dans un substrat spécifique de l'activité enzymatique recherchée. La réaction libère un produit coloré ou colorable qui peut être visualisé au microscope optique. L'application la plus courante est l'étude des biopsies musculaires pour myopathies. Histoenzymologie sur une biopsie musculaire. Recherche des activités enzymatiques NADH-TR (à gauche) et succinate déshydrogénase (à droite) dans une myopathie congénitale à "central core". Le core excentré sans activité enzymatique correspond à un amas de myofibrilles sans mitochondries (placmed50) 2.4.4. Immunohistochimie Elle consiste à mettre en évidence divers antigènes (Ag) cellulaires ou extra-cellulaires grâce à des anticorps (Ac) spécifiquement dirigés contre eux, sur des préparations cytologiques (immunocytochimie) ou sur des des coupes de tissus congelés ou fixés et inclus en paraffine. Les Ag recherchés peuvent être des Ag membranaires, cytoplasmiques ou nucléaires ou des protéines de la matrice extra-cellulaire. L'immunofluorescence directe est surtout utilisée pour mettre en évidence les dépôts tissulaires d'immunoglobulines et de complément dans les biopsies cutanées et dans les biopsies rénales congelées, observées grâce à un microscope à fluorescence. Immunofluorescence sur une biopsie rénale : mise en évidence de dépôts anormaux de chaînes légères kappa dans un glomérule et les membranes basales des tubes (maladie des dépôts de chaînes légères d’immunoglobulines) (placmed51) Dans les méthodes immunoenzymatiques indirectes, l'Ac spécifique primaire est déposé sur le tissu, puis il est révélé par un 2ème Ac couplé à une enzyme à laquelle on fournit son substrat. Le produit coloré de la réaction enzymatique apparaît au niveau du site des complexes Ag-Ac. Immunohistochimie par méthode immunoenzymatique : marquage des cellules à insuline dans un ilôt de Langerhans (réaction de couleur brune donnée par la diaminobenzidine, substrat de la péroxydase) (placmed51bis) → EN SAVOIR PLUS sur l'immunohistochimie L'immunohistochimie est très largement utilisée dans une majorité de laboratoires d'anatomie pathologique avec de multiples indications parmi lesquelles : Copyright AFECAP 14 • Intérêt diagnostique : classification précise de nombreuses tumeurs par la mise en évidence d'antigènes de différenciation cellulaire; mise en évidence de certains agents infectieux Mise en évidence immunohistochimique de cytokératine témoignant d'une différenciation épithéliale dans un carcinome à cellules fusiformes : marquage cytoplasmique à l'aide de l'anticorps anti-pankératine KL1 (méthode d'immunopéroxydase indirecte sur tissu déparaffiné) (Placmed54) Mise en évidence immunohistochimique de l’antigène HBs dans deux hépatocytes infectés par le virus de l'hépatite virale B (méthode d'immunopéroxydase indirecte sur tissu déparaffiné : coloration brune des cytoplasmes infectés par le virus) (placmed55) • Intérêt pronostique : mise en évidence de protéines impliquées dans la prolifération cellulaire, ou de produits d'oncogènes Mise en évidence immunohistochimique de l'antigène du cycle cellulaire Ki67 dans des cellules tumorales d'un lymphome non hodgkinien : marquage nucléaire des cellules en cycle de prolifération par l'anticorps MIB1 (technique d'immunoperoxydase sur tissu déparaffiné) (placmed56) • Intérêt thérapeutique : afin de déterminer le statut potentiellement hormono-sensible des cancers du sein, la mise en évidence par immunohistochimie des récepteurs nucléaires aux oestrogènes et à la progestérone a supplanté le dosage biochimique de ces récepteurs dans ces tumeurs. Mise en évidence immunohistochimique des récepteurs nucléaires aux oestrogènes dans un cancer invasif du sein (technique d'immunoperoxydase) : marquage nucléaire de la majorité des cellules tumorales (placmed57) 2.4.5. Techniques de biologie moléculaire in situ Mise en évidence sur des coupes tissulaires (en congélation ou après inclusion dans la paraffine) ou sur des étalements cellulaires, de séquences d'ARN ou d'ADN grâce à des sondes d'acides nucléiques complémentaires et couplées à un traceur radioactif (sondes chaudes) ou à une enzyme (sondes froides) ou un fluorochrome (sondes fluorescentes). Le terme in situ indique que la détection s'effectue au sein du chromosome en configuration native, à la différence des techniques d'étude d'acides nucléiques extraits sur gels. L'hybridation in situ classique a relativement peu d'indications car un grand nombre de copies de l'acide nucléique doit être présent dans la cellule pour qu'une réaction positive soit obtenue. Elle peut être utilisée pour mettre en évidence des acides Copyright AFECAP 15 nucléiques viraux (HPV, EBV) ou des ARN de chaînes légères d'immunoglobulines. L'hybridation in situ fluorescente (FISH) et la PCR in situ seront détaillées dans le chapitre suivant. Détection nucléaire des ARNs EBER du virus d'Epstein Barr dans une lymphoprolifération liée à ce virus. Marquage nucléaire noir par hybridation in situ sur tissu fixé et inclus en paraffine (placmed59) 2.4.6. Autres techniques morphologiques Certaines techniques plus spécialisées (microscopie électronique, histomorphométrie, microscopie confocale, cytométrie en flux), rarement utilisées en routine, seront étudiées dans le chapitre suivant 2.5. Les résultats. Le compte-rendu anatomopathologique Les résultats sont donnés sous la forme d'un compte-rendu écrit, dans lequel les lésions sont décrites, puis interprétées, avec le cas échéant une description des méthodes complémentaires utilisées (techniques immunohistochimiques par exemple), pour aboutir à une conclusion synthétique: diagnostic lésionnel ou hypothèses de diagnostic en fonction des renseignements fournis et des lésions observées. Chaque fois que cela est nécessaire (en particulier pour des tumeurs) des éléments de pronostic doivent être fournis. L'usage de terminologies et classifications nationales et internationales est recommandé. Le diagnostic morphologique doit toujours être confronté avec la clinique et, le cas échéant, la radiologie et l’imagerie. Le délai de réponse nécessaire, en raison des diverses contraintes techniques, est généralement de l'ordre de 48h au minimum. En cas de délai prolongé (examen en attente de techniques complémentaires ou demande d'avis auprès d'un expert), un compte-rendu provisoire peut être adressé, mais une décision thérapeutique ne peut s'appuyer que sur le compte-rendu définitif. 2.6. Déontologie. Aspects législatifs Le compte-rendu anatomocytopathologique est daté et signé par le médecin habilité qui a effectué l'examen et est adressé au médecin prescripteur de l'examen, éventuellement aux autres médecins en charge du patient. Le compte-rendu devient un élément du dossier médical du patient et est couvert par le secret médical. → EN SAVOIR PLUS sue les aspects législatifs Copyright AFECAP 16 L’avis d’autres médecins anatomo-pathologistes peut être sollicité dans diverses circonstances : cas de diagnostic difficile, désaccord sur le diagnostic entre le pathologiste et le clinicien, avis d'un autre pathologiste sollicité à la demande du clinicien ou du patient. Cela nécessite l’envoi de lames, de blocs ou des images numériques (télépathologie voir plus loin). Le pathologiste consulté rédige un compte-rendu écrit qui est adressé au pathologiste initial et est transmis au médecin en charge du patient. Les résidus de pièces opératoires ou de prélèvements nécropsiques sont détruits après l'analyse anatomopathologique mais les blocs d’inclusion, les lames colorées et les comptes-rendus sont conservés par le laboratoire dans des archives : il s'agit d'une obligation légale. 3. place de l’anatomo-cytopathologie dans la recherche moderne Le pathologiste doit continuer d'évoluer, comme il l'a toujours fait, en enrichissant la sémiologie morphologique des nouvelles méthodes diagnostiques, mais il doit garder un raisonnement précis basé sur la morphologie (tant macroscopique, que microscopique), pour établir ou réviser les arbres décisionnels. 3.1. La prise en charge pluridisciplinaire du patient Depuis toujours, les confrontations anatomo-cliniques régulières organisées entre cliniciens et pathologistes permettent de confronter le diagnostic morphologique aux données cliniques, d'imagerie ou de biologie moléculaire. Elles ont été récemment formalisées au sein de réseaux cliniques ville-hôpital pour la prise en charge de pathologies ciblées (hépatite C…), ou en cancérologie où l’anatomopathologiste participe aux confrontations pluridisciplinaires (radiologues, chirurgiens, oncologues…). Seule une mise en commun des données permet d'assurer au patient un diagnostic fiable, une prise en charge de qualité (recherche de facteurs influençant le pronostic) et de proposer une stratégie thérapeutique. 3.2. La cryopréservation des tissus A coté de l’archivage des blocs de tissus fixés, inclus en paraffine, le pathologiste a, depuis longtemps, pris l'habitude de congeler et de conserver des prélèvements tissulaires, souvent mais pas toujours, tumoraux. La congélation d’échantillon est habituellement faite dans un but diagnostic (immédiat ou principe de précaution pour donner au patient une chance supplémentaire, fonction de Copyright AFECAP 17 l'évolution des connaissances), mais aussi pour la recherche et/ou la constitution d’une collection (tissuthèques, tumorothèques, centres de ressources biologiques)…. → EN SAVOIR PLUS les collections de tissus cryopréservés Le développement spectaculaire des techniques de biologie moléculaire, de génétique moléculaire a suscité un intérêt nouveau pour les prélèvements tissulaires patiemment collectés et conservés par les pathologistes. 3.3. Les techniques d’analyse Au cours des deux dernières décennies, les techniques d’investigation morphologique se sont considérablement développées. Quel sera l'avenir de notre discipline ? Sera-t-elle entièrement automatisée et robotisée, l'anatomopathologiste sera-t-il remplacé par une station d'analyse morphométrique couplée à des algorithmes sophistiqués permettant le diagnostic? L’analyse de l'ADN, de l'ARN et/ou du protéome, remplacera-t-elle définitivement la lecture de la lame histologique par le pathologiste ? L'analyse sémiologique et morphologique fine au microscope, aura-t-elle encore cours face à la génétique moléculaire ? L'avenir le dira. La mise au point d'une nouvelle technique d'analyse à grande échelle de l'expression des gènes (génomique et transcriptomique) et de la distribution des protéines (protéomique) n'a fait que renforcer cet intérêt. La liste des techniques complémentaires pouvant être utilisée est longue et non exhaustive. Si certaines techniques sont utilisées en routine dans certains laboratoires (microscopie électronique, cytométrie en flux morphométrie, microscopie confocale, lame « virtuelle »), d’autres restent actuellement du domaine de la recherche (microdissection, analyse chromosomique in situ de type FISH ou CISH, tissue array, techniques d'analyse du transcriptome ou du protéome…Pour toutes ces techniques développées et utilisées en recherche l’application en routine n’est pas toujours évidente. 3.3.1. Microscope électronique Cette technique, par l’utilisation de coupes tissulaires très fines et de grandissements très importants, permet une étude à l’échelon cellulaire (analyse des constituants d’une cellule, des jonctions inter-cellulaires, d’éventuels dépôts, inclusions….). Son utilisation à visée diagnostique est actuellement très réduite (pathologies rares neuromusculaires, rénales ou de surcharge) et elle a Copyright AFECAP 18 été supplantée par l'immunohistochimie, qui permet d'obtenir des résultats plus précis, beaucoup plus rapidement et à moindre coût. électronique à transmission : exocytose d’un granule de sécrétion hormonale (flèche) dans une cellule d’un adénome hypophysaire (placmed58) → EN SAVOIR PLUS sur la microcospie électronique 3.3.2. Histomorphométrie Cette technique permet une évaluation quantitative de certains paramètres : étude la masse osseuse, quantification de la quantité de tissu conjonctif fibreux, étude de caractères morphologiques cellulaires (taille des noyaux…), quantification de résultats immuno-histochimiques. Elle utilise des appareils semi-automatiques couplés à des ordinateurs. 3.3.3. Microscopie confocale à balayage laser Le microscope confocal permet une analyse morpho-fonctionnelle des cellules et des tissus, par l'analyse de marquages fluorescents et la détection de leur localisation précise au sein des constituants cellulaires. → EN SAVOIR PLUS sur la microscopie confocale 3.3.4. Les lames virtuelles Ce sont des reproductions numériques d’une lame, obtenues par la juxtaposition de très nombreuses images acquises automatiquement et successivement à fort grandissement. Ces images numériques peuvent ensuite être facilement consultés par plusieurs pathologistes. C’est une technologie très utile pour l’enseignement, la relecture de cas lors de protocoles thérapeutiques ou en assurance qualité pour l’analyse de la reproductibilité diagnostique. 3.3.5. Cytométrie en flux C’est l’étude des cellules en suspension entraînées dans un flux et interceptées par un faisceau lumineux émis par un laser. Le faisceau modifié est détecté, amplifié et converti en signaux électriques traités par un ordinateur. Les suspensions cellulaires peuvent provenir de liquides naturels ou d'épanchements pathologiques, du broyage de tissu frais ou congelé ou de la dissociation enzymatiques de coupes épaisses (70-100 µm) de blocs de paraffine. L'analyse directe Copyright AFECAP 19 des constituants de la cellule permet de déterminer des paramètres à valeur pronostique en cancérologie : phase S, ploïdie. Des populations cellulaires peuvent être étudiées après incubation avec des Ac spécifiques couplés à un fluorochrome : une application possible est la détermination des antigènes membranaires caractéristiques des sous populations cellulaires normales ou tumorales dans le sang, la moelle osseuse ou dans une suspension cellulaire issue d'un ganglion lymphatique. 3.3.6. La PCR in situ Elle combine, sur des coupes histologiques, une amplification de type PCR et une hybridation in situ. Cette technique, très sensible, est d'un maniement difficile, qui empêche encore actuellement son utilisation en routine. 3.3.7. La microdissection Elle permet de réaliser des analyses moléculaires ciblées. Elle est ntamment utilisée lorsque le prélèvement est très hétérogène, pour ne prélever sur une lame que les territoires ou les cellules que l’on souhaite analyser. Cette microdissection peut être soit manuelle, soit par faisceau laser. 3.3.8. L'hybridation in situ fluorescente (FISH) Elle peut se faire sur des suspensions cellulaires, des empreintes ou des coupes congelées ou déparaffinées, et permet d’identifier dans chaque cellules la présence et le nombre de copies d’un segment chromosomique donné et en utilisant des fluorochromes différents d’apprécier une éventuelle co-localisation. Elle est de plus en plus utilisée pour rechercher des anomalies variées chromosomiques (polysomies, monosomies) ou géniques (délétions ou amplifications de certains gènes ; translocations), anomalies qui peuvent avoir dans certaines tumeurs une valeur diagnostique ou pronostique. Cette technique est un outil diagnostique de maniement encore difficile et onéreux. Elle est actuellement plus sensible que celle utilisant des techniques chromogéniques (CISH). 3.3.9. Le bloc de « tissue microarrays » C’est un bloc de paraffine comportant des carottes de 0,6 à 4mm de diamètre, alignés dan un ordre repéré dans un bloc receveur. Ces blocs, comportant de nombreuses tumeurs, permettent de valider facilement de nouveaux marqueurs. Copyright AFECAP 20 L’analyse de la signature moléculaire d’une lésion, basée sur l’étude du transcriptome (étude à grande échelle des ARN extraits des tissus par biopuces ou PCR quantitative) sera facilitée par les puces à ADN, puis le développement de puces dédiées avec un nombre restreint de gènes. L’analyse simplifiée du protéome (immunohistochimie ou spectrométrie de masse) avec des appareils de spectométrie de masse de type SELDI-TOF (surface enhanced laser desorption/ionization time of flight) va se développer. Les protéines, séparées par leurs propriétés chimiques et leur masse moléculaire, peuvent ensuite être analysées. 3.3.10. Les techniques non morphologiques L’analyse morphologique des prélèvements cellulaires et tissulaires peut être complétée par des analyses utilisant des techniques non morphologiques de biologie moléculaire (recherche de clonalité, de perte d’hétérozygotie, de mutations, de réarrangements, etc…). Ces techniques sont réalisées soit au sein des laboratoires de pathologie, soit dans des départements de biologie moléculaire en relation étroite avec des pathologistes. Toutes ces analyses (sur cellules isolées, tissu frais, congelé ou fixé) doivent impérativement être effectuées après un contrôle morphologique du prélèvement analysé. Si le prélèvement est très hétérogène, ou si les cellules pathologiques sont rares, il est parfois nécessaire de le microdisséquer. 3.4. L’épidémiologie, les registres Par l’utilisation du codage systématique des lésions, les bases de données anatomopathologiques (système informatisé de gestion de laboratoire) constituent une base fiable, facilement exploitable pour l’épidémiologie (fréquence, prévalence des maladies). Ces données ne peuvent être exploitées que de manière anonyme et en accord avec la CNIL Les pathologistes sont souvent sollicités pour participer à des enquêtes à l’échelon national (institut de veille sanitaire) sur une pathologie donnée. 3.5. L’Assurance Qualité La nécessité d’actualiser ses connaissances (formation continue) et la démarche d’assurance qualité s'impose à tout médecin, au travers des articles 32 et 72 du code de déontologie. La recherche de la qualité et de la sécurité des résultats est une préoccupation constante de tout pathologiste. La bonne exécution des actes est une des conditions déterminantes de cette qualité. Le recours aux bases de données informatisées (Pubmed, immunoquery) facilite l’accès à l’information la plus pertinente. Une démarche institutionnelle d’Assurance Qualité en Anatomie et Copyright AFECAP 21 Cytologie Pathologiques est structurée au sein de l’Association Française d’Assurance Qualité en Anatomie et Cytologie Pathologiques (AFAQAP). → EN SAVOIR PLUS sur l'assurance qualité Copyright AFECAP 22 4. En Savoir Plus 4.1. Les autopsies Les autopsies à but scientifique ont pour objectif d'établir un bilan complet des lésions : 1) déterminer la nature de la maladie : porter un diagnostic final qui est comparé au diagnostic fait chez le malade vivant 2) juger de l'efficacité et d'éventuelles complications des traitements qui ont été administrés 3) déterminer la cause du décès : ce peut être soit directement la maladie du patient (exemple : cancer généralisé), soit des complications liés au traitement, soit une autre maladie compliquant la maladie pour laquelle le patient avait été hospitalisé (exemple : une infection pulmonaire nosocomiale chez un patient hospitalisé pour accident vasculaire cérébral). L'autopsie peut découvrir des lésions qui avaient été totalement méconnues du vivant du malade. L'exploitation statistique des résultats d'autopsie (surtout si elles sont systématiques) fournit des renseignements épidémiologiques et didactiques. Les conditions légales réglementant les nécropsies à but scientifique sont celles qui concernent plus globalement tous les prélèvements d'organes post-mortem. - Constat de mort indiquant les procédés utilisés pour affirmer le décès, résultats, date et heure des constatations. - la nécropsie est interdite si le malade a manifesté son opposition : toute personne peut consigner son refus d'autopsie ou de prélèvements d'organes dans un registre (registre tenu à l'hôpital ou registre national géré par l'Etablissement Français des Greffes); si la personne admise à l'hôpital n'est pas en mesure de s'exprimer, on consigne dans le registre toute indication recueillie sur sa personne ou provenant des membres de sa famille ou de proches laissant à penser que la personne s'opposait à des prélèvements sur son corps. La consultation du registre national automatisé des refus de prélèvements d'organe géré par l'Etablissement Français des Greffes est obligatoire pour tout patient âgé de plus de 13 ans avant de pouvoir procéder à l'autopsie ; pour les enfants de moins de 13 ans : nécessité de l’autorisation écrite des parents. Copyright AFECAP 23 - la nécropsie à but scientifique est interdite si les circonstances de la mort sont suspectes (accident, crime, suicide...) et peuvent conduire à un examen médico-légal. Pour les mêmes raisons médico-légales, on s'abstient de faire une nécropsie à but scientifique s'il s'agit d'un pensionné de guerre ou d'un accidenté du travail ou d'une maladie professionnelle. Une autopsie doit être pratiquée aussi précocement que possible après le décès pour éviter l'autolyse cadavérique. Après la constatation du décès, le corps est transporté au dépôt mortuaire de l'hôpital. La famille est avertie et son accord est sollicité. Le corps est mis en chambre froide jusqu'au moment de l'autopsie, qui est généralement réalisée dans les 24 à 48 heures (exceptionnellement 72 heures) après le décès. Les médecins anatomo-pathologistes doivent avoir le maximum de renseignements concernant l'histoire médicale du patient et les circonstances de son décès afin de bien orienter la recherche des lésions. L'étude débute par un examen de l'aspect extérieur du cadavre (recherche d'anomalies de la peau, de cicatrices....). Il est généralement pratiqué une incision médiane allant de la base du cou au pubis. Les côtes sont sectionnées : on examine l'aspect du thorax et de l'abdomen ouverts, on note la présence éventuelle de liquide anormal (quantité, couleur). On dégage et examine les viscères thoraciques et abdomino-pelviens. Pour étudier le cerveau, le cuir chevelu est incisé puis récliné et le crâne est ouvert à la scie électrique : le cerveau est dégagé en sectionnant sa zone de jonction avec la moelle épinière. Celle-ci peut être dégagée en sectionnant une à une les vertèbres. Des prélèvements sont systématiquement réalisés pour une étude microscopique ultérieure sur toutes les lésions macroscopiques et les organes d'aspect sain. Les constatations effectuées lors de l'autopsie sont consignées dans un compte-rendu adressé au médecin qui a demandé l'autopsie. Après l'autopsie, le corps est préparé par le personnel de la chambre mortuaire pour être rendu à la famille. Le corps peut être ramené à son domicile ou à celui de sa famille par une entreprise agréée, sans mise en bière dans les conditions suivantes : respect d'un délai de 24 heures maximum entre l'heure du décès et l'achèvement du transport s'il n'y a pas de soins de conservation ou délai de 48 heures maximum si des soins de conservation sont effectués avant le transport ; corps reconnu par la famille ; autorisation écrite du médecin qui a constaté le décès (le médecin peut refuser si maladie contagieuse ou mort suspecte ou si l'état du corps ne permet pas le transport) et autorisation écrite du Directeur de l'hôpital. Si ces conditions ne sont pas remplies, la mise en bière à l'hôpital après l'autopsie est obligatoire. 4.2. Examen histologique extemporané Copyright AFECAP 24 Les motifs les plus fréquents de demande des examens histologiques extemporanés sont : déterminer la nature inflammatoire ou tumorale d'une lésion et, en cas de tumeur, sa nature bénigne ou cancéreuse pour déterminer l’importance du geste d’exérèse chirurgical ; s’assurer qu’une biopsie chirurgicale a bien intéressé un territoire lésionnel représentatif de la maladie ; s'assurer que des limites de résection sont saines. Aussitôt après leur prélèvement, les tissus (biopsie ou pièce d’exérèse) sont adressés frais au laboratoire, à sec ou dans du sérum physiologique, accompagnés de renseignements cliniques et d'une demande précise du chirurgien. Au laboratoire sont effectués un examen macroscopique puis une congélation d’un fragment (ou de tout le tissu adressé s'il mesure moins de 1 cm de grand axe). Des coupes d’environ 8 microns d'épaisseur sont effectuées dans un cryostat (microtome à congélation), colorées de façon rapide (généralement au Bleu de toluidine), puis examinées au microscope. Le délai moyen de réponse est de 10 à 20 minutes. La réponse est transmise directement au chirurgien pendant l'intervention. Le tissu examiné est ensuite décongelé et fixé pour un examen ultérieur selon la technique histologique conventionnelle : le compte-rendu final qui pose le diagnostic définitif après examen de l’ensemble de la pièce opératoire mentionnera le résultat donné lors de l’examen extemporané. L’altération des tissus par la congélation peut rendre difficile une analyse ultérieure après fixation et inclusion : un diagnostic urgent mais ne modifiant immédiatement pas le geste opératoire n'est donc pas une indication d'examen extemporané (surtout si la lésion de petite taille risque d’être en totalité et irrémédiablement altérée par la congélation). Une réponse plus fiable peut être donnée en 24 heures par une technique accélérée de fixation et inclusion en paraffine. 4.3. Colorations spéciales PAS ou coloration à l’acide périodique-Schiff : colore en rose rouge le glycogène (coloration annulée après incubation des coupes avec de l’amylase) ; les mucines neutres (voir placmed25) (mucus gastrique, mucus des glandes salivaires), l’acide hyaluronique et les membranes basales, diverses glycoprotéines : thyroglobuline, hormones hypophysaires glycoprotéiques (LH, TSH, FSH), des glycolipides (cérébrosides et gangliosides), lipopigments (céroïdes et lipofuchsines). Pas : coloration des glandes de Brunner du duodénum (placmed25) Copyright AFECAP 25 BLEU ALCIAN : colorant des mucosubstances acides ; la colorabilité des diverses substances va dépendre du pH de la solution acide de BA utilisée : mucus intestinal (voir placmed26) (mucines acides sulfatées), matrice extracellulaire riche en acide hyaluronique. Le bleu alcian peut être combiné au PAS pour une colorations des mucines. (voir placmed27) Bleu alcian : coloration des cellules caliciformes intestinales (placmed26) PAS-Bleu alcian : coloration du mucus des cryptes intestinales (placmed27) FUCHSINE-PARALDEHYDE DE GOMORI: colore en violet les fibres élastiques (voir placmed28), les mucosubstances sulfatées, les granulations des cellules bèta des îlots de Langerhans (insuline), les hépatocytes en verre dépoli par accumulation d’AgHBs… coloration de Gomori des fibres élastiques (flèches) d’une artère temporale (placmed28) Résorcine fuchsine de Weigert (voir placmed29) ou hématéine de Verhoeff sont d'autres colorations des fibres élastiques. coloration de Weigert des fibres élastiques d’une artère temporale (placmed29) ROUGE CONGO : colorant rouge orangé spécifique de l’amylose (voir placmed30) quand il donne en examen en lumière polarisée une biréfringence verte (voir placmed31). Coloration de rouge Congo: amylose glomérulaire (placmed30) Rouge congo en lumière polarisée : amylose glomérulaire (placmed31) Coloration de Von KOSSA : transforme des sels de calcium en sels d’argent et met en évidence avec une coloration noire les phosphates et carbonates de Calcium présents dans les tissus (voir placmed32). Autre méthode de mise en évidence du calcium : le rouge d’alizarine S, molécule colorante chélateur du calcium qui apparaît en rouge orangé. Copyright AFECAP 26 Coloration de Von Kossa : coloration de calcifications dans des parois vasculaires (placmed32) PERLS : coloration en bleu de l’hémosidérine (forme de stockage du fer en excès) par la mise en évidence du fer ferrique. Coloration de Perls : hémosidérine intra-hépatocytaire (granules bleus) (placmed33) Coloration de FONTANA-MASSON : méthode argentaffine à base de nitrate d’argent utilisée pour la mise en évidence en noir de la mélanine (voir placmed34) (colore aussi céroïdes, lipofuchsines, pseudo mélanine) Coloration de Fontana sur un naevus naevocellulaire cutané : mélanocytes chargés de mélanine (noire) autour d'une glande sébacée (placmed34) Coloration argentique de GRIMELIUS pour la mise en évidence en noir de granules neuroendocrines intra cytoplasmiques. coloration de Grimélius dans des cellules neuro-endocrines du pancréas (cytoplasme chargé de grains marrons) (plamed35) Colorations du collagène : une seule coloration ne peut mettre en évidence tous les constituants fibrillaires de la matrice extracellulaire. Pour apprécier une fibrose, on aura donc intérêt à pratiquer plusieurs colorations : • TRICHROME DE MASSON (coloration du collagène au Vert Lumière (voir placmed36 et placmed37) ou Bleu d’aniline, associé à une coloration nucléaire par l’hématoxyline, et une coloration cytoplasmique par un mélange de colorants acides (fuchsine Ponceau) Trichrome de Masson au vert lumière : coloration verte du collagène dans un foie. Les cytoplasmes des hépatocytes sont marrons (placmed36) Trichrome de Masson au bleu d'aniline sur tissu hépatique : coloration bleue du collagène d'un espace porte (placmed37) • PICROSIRIUS : solution saturée de rouge Sirius dans de l’acide picrique (voir placmed38). Elle permet de visualiser les fibres de collagène. Copyright AFECAP 27 Foie coloré au Picrosirius : collagène en rouge dans un espace porte (placmed38) • imprégnation argentique des fibres de réticuline (prédominance de collagène III) par la méthode de GORDON-SWEET (voir placmed39) ou colorations argentiques des membranes basales (colorations de WILDER, ou de TUZI (voir placmed40)). Imprégnation argentique des fibres de réticuline dans une moelle osseuse pathologique par la coloration de GordonSweet : myélofibrose (placmed39) coloration de Tuzi : Coloration argentique des membranes basales d’un glomérule rénal (placmed40) ROUGE à l'huile (oil-red O) : mise en évidence en rouge des triglycérides (voir placmed41). Se fait idéalement sur du tissu frais congelé mais est aussi possible sur du matériel fixé dans le formol et non inclus en paraffine, et secondairement congelé. coloration du Rouge à l'huile : Mise en évidence de triglycérides (gouttelettes rouges) dans le cytoplasme d'hépatocytes (placmed41) PERMANGANATE-BLEU ALCIAN : mise en évidence des granules cytoplasmiques contenant des mucopolysaccharides sulfatés des mastocytes : coloration bleu foncée. permanganate-bleu alcian : Mastocytose cutanée. Les cytoplasmes des mastocytes sont colorés en bleu (placmed42) Coloration de GRAM : colore en bleu violet certaines bactéries Coloration de Gram : abcès à Nocardia (bactéries filamenteuses colorées en bleu violet) (placmed43) COLORATION DE ZIEHL-Nielsen : colore en rouge les mycobactéries (voir placmed44) (colore aussi certains schistosomes, et nocardioses (voir placmed45)). Coloration de Ziehl : mycobactéries colorées en rouge dans une tuberculose de la moelle hématopoïétique (placmed44) coloration de Ziehl : Bactéries du genre Nocardia Copyright AFECAP 28 (placmed45) Coloration de GIEMSA : permet l’étude des maladies hématologiques (voir placmed46 et placmed47) (bon contraste nucléaire, bonne définition de la chromatine et du nucléole et variabilité de coloration du cytoplasme selon les cellules) et la recherche de germes bactériens colorés en bleu. Coloration de Giemsa dans un ganglion lymphatique ; noter les mastocytes violets et les polynucléaires éosinophiles rouges (placmed46) Coloration de Giemsa dans un ganglion lymphatique; noter un mastocyte à cytoplasme violet à droite et un plasmocyte à cytoplasme basophile à gauche (placmed47) Coloration argentique de GROCOTT : colore en noir des champignons (voir placmed48) et des parasites (pneumocystis carinii). coloration de Grocott : aspergillus (placmed48) Coloration argentique de WHARTIN-STARRY : colore en noir certaines bactéries (dont Hélicobacter pylori) Coloration de Whartin-Starry : bactéries du genre Hélicobacter Pylori dans une crypte gastrique, colorées en noir (placmed49) 4.4. Immunohistochimie L'immunofluorescence directe sur coupe en congélation est une méthode très spécifique qui évite toutes les réactions non spécifiques dues à l'accrochage de l'Ac au récepteur du Fc des immunoglobulines, à condition d'utiliser l'Ac à la dilution optimale. Mais c'est une méthode peu sensible (pas d'amplification du signal) et qui nécessite d'utiliser des Ac couplés à un chromogène fluorescent (Fluorescéine, Rhodamine, Rouge Texas….). Intérêt : permet facilement les doubles marquages et évite les problèmes liés aux peroxydases endogènes. Le marquage est labile dans le temps : des milieux de montages spéciaux permettent d'éliminer l'effacement du marquage. Pour la révélation de l’immunohistochimie indirecte, les enzymes utilisées sont la peroxydase ou la phosphatase alcaline et les chromogènes sont le plus souvent la diaminobenzidine (réaction de couleur brune) ou l'aminoethylcarbazole (réaction de couleur rouge). Il existe dans la méthode Copyright AFECAP 29 immunoenzymatique indirecte un risque de marquage non spécifique par fixation de l'Ac secondaire sur le récepteur du Fc des immunoglobulines : ces sites de fixation non spécifique doivent donc être bloqués au cours de la technique. L’intensité du signal obtenu après marquage d’une réaction antigène-anticorps dépend du nombre de molécules colorées visibles. Plusieurs mécanismes d’amplification sont possibles, parmi lesquelles les méthodes à trois couches, d’autant que l’Ac intermédiaire divalent peut aussi servir à attacher un complexe réactif : peroxydase-antiperoxydase, avidine-biotine péroxydase (ou phosphatase alcaline) et streptavidine-biotine-peroxydase (voir placmed52). On peut multiplier le nombre de molécules réactives en les attachant à un polymère (voir placmed53)ou bien l'amplification peut être générée par la création d’un complexe qui multiplie les molécules d’enzyme attachées de façon non covalente à l’anticorps (tyramide). L’amplification peut être apportée par l’augmentation du temps d’incubation et aussi par le prétraitement des coupes déparaffinées par la chaleur ou des enzymes. Méthode immunoenzymatique de type streptavidine-biotine-peroxydase : 1) l'anticorps primaire (bleu) se fixe à l'antigène ; 2) l'anticorps secondaire (vert) se fixe à l'anticorps primaire et porte une molécule de biotine (flèche rouge) ; 3) la biotine fixe un complexe streptavidine-peroxydase (croix) (placmed52) Méthode immunoenzymatique avec amplification du signal par un polymère : 1) l'anticorps primaire (bleu) se fixe à l'antigène ; 2) l'anticorps secondaire (vert) se fixe à l'anticorps primaire et est couplé à un polymère inerte (ligne noire) qui porte plusieurs molécules d'anticorps secondaire et de peroxydase (placmed53) L'utilisation de tissus congelés ou de tissus fixés et inclus en paraffine comporte des avantages et inconvénients : • congélation : nécessité de disposer de tissus frais, d'un système de stockage (au moins à - 80 °C), de pratiquer des coupes au cryostat t; morphologie moins bien conservée que sur des coupes fixées et incluses dans la paraffine. L'intérêt majeur est de pouvoir visualiser des épitopes détruits par des procédés de fixation et d'inclusion. Néanmoins, les indications de l'immunohistochimie sur coupes à congélation tendent à diminuer, d'une part en raison de la fabrication de nouveaux Ac reconnaissant des épitopes résistants à la fixation, d'autres part grâce aux techniques de démasquage antigénique (micro-ondes, autocuiseur, bain-marie) et aux systèmes de révélation ultrasensibles. • tissus fixés inclus en paraffine : les avantages sont l'utilisation a posteriori quand le tissu a été fixé et la possibilité d'études rétrospectives (sur blocs ou sur lames) ainsi qu'une Copyright AFECAP 30 morphologie bien conservée. Mais certains épitopes sont détruits : pour y remédier, nécessité d'une bonne fixation (ni trop courte, ni trop longue). Le choix du fixateur est important (en règle préférer le formol tamponné), car certains épitopes sont détruits par certains fixateurs (alcooliques surtout) et l'éventuelle décalcification. Eviter les températures excessives au moment de l'inclusion et du séchage des lames. Nécessité pour de nombreux épitopes d'un démasquage antigénique (prétraitement qui permet de rompre les liaisons moléculaires créées par le fixateur et modifiant la configuration spatiale des épitopes et leur accessibilité aux antigènes) : digestion enzymatique ou plus souvent chauffage des coupes dans un tampon au four à micro-ondes, autocuiseur, ou bain-marie. 4.5. Aspects législatifs Les communications de comptes-rendus par télécopie ou par réseau informatique ne peuvent être utilisées que dans le cadre d'une procédure garantissant le secret médical. L'anatomo-pathologiste délègue au médecin traitant ayant en charge le patient le soin de lui apporter des informations explicatives sur les conclusions de l'examen anatomocytopathologique (article 35 du code de déontologie). Néanmoins, un patient peut demander une information directe émanant du pathologiste. Le patient peut aussi demander à avoir accès à son dossier médical (loi n° 2002-203 du 4 mars 2002 relative aux droits des malades et décret n°2002-637 du 29 avril 2002 relatif à l'accès aux informations personnelles détenues par les professionnels et les établissements de santé). La durée de l'archivage est de plusieurs années et est réglementée par le décret 88-280 du 24/03/1998 pour les pathologistes libéraux et l'arrêté du 11/03/1968 relatif aux archives hospitalières. Après des années, il est donc toujours possible de réexaminer des lames ou de confectionner de nouvelles lames à partir du bloc d’inclusion tant que le matériel tissulaire n’est pas épuisé par les coupes successives. Des diagnostics peuvent ainsi être précisés ou modifiés en raison de l’amélioration des connaissances et des techniques. 4.6. Collections de tissus cryopréservés Quoi qu'il en soit, la conservation des prélèvements cryopréservés nécessite une infrastructure lourde, notamment rapidité de congélation, contrôle de la qualité des prélèvements congelés, conservation de l'échantillon dans des conditions satisfaisantes. Des procédures de cryopréservation ont été élaborées en partenariat entre le Ministère de la Santé, l’HAS et la spécialité. L'utilisation de Copyright AFECAP 31 ces collections nécessite la conformité aux règles éthiques (information du patient, gestion du consentement, cf loi de Bioéthique de 2004), aux procédures d'assurance qualité et à la transparence des règles d'organisation, de fonctionnement et d'utilisation des prélèvements conservés. Les échantillons cellulaires ou tissulaires, cryopréservés ou non, ne peuvent être utilisés ou utilisables que s'ils sont associés à des informations cliniques sur le malade, des informations morphologiques concernant le diagnostic porté sur le prélèvement et des informations sur les échantillons (nature, quantité, conditions de collecte, de préparation, de conservation et d'utilisation). L’utilisation des échantillons est soumise à un comité de pilotage (chargé de la gestion de la tumorothèque), un conseil scientifique (avis sur les projets de recherche soumis) et un responsable de l'assurance qualité (organisation de la collecte, gestion de la collection, gestion des cessions). 4.7. Microscopie électronique Les principes de prélèvement, de fixation et d'inclusion sont les mêmes que ceux de la microscopie photonique. Cependant les prélèvement doivent être de petite taille (2 à 3 mm), des fixateurs spéciaux doivent être utilisés (glutaraldéhyde, puis acide osmique le plus souvent). Les prélèvements sont ensuite inclus dans une résine (épon) qui permet de pratiquer des coupes semifines (1micron) pour le repérage puis ultrafines (moins de 100 nm) déposées sur des grilles pour pouvoir être examinées. Le microscope électronique permet d'obtenir des grandissements très importants (2000 à 200 000 fois) et d’étudier les organites d’une cellule. Cette technique peut être couplée à des techniques d'immunohistochimie (avec des résines d'inclusion spéciales hydrophiles et des systèmes de révélation utilisant des billes d'or colloïdal denses aux électrons). 4.8. Microscopie confocale Le microscope confocal à balayage laser est un microscope à fluorescence dont le faisceau lumineux est généré par un laser. Un contrôle précis du plan focal de ce faisceau lumineux permet de réaliser des coupes virtuelles des objets à analyser. Les signaux transmis sont captés et numériser et un logiciel permet de reconstituer les images. Les intérêts de cette technique sont de pouvoir quantifier les intensités de marquage, de les localiser précisément dans l’espace et de pouvoir colocaliser des signaux en utilisant simultanément plusieurs fluorochromes. 4.9. Assurance qualité Copyright AFECAP 32 L’objectif de l’AFAQAP est de rédiger les protocoles méthodologiques et les documents de référence sur la bonne pratique, visant à améliorer et fiabiliser l’acte anatomo-cyto-pathologique, de sensibiliser la profession à l’importance de l’évaluation dans la pratique ACP en favorisant toute initiative visant l’amélioration de l’assurance qualité et d’offrir régulièrement à ses membres des évaluations dans le domaine du diagnostic, du déroulement technique des examens et du fonctionnement des structures, élaborées par des groupes de travail constitués d’experts spécialisés par thème. Contexte législatif L'évaluation individuelle des pratiques professionnelles, instituée par décret en décembre 1999, pour les praticiens exerçant en libéral, vise à améliorer la qualité des soins en permettant à chaque praticien de disposer d'une appréciation et de recommandations formulées par ses pairs, sur la qualité de ses pratiques en matière de prévention, de diagnostic et de thérapeutique. Dans la loi n°2004-810 du 13/8/04 relative à l'assurance maladie est annoncé la création de "la Haute Autorité de santé" et de "l'Institut des données sanitaires" chargés d'assurer la cohérence de la démarche d’AQ et de veiller à la qualité des systèmes d'information utilisés pour la gestion du risque maladie. Dans la loi est réaffirmée la nécessité d'une évaluation des pratiques professionnelles. De volontaire, elle devient obligatoire en exercice privé ou public avec "accréditation" des médecins ou d'équipes médicales exerçant en établissement de santé et "certification" des établissements de santé. 4.10. L’intégration des chirurgiens et le début de la médecine moderne Même si des chirurgiens avaient été célèbres et utiles aux monarques comme Ambroise Paré, ils n’avaient pu réussir à supprimer cette barrière. Ce fut la révolution française qui régla enfin cette question de façon définitive. Les Facultés de médecine furent fermées et la corporation des chirurgiens-barbiers comme les autres corporations, dissoutes en 1791. Il fallut cependant recréer une structure d’enseignement, et ce furent les Ecoles de Santé à Paris, Strasbourg et Montpellier. Les arguments anciens n’eurent alors plus cours et une nouvelle discipline s’établit alors avec des conséquences immédiates. Comment unir ceux qui soignaient avec des drogues et ceux qui enlevaient la maladie ? Il fallait forcément trouver une voie médiane au sein de cette cacophonie. Elle fut trouvée dans le développement de nouveaux moyens d’observation et de diagnostics. Les Copyright AFECAP 33 artisans initiaux de cette révolution scientifique qui gagna rapidement le reste de l’Europe et l’Amérique en furent principalement français. Ce furent Xavier Bichat (1771-1802), Gaspard Léon Bayle (1774-1816) et René Laennec (1781-1826) qui reçurent l’influence de Jean-Nicolas Corvisart (1755-1821) et Pierre Desault (1738-1895). Le mouvement naissant se manifesta tout d’abord par une nouvelle capacité à examiner et à observer. Les verrous qui empêchaient les dissections sautèrent et on put maintenant en faire à loisir. 4.11. Entre Bichat et Laennec François Broussais (1772-1838) se concentra essentiellement sur l’intestin et son inflammation et en fit la cause de toute pathologie. Médecin réputé du Val de Grâce, sa carrière fut d’abord glorieuse mais peu à peu son obstination à ne vouloir employer que saignées et sangsues se révéla particulièrement dangereuse. Il provoqua la mort de nombreux patients soit directement soit par son influence sur d’autres médecins de son époque, tel Guillaume Dupuytren, qui crurent à sa théorie. En 1808, Corvisart traduisit l’ouvrage d’Auenbrügger sur la percussion paru originellement en 1761. Son enseignement au lit du malade eu un grand succès et il influença durablement certains de ses élèves tel Bayle et Laennec. 4.12. Le Musée Dupuytren et l’histoire de l’anatomie pathologique Créé en 1835, grâce à un legs du Pr. Guillaume Dupuytren, le musée est intimement lié à l’histoire de la discipline. Le musée fut d’abord constitué par des cires anatomiques achetées dans différentes collections ce qui lui permet d’avoir des collections antérieures à sa création remontant au 18ème siècle. Au cours du 19ème siècle, la Société Anatomique y tint ses réunions et à l’occasion de cellesci de nombreuses pièces furent apportées pour y être présentées et conservées. Les collections osseuses s’agrandirent ainsi jusqu’aux années 1920 où les dernières pièces furent reçues. Le but du musée était originellement de réunir des spécimens des différentes lésions observées en pathologie humaine (et parfois animale) et de les conserver. Elles servaient alors de référence et d’illustration à une époque où n’existait pas encore la photographie. La réalisation de préparations en cire, dérivées des techniques italiennes antérieures, permit de conserver des dissections d’organe en gardant pour toujours les couleurs et l’apparence d’origine ce que la conservation de pièces en bocaux ne permettait pas de faire. Copyright AFECAP 34 L’avènement de la photographie contribua certainement à diminuer l’intérêt du musée pour la spécialité. Cependant au cours du 19ème siècle le musée attirait énormément de public notamment en fin de semaine où il était un des lieu de visite préféré des Parisiens. Le musée fut d’abord installé dans le réfectoire, vestige du Couvent des Cordeliers, et y resta un siècle. En 1935, devenu obsolète pour l’enseignement, mal entretenu et dangereux, il fut évacué vers les caves de la faculté sur décision de Gustave roussy, doyen de l’époque et professeur d’Anatomie Pathologique. En 1967, grâce aux efforts de René Abelanet, agrégé d’Anatomie Pathologique et de Jacques Delarue (1901-1971) titulaire de la Chaire, le musée fut réinstallé dans les locaux actuels. La direction du musée fut ensuite assurée par le Pr.Paul Prudhomme de Saint Maur jusqu’en aout 2004. Le conservateur actuel est le Dr. P Josset. Le musée Dupuytren se trouve actuellement à un moment crucial de son histoire, les motifs ayant présidé à sa création ayant disparu et la plupart des collections anatomiques se trouvant dans des situations muséologiques difficiles, il est souhaitable de donner au musée une orientation lui garantissant un avenir assuré. Les projets élaborés au musée pour les prochaines années, devraient permettre de créer un musée adapté à son siècle et en même temps profondément original. http://www.upmc.fr/cordeliers/dupuytren.htm
