u Auto-assemblage de protéines pour de l’électronique bio-inspirée u La nage bactérienne est modifiée à proximité des surfaces cellulaires Page 1 Page 2 ! u Caractériser le "protéovirulome" du staphylocoque doré ! ! u Cheminement du Cuivre dans le chloroplaste ! Inspirés par les architectures du vivant Page 2 Page 3 u Le chaînon manquant entre triades et microtubules GPC ! Page 3 Lettre scientifique n°53 - Novembre 2016 Auto-assemblage de protéines pour de l’électronique bio-inspirée Contact : Vincent Forge LCBM! Laboratoire Chimie et Biologie des Métaux UMR 5249 - UGA - CEA - CNRS Des chercheurs de l’équipe Amyloid Fibres: From Foldopathies to NanoDesign du laboratoire Chimie et Biologie des Métaux se sont inspirés de l’architecture de systèmes bactériens afin de développer un nanofil conducteur constitué uniquement de protéines. Afin de réaliser un tel matériau, ils avaient dans un premier temps étudié les mécanismes moléculaires de l’assemblage de deux protéines au sein de structures supraH 2O moléculaires afin de comprendre les mécanismes impliqués pour la conception rationnelle de nouveaux biomatériaux. Le nanofil qu’ils viennent de O2 concevoir est réalisé à partir d’une protéine chimère obtenue par des méthodes de biochimie. Cette protéine est constituée d’un domaine prion capable de s’autoassembler sous forme de fibres amyloïdes, sur lequel est greffé une protéine dont la fonction est le transport d’électrons (une rubrédoxine) (Figure). Le domaine prion choisi appartient à la famille des prions fonctionnels, c’est-à-dire non impliqué dans une maladie et possédant un rôle fonctionnel dans l’organisme dont il est issu (ici un champignon filamenteux). La présence du domaine prion permet la formation d’une fibre par auto-assemblage. Cette nano-fibre expose alors à sa surface des rubrédoxines suffisamment proches les unes des autres (moins de 1 nm) pour transporter les électrons d’un bout à l’autre de la fibre, par sauts successifs. La conductivité et le mode de transfert des électrons ont en effet été mis en évidence par électrochimie. Les chercheurs ont montré que les nanofils protéiques qu’ils ont synthétisés permettent le transport d’électrons entre une électrode de carbone vitreux et une enzyme (la lactase) sur une distance de plusieurs micromètres (Figure), à l’image de ce qui est observé pour les nanofils bactériens qui permettent l’échange d’électrons entre le milieu extérieur et des enzymes au sein de la bactérie. Ces nouveaux types de nanofils ouvrent la voie au développement d’une électronique biocompatible et biodégradable, pouvant être intégrée dans de l’électronique jetable ou dans des dispositifs médicaux, comme par exemple des bio-capteurs ou des bio-piles. eeeee- Électrode Le transport des électrons par des protéines est un mécanisme central de la vie, impliqué notamment dans la production, le stockage et l'utilisation de l'énergie dans de nombreux processus biologiques. La découverte récente de conduction dans des nanofils bactériens connectés à des électrodes permet d’envisager le développement d’une électronique basée sur les protéines. Cependant, la constitution en protéine, la structure et le mode de transport électronique de ces nanofils « naturels » sont encore loin d’être connus, ce qui bloque leur utilisation directe en bioélectronique. Schéma de fonctionnement d’un nanofil conducteur. Ce nanofil est un polymère d’une protéine chimérique ayant la double propriété de s’auto-assembler sous forme d’une fibre grâce à l’un de ses domaine, et de transférer des électrons via un second domaine protéique. Un tel nanofil conducteur permet le transport d’électrons sur plusieurs micromètres, d’une électrode de carbone vitreux vers une enzyme. Référence! Altamura L, Horvath C, Rengaraj S, Rongier A, Elouarzaki K, Gondran C, Maçon ALB, Vendrely C, Bouchiat V, Fontecave M, Mariolle D, Rannou P, Le Goff A, Duraffourg N, Holzinger M and Forge V. A synthetic redox biofilm made from metalloprotein–prion domain chimera nanowires. Nature Chemistry, 2016 La nage bactérienne est modifiée à proximité des surfaces cellulaires La nage bactérienne est rendue possible grâce aux mouvements giratoires d'un ou plusieurs flagelles localisés à un pôle cellulaire. La vitesse atteinte est considérable pour une cellule de cette taille : 50 μm/s, soit 18 cm/h, pour la bactérie Pseudomonas aeruginosa, ce qui lui permet de balayer des surfaces importantes à la recherche d'opportunités nutritives ou infectieuses. Il est essentiel de caractériser les paramètres physiques et biologiques régissant la nage bactérienne au voisinage de surfaces abiotiques ou biologiques afin de comprendre les étapes préalables à la colonisation de l'organisme. Contact : Philippe Huber BCI Laboratoire Biologie du Cancer et de l'Infection UMR_S 1036 - CEA - Inserm - UGA Le flagelle des bactéries est un long appendice ancré dans la membrane bactérienne. Des protéines motrices, localisées à sa base, induisent sa rotation ; les deux sens de rotation du flagelle sont possibles, permettant à la bactérie d’avancer (propulsion) ou de reculer (traction). La nage près de surfaces induit un moment de force sur le corps de la bactérie qui provoque la courbure de la trajectoire. Ceci permet à la bactérie d'employer plusieurs modes de nage. L'équipe Pathogenèse Bactérienne et Réponses Cellulaires du laboratoire Biologie du Cancer et de l’Infection, en collaboration avec une équipe de biophysiciens de l'ENS-Lyon (dirigée par Laurence Lemelle ; laboratoire Joliot-Curie), a mis en évidence trois types de trajectoires chez la bactérie P. aeruginosa lorsqu’elle nage à proximité de surfaces. Les chercheurs ont montré que ces trajectoires sont caractérisées par des vitesses, des courbures, des modes de motilité (linéaire, courbe ou des pauses) et des fréquences de transition entre ces différents modes qui sont spécifiques aux trois types de trajectoires. Les bactéries utilisent ces trois trajectoires à proximité de surface abiotique (verre) ou cellulaire (cellules confluentes), mais les trajectoires lentes sont favorisées à proximité des cellules. Les chercheurs ont montré que cette préférence est due à la présence d'autres filaments bactériens appelés pili. Ces filaments sont capables d'interagir avec les surfaces solides de façon non spécifique ou grâce à des récepteurs membranaires. Lorsque les bactéries sont dépourvues de pili, la nage lente n'est plus favorisée, ce qui suggère une interaction transitoire entre pili et récepteurs cellulaires. P. aeruginosa emploie des types de trajectoire différents pour balayer finement ou au contraire pour parcourir rapidement de grandes distances. Ce choix est influencé par le type de surface rencontré. Les bactéries dépourvues de flagelle s’avèrent être beaucoup moins infectieuses dans différents modèles d'infection in vivo. Des leurres chimiotactiques pourraient être utilisés pour brouiller les informations, empêcher la nage directionnelle et potentiellement limiter le potentiel infectieux des bactéries pathogènes. Trajectoires bactériennes sur cellules. Enregistrement pendant 10 s de bactéries-GFP à proximité de cellules confluentes (noyaux en bleu). Référence! Golovkine G, Lemelle L, Burny C, Vaillant C, Palierne JF, Place C and Huber P. Host cell surfaces induce a type IV pilidependent alteration of bacterial swimming. Scientific Reports, 2016 Caractériser le protéo-virulome du staphylocoque doré Le staphylocoque doré est une bactérie commensale ou pathogène, pouvant provoquer des maladies de sévérité variable chez L’Homme. Lors de la prise en charge d’une infection staphylococcique, la souche bactérienne est isolée à partir de prélèvements biologiques, puis identifiée. Un antibiogramme est alors réalisé, et les gènes codant pour certains facteurs de virulence sont recherchés. Cependant, dans certaines situations médicales, la mise en évidence des gènes de virulence n’est parfois pas possible ou reste insuffisante. C’est le cas notamment des toxi-infections staphylococciques (toxi-infections alimentaires, choc toxique) où la maladie résulte de l’action de toxines alors que la souche bactérienne peut ne plus être présente dans l’échantillon analysé. Dans ce type de pathologie, la mise en évidence directe des toxines, et non des gènes qui codent ces toxines, est nécessaire. Contact : Virginie Brun BGE Laboratoire Biologie à Grande Échelle UMR_S 1036 - CEA - Inserm - UGA Des méthodes basées sur l’utilisation d’anticorps existent pour détecter certaines toxines staphylococciques. Cependant, ces toxines sont nombreuses et parfois très proches sur le plan structural. C’est pour cela que les chercheurs de l’équipe Étude de la Dynamique des Protéomes du laboratoire Biologie à Grande Échelle ont recours à l’analyse par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide (LC-MS) pour leur détection. Cette approche présente une excellente spécificité qui permet de discriminer des toxines aux séquences en acides aminés très proches, et surtout une capacité de multiplexage (analyse simultanée de plusieurs toxines) qui autorise la caractérisation du "protéo-virulome" bactérien en une seule et unique analyse. L’exploration par LC-MS du "protéo-virulome" permet à cette équipe d’améliorer la connaissance de la virulence du staphylocoque doré [1-4]. Ainsi, en collaboration avec le centre national de référence des staphylocoques, les chercheurs étudient la régulation de l’expression de ces toxines dans certaines pathologies comme le choc toxique. Dans le domaine de la sécurité alimentaire, les efforts de développement de ces chercheurs ont abouti à une méthode permettant de cribler les 8 entérotoxines les plus couramment impliquées dans les épisodes de toxiinfections alimentaires collectives [2]. Enfin, dans le domaine des risques nucléaires, radiologiques, biologiques et chimiques, cette équipe a récemment développé une méthode d’analyse sensible et multiplexée permettant de détecter dans une matrice alimentaire 8 toxines de la menace NRBC : 3 entérotoxines staphylococciques, les shigatoxines STX1 et STX2 d’Escherichia coli entérohémorragique, la toxine epsilon de Clostridium perfringens, la toxine CDT de Campylobacter jejuni et la ricine. Cette méthode peut être utilisée pour détecter la contamination malveillante de produits alimentaires par des toxines bactériennes ; ouvre également de nouvelles perspectives dans le domaine de la sécurité alimentaire [4]. Références! Adrait et al. Journal of Proteomics, 2012 Picard et al. Journal of Mass Spectrometry, 2012 [3] Dupré et al. Analytical Chemistry, 2015 [4] Gilquin B, Jaquinod M, Louwagie M, Kieffer-Jaquinod S, Kraut A, Ferro M, Becher F and Brun V. A proteomics assay to detect 8 CBRN-relevant toxins in food. Proteomics, 2016 [1] [2] Cheminement du Cuivre dans le chloroplaste Le cuivre est un métal de transition essentiel au fonctionnement des organismes vivants. Chez la plante Arabidopsis thaliana, la moitié du contenu en cuivre est localisée dans le chloroplaste, majoritairement associée à la superoxide dismutase à cuivre du stroma et à la plastocyanine du lumen des thylacoïdes. Chez les plantes, le cuivre joue un r ô l e c l é d a n s l e s p ro c e s s u s photosynthétiques où il constitue le centre redox de la plastocyanine nécessaire au transfert des électrons photosynthétiques. La plastocyanine étant indispensable à la plante, l’adressage du cuivre aux chloroplastes puis aux thylacoïdes est donc une priorité pour la cellule. Chez Arabidopsis, l'adressage du cuivre du cytosol au stroma du chloroplaste puis au lumen des thylacoïdes implique deux protéines membranaires appartenant à la famille des ATPases-PIB-1 : HMA6, localisée dans l’enveloppe du chloroplaste et HMA8, localisée dans la membrane des thylacoïdes. En 2011, la première étude biochimique d’une ATPase-Cu+ de plante a été réalisée par les équipes D-Phy-Chloro (laboratoire Physiologie Cellulaire & Végétale) et BioMet (laboratoire Chimie et Biologie des Métaux). Cette étude a permis de déterminer les caractéristiques enzymatiques de HMA6 [1]. Dans la continuité de ce travail, la caracté- Cu Site d’entrée Contacts : Daphné Seigneurin-Berny LPCV! Laboratoire Physiologie Cellulaire & Végétale UMR 5168 - CEA - CNRS - UGA - Inra Patrice Catty LCBM ! Laboratoire Chimie et Biologie des Métaux UMR 5249 - UGA - CEA - CNRS Références! [2] C161 H165 Enveloppe Cytosol L1 Stroma Catty et al. Journal of Biological Chemistry, 2011 Sautron et al. Bioscience Report, 2015 [3] Mayerhofer et al. Structural insights into the NucleotideBinding Domains of the P1B-type ATPases HMA6 and HMA8 from Arabidopsis thaliana. PLoS One, 2016 [4] Sautron et al. Identification of two conserved residues involved in copper release from chloroplast PIB-1-ATPases. Journal of Biological Chemistry, 2016 [1] HMA6 Cu risation d’HMA8 a révélé des différences significatives entre les propriétés enzymatiques des deux transporteurs [2]. Plus récemment, en collaboration avec l’équipe Membrane Transporters de l’IBS, les structures cristallographiques des domaines de liaison des nucléotides de HMA6 et HMA8 ont été résolues [3]. Dans le dernier volet de leur étude, les équipes D-PhyChloro, BioMet et MCT (laboratoire Chimie et Biologie des Métaux) se sont intéressées au cheminement du cuivre à l’intérieur de HMA6 et HMA8, et plus particulièrement à l’étape de libération du métal. Une analyse phylogénétique détaillée sur plus de 100 séquences d’ATPase-Cu+ a permis d’identifier une séquence conservée Cys-X3-His-X2-His, spécifique de la boucle L1 des ATPases-Cu+ chloroplastiques (Figure). La combinaison de tests phénotypiques en levure et de cinétiques enzymatiques sur des mutants d’HMA6 et d’HMA8 produits dans la bactérie Lactococcus lactis a révélé le rôle essentiel du motif Cys-X3-His dans le fonctionnement des deux transporteurs. À l’aide de modèles 3D, cette étude a permis de proposer un modèle de cheminement du cuivre à l’intérieur des domaines membranaires de HMA6 et HMA8 [4]. Site de relargage H168 Cu Modèle du transport du cuivre au niveau du domaine membranaire de l'ATPase-Cu+ HMA6. Les résidus cystéines et histidines de la boucle L1 identifiés et caractérisés biochimiquement dans cette étude sont colorés en rouge. Ils sont nécessaires à la libération du métal. Le chaînon manquant entre triades et microtubules La contraction musculaire est provoquée par un relâchement massif de calcium à l’intérieur des cellules musculaires, au niveau de structures membranaires appelées triades. Bien que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation et le maintien des triades soient encore mal connus, deux acteurs au moins ont été identifiés : la triadine, une protéine impliquée dans le contrôle de la forme des triades, capable de lier de façon indirecte les microtubules [1] ; les microtubules, dont l’organisation sous forme de quadrillage fibrillaire très structuré dans les cellules musculaires (Figure), laisse penser qu’ils pourraient être impliqués dans le maintien et l’organisation des triades. Étant donné le lien indirect qui existe entre triadine et microtubules, trouver le chaînon manquant entre ces deux acteurs moléculaires de la contraction musculaire représentait un réel enjeu. Contact : Anne Fourest-Lieuvin GPC Groupe Physiopathologie du Cytosquelette UMR_S 1216 Inserm/UGA/CEA/CHU équipe 1 Des chercheurs de l’Institut des Neurosciences de Grenoble (équipe Myologie Cellulaire et Pathologies) et de notre institut (Groupe Physiopathologie du Cytosquelette et laboratoire Biologie à Grande Échelle) viennent d’identifier et de caractériser la protéine CLIMP-63 comme étant ce chaînon [2] et démontrent pour la première fois son rôle dans le muscle squelettique. Ainsi, CLIMP-63 est non seulement localisée dans plusieurs compartiments membranaires, dont les triades, mais est de plus capable de se lier directement aux microtubules. L’implication directe de cette protéine a été renforcée lorsque les chercheurs ont observé une désorganisation du réseau microtubulaire après avoir introduit une forme mutante de CLIMP-63 dans le muscle de souris. En démontrant le rôle essentiel du trio triadine-CLIMPmicrotubules dans la physiologie des cellules musculaires, cette étude ouvre la voie vers une meilleure compréhension de certaines pathologies humaines. En effet, des variations génétiques humaines de la triadine sont responsables de pathologies cardiaques sévères et de myopathies [3]. Étant donné le lien fort existant entre triadine et CLIMP-63, il est probable que des variants génétiques de la protéine CLIMP-63 humaine sont également à l’origine de pathologies musculaires ou cardiaques. Ces variants de CLIMP-63 restent à identifier. Cellule musculaire en microscopie confocale. Les microtubules forment un quadrillage (en vert) qui jouxte très souvent les triades (en rouge). Un des noyaux de la cellule est marqué en bleu. Références! [1] Fourest-Lieuvin et al. Journal of Cell Science, 2012 Osseni A, Sébastien M, Sarrault O, Baudet M, Coute Y, Faure J, Fourest-Lieuvin A and Marty I. Triadin and CLIMP-63 form a link between triads and microtubules in muscle cells. Journal of Cell Science, 2016 [3] Roux-Buisson et al. Human Molecular Genetics, 2012 [2] 20 µm Les laboratoires Directeur de la publication ! Jérôme Garin BCI CBM GPC Biologie du Cancer et de l'Infection Chimie et Biologie des Métaux UMR_S 1036 CEA/Inserm/UGA UMR 5249 CEA/CNRS/UGA Groupe Physiopathologie du Cytosquelette Biologie à Grande Échelle Physiologie Cellulaire & Végétale BGE UMR_S 1038 CEA/Inserm/UGA ! PCV BIG et UMR_S 1216 UGA/Inserm/CEA/CHU UMR 5168 CEA/CNRS/UGA/Inra © CEA [2016]. Tous droits réservés. Toute reproduction totale ou partielle sur quelque support que ce soit ou utilisation du contenu de ce document est interdite sans l’autorisation écrite préalable du CEA Éditeur et format électronique ! Pascal Martinez — [email protected] Comité de rédaction! Virginie Brun, Patrice Catty, Vincent Forge, Anne Fourest-Lieuvin, Philippe Huber, Daphné Seigneurin-Berny. ! 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