Auto-assemblage de protéines pour de l`électronique bio

Auto-assemblage de protéines pour de l’électronique
bio-inspirée
Le transport des électrons par des
protéines est un mécanisme central
de la vie, impliqué notamment dans
la production, le stockage et
l'utilisation de l'énergie dans de
nombreux processus biologiques.
La découverte récente de
conduction dans des nanofils
bactériens connectés à des
électrodes permet d’envisager le
développement d’une électronique
basée sur les protéines.
Cependant, la constitution en
protéine, la structure et le mode de
transport électronique de ces
nanofils «!naturels!» sont encore
loin d’être connus, ce qui bloque
leur utilisation directe en bio-
électronique.
Des chercheurs de l’équipe Amyloid Fibres: From
Foldopathies to NanoDesign du laboratoire Chimie et
Biologie des Métaux se sont inspirés de l’architecture
de systèmes bactériens afin de développer un nanofil
conducteur constitué uniquement de protéines."
Afin de réaliser un tel matériau, ils avaient dans un
premier temps étudié les mécanismes moléculaires de
l’assemblage de deux protéines au
sein de structures supra-
moléculaires afin de comprendre
les mécanismes impliqués pour la
conception rationnelle de
nouveaux biomatériaux."
Le nanofil qu’ils viennent de
concevoir est réalisé à partir d’une
protéine chimère obtenue par des
méthodes de biochimie. Cette protéine est
constituée d’un domaine prion capable de s’auto-
assembler sous forme de fibres amyloïdes, sur lequel
est greffé une protéine dont la fonction est le transport
d’électrons (une rubrédoxine) (Figure). Le domaine
prion choisi appartient à la famille des prions
fonctionnels, c’est-à-dire non impliqué dans une
maladie et possédant un rôle fonctionnel dans
l’organisme dont il est issu (ici un champignon
filamenteux). La présence du domaine prion permet la
formation d’une fibre par auto-assemblage. Cette
nano-fibre expose alors à sa surface des rubrédoxines
suffisamment proches les unes des autres (moins de
1!nm) pour transporter les électrons d’un bout à l’autre
de la fibre, par sauts successifs. La conductivité et le
mode de transfert des électrons ont en effet été mis en
évidence par électrochimie. Les chercheurs ont montré
que les nanofils protéiques qu’ils ont synthétisés
permettent le transport d’électrons entre une électrode
de carbone vitreux et une enzyme (la lactase) sur une
distance de plusieurs micromètres (Figure), à l’image
de ce qui est observé pour les nanofils bactériens qui
permettent l’échange d’électrons entre le milieu
extérieur et des enzymes au sein de la bactérie."
Ces nouveaux types de nanofils ouvrent la voie au
développement d’une électronique biocompatible et
biodégradable, pouvant être intégrée dans de
l’électronique jetable ou dans des dispositifs
médicaux, comme par exemple des bio-capteurs ou
des bio-piles."
Contact : Vincent Forge !
LCBM!
Laboratoire Chimie et Biologie des Métaux!
UMR 5249 - UGA - CEA - CNRS
Schéma de fonctionnement d’un nanofil conducteur.!
Ce nanofil est un polymère d’une protéine chimérique ayant la double
propriété de s’auto-assembler sous forme d’une fibre grâce à l’un de ses
domaine, et de transférer des électrons via un second domaine protéique.
Un tel nanofil conducteur permet le transport d’électrons sur plusieurs
micromètres, d’une électrode de carbone vitreux vers une enzyme.
Lettre scientifique n°53 - Novembre 2016
Inspirés par les architectures du vivant
u Cheminement du Cuivre
dans le chloroplaste%
!
!
Page 3
u Auto-assemblage de
protéines pour de
l’électronique bio-inspirée%
!
Page 1
u Caractériser le "protéo-
virulome" du staphylocoque
doré%
!
Page 2
u La nage bactérienne est
modifiée à proximité des
surfaces cellulaires%
!
Page 2
Référence!
Altamura L, Horvath C, Rengaraj S, Rongier A, Elouarzaki K,
Gondran C, Maçon ALB, Vendrely C, Bouchiat V, Fontecave M,
Mariolle D, Rannou P, Le Goff A, Duraffourg N, Holzinger M
and Forge V. A synthetic redox biofilm made from
metalloprotein–prion domain chimera nanowires. Nature
Chemistry, 2016
e-
Électrode
e-
e-
e-
e-
O2
H2O
u Le chaînon manquant entre
triades et microtubules%
!
!
Page 3
GPC

La nage bactérienne est rendue
possible grâce aux mouvements
giratoires d'un ou plusieurs flagelles
localisés à un pôle cellulaire. La
vitesse atteinte est considérable
pour une cellule de cette taille!: 50
μm/s, soit 18 cm/h, pour la bactérie
Pseudomonas aeruginosa, ce qui lui
permet de balayer des surfaces
importantes à la recherche
d'opportunités nutritives ou
infectieuses. Il est essentiel de
caractériser les paramètres
physiques et biologiques régissant
la nage bactérienne au voisinage de
surfaces abiotiques ou biologiques
afin de comprendre les étapes
préalables à la colonisation de
l'organisme.
La nage bactérienne est modifiée à proximité des
surfaces cellulaires
Le flagelle des bactéries est un long appendice ancré
dans la membrane bactérienne. Des protéines
motrices, localisées à sa base, induisent sa rotation!;
les deux sens de rotation du flagelle sont possibles,
permettant à la bactérie d’avancer (propulsion) ou de
reculer (traction). La nage près de surfaces induit un
moment de force sur le corps de la bactérie qui
provoque la courbure de la trajectoire. Ceci permet à la
bactérie d'employer plusieurs modes de nage.
L'équipe Pathogenèse Bactérienne et Réponses
Cellulaires du laboratoire Biologie du Cancer et de
l’Infection, en collaboration avec une équipe de
biophysiciens de l'ENS-Lyon (dirigée par Laurence
Lemelle ; laboratoire Joliot-Curie), a mis en évidence
trois types de trajectoires chez la bactérie P.
aeruginosa lorsqu’elle nage à proximité de surfaces.
Les chercheurs ont montré que ces trajectoires sont
caractérisées par des vitesses, des courbures, des
modes de motilité (linéaire, courbe ou des pauses) et
des fréquences de transition entre ces différents
modes qui sont spécifiques aux trois types de
trajectoires. Les bactéries utilisent ces trois trajectoires
à proximité de surface abiotique (verre) ou cellulaire
(cellules confluentes), mais les trajectoires lentes sont
favorisées à proximité des cellules. Les chercheurs ont
montré que cette préférence est due à la présence
d'autres filaments bactériens appelés pili. Ces
filaments sont capables d'interagir avec les surfaces
solides de façon non spécifique ou grâce à des
récepteurs membranaires. Lorsque les bactéries sont
dépourvues de pili, la nage lente n'est plus favorisée,
ce qui suggère une interaction transitoire entre pili et
récepteurs cellulaires."
P. aeruginosa emploie des types de trajectoire
différents pour balayer finement ou au contraire pour
parcourir rapidement de grandes distances. Ce choix
est influencé par le type de surface rencontré. Les
bactéries dépourvues de flagelle s’avèrent être
beaucoup moins infectieuses dans différents modèles
d'infection in vivo.%
Des leurres chimiotactiques pourraient être utilisés
pour brouiller les informations, empêcher la nage
directionnelle et potentiellement limiter le potentiel
infectieux des bactéries pathogènes."
Référence!
Golovkine G, Lemelle L, Burny C, Vaillant C, Palierne JF,
Place C and Huber P. Host cell surfaces induce a type IV pili-
dependent alteration of bacterial swimming. Scientific
Reports, 2016
Trajectoires bactériennes sur cellules. Enregistrement pendant 10 s de
bactéries-GFP à proximité de cellules confluentes (noyaux en bleu).
Contact : Philippe Huber !
BCI!
Laboratoire Biologie du Cancer et de l'Infection!
UMR_S 1036 - CEA - Inserm - UGA
Caractériser le protéo-virulome du staphylocoque doré
Le staphylocoque doré est une
bactérie commensale ou pathogène,
pouvant provoquer des maladies de
sévérité variable chez L’Homme. Lors
de la prise en charge d’une infection
staphylococcique, la souche
bactérienne est isolée à partir de
prélèvements biologiques, puis
identifiée. Un antibiogramme est alors
réalisé, et les gènes codant pour
certains facteurs de virulence sont
recherchés. Cependant, dans
certaines situations médicales, la
mise en évidence des gènes de
virulence n’est parfois pas possible
ou reste insuffisante. C’est le cas
notamment des toxi-infections
staphylococciques (toxi-infections
alimentaires, choc toxique) où la
maladie résulte de l’action de toxines
alors que la souche bactérienne peut
ne plus être présente dans
l’échantillon analysé. Dans ce type de
pathologie, la mise en évidence
directe des toxines, et non des gènes
qui codent ces toxines, est
nécessaire.
Contact : Virginie Brun !
BGE !
Laboratoire Biologie à Grande Échelle !
UMR_S 1036 - CEA - Inserm - UGA
Références!
[1] Adrait et al. Journal of Proteomics, 2012!
[2] Picard et al. Journal of Mass Spectrometry, 2012!
[3] Dupré et al. Analytical Chemistry, 2015!
[4] Gilquin B, Jaquinod M, Louwagie M, Kieffer-Jaquinod S,
Kraut A, Ferro M, Becher F and Brun V. A proteomics assay to
detect 8 CBRN-relevant toxins in food. Proteomics, 2016
Des méthodes basées sur l’utilisation d’anticorps
existent pour détecter certaines toxines
staphylococciques. Cependant, ces toxines sont
nombreuses et parfois très proches sur le plan
structural. C’est pour cela que les chercheurs de
l’équipe Étude de la Dynamique des Protéomes du
laboratoire Biologie à Grande Échelle ont recours à
l’analyse par spectrométrie de masse couplée à la
chromatographie liquide (LC-MS) pour leur détection.
Cette approche présente une excellente spécificité qui
permet de discriminer des toxines aux séquences en
acides aminés très proches, et surtout une capacité de
multiplexage (analyse simultanée de plusieurs toxines)
qui autorise la caractérisation du "protéo-virulome"
bactérien en une seule et unique analyse."
L’exploration par LC-MS du "protéo-virulome" permet
à cette équipe d’améliorer la connaissance de la
virulence du staphylocoque doré![1-4]. Ainsi, en
collaboration avec le centre national de référence des
staphylocoques, les chercheurs étudient la régulation
de l’expression de ces toxines dans certaines
pathologies comme le choc toxique. Dans le domaine
de la sécurité alimentaire, les efforts de développement
de ces chercheurs ont abouti à une méthode
permettant de cribler les 8 entérotoxines les plus
couramment impliquées dans les épisodes de toxi-
infections alimentaires collectives![2]."
Enfin, dans le domaine des risques nucléaires,
radiologiques, biologiques et chimiques, cette équipe a
récemment développé une méthode d’analyse sensible
et multiplexée permettant de détecter dans une
matrice alimentaire 8 toxines de la menace NRBC!: 3
entérotoxines staphylococciques, les shigatoxines
STX1 et STX2 d’Escherichia coli entérohémorragique,
la toxine epsilon de Clostridium perfringens, la toxine
CDT de Campylobacter jejuni et la ricine."
Cette méthode peut être utilisée pour détecter la
contamination malveillante de produits alimentaires par
des toxines bactériennes ; ouvre également de
nouvelles perspectives dans le domaine de la sécurité
alimentaire![4].

La contraction musculaire est
provoquée par un relâchement
massif de calcium à l’intérieur des
cellules musculaires, au niveau de
structures membranaires appelées
triades. Bien que les mécanismes
moléculaires impliqués dans la
formation et le maintien des triades
soient encore mal connus, deux
acteurs au moins ont été identifiés!:
la triadine, une protéine impliquée
dans le contrôle de la forme des
triades, capable de lier de façon
indirecte les microtubules![1] ; les
microtubules, dont l’organisation
sous forme de quadrillage fibrillaire
très structuré dans les cellules
musculaires (Figure), laisse penser
qu’ils pourraient être impliqués dans
le maintien et l’organisation des
triades.%
Étant donné le lien indirect qui
existe entre triadine et microtubules,
trouver le chaînon manquant entre
ces deux acteurs moléculaires de la
contraction musculaire représentait
un réel enjeu.
Le chaînon manquant entre triades et microtubules
Des chercheurs de l’Institut des Neurosciences de
Grenoble (équipe Myologie Cellulaire et Pathologies) et
de notre institut (Groupe Physiopathologie du
Cytosquelette et laboratoire Biologie à Grande Échelle)
viennent d’identifier et de caractériser la protéine
CLIMP-63 comme étant ce chaînon![2] et démontrent
pour la première fois son rôle dans le muscle
squelettique. Ainsi, CLIMP-63 est non seulement
localisée dans plusieurs compartiments membranaires,
dont les triades, mais est de plus capable de se lier
directement aux microtubules. L’implication directe de
cette protéine a été renforcée lorsque les chercheurs
ont observé une désorganisation du réseau
microtubulaire après avoir introduit une forme mutante
de CLIMP-63 dans le muscle de souris."
En démontrant le rôle essentiel du trio triadine-CLIMP-
microtubules dans la physiologie des cellules
musculaires, cette étude ouvre la voie vers une
meilleure compréhension de certaines pathologies
humaines. En effet, des variations génétiques
humaines de la triadine sont responsables de
pathologies cardiaques sévères et de myopathies![3].
Étant donné le lien fort existant entre triadine et
CLIMP-63, il est probable que des variants génétiques
de la protéine CLIMP-63 humaine sont également à
l’origine de pathologies musculaires ou cardiaques.
Ces variants de CLIMP-63 restent à identifier.
Contact : Anne Fourest-Lieuvin !
GPC!
Groupe Physiopathologie du Cytosquelette!
UMR_S 1216 Inserm/UGA/CEA/CHU équipe 1
Références!
[1] Fourest-Lieuvin et al. Journal of Cell Science, 2012!
[2] Osseni A, Sébastien M, Sarrault O, Baudet M, Coute Y,
Faure J, Fourest-Lieuvin A and Marty I. Triadin and
CLIMP-63 form a link between triads and microtubules in
muscle cells. Journal of Cell Science, 2016!
[3] Roux-Buisson et al. Human Molecular Genetics, 2012
Cellule musculaire en microscopie confocale. Les microtubules forment
un quadrillage (en vert) qui jouxte très souvent les triades (en rouge).
Un des noyaux de la cellule est marqué en bleu.
20 µm
Le cuivre est un métal de transition
essentiel au fonctionnement des
organismes vivants. Chez la plante
Arabidopsis thaliana, la moitié du
contenu en cuivre est localisée dans
le chloroplaste, majoritairement
associée à la superoxide dismutase
à cuivre du stroma et à la plasto-
cyanine du lumen des thylacoïdes.
Chez les plantes, le cuivre joue un
rôle clé dans les processus
photosynthétiques où il constitue le
centre redox de la plastocyanine
nécessaire au transfert des
électrons photosynthétiques. La
plastocyanine étant indispensable à
la plante, l’adressage du cuivre aux
chloroplastes puis aux thylacoïdes
est donc une priorité pour la cellule.
Chez Arabidopsis, l'adressage du cuivre du cytosol au
stroma du chloroplaste puis au lumen des thylacoïdes
implique deux protéines membranaires appartenant à
la famille des ATPases-PIB-1!: HMA6, localisée dans
l’enveloppe du chloroplaste et HMA8, localisée dans la
membrane des thylacoïdes. En 2011, la première étude
biochimique d’une ATPase-Cu+ de plante a été réalisée
par les équipes D-Phy-Chloro (laboratoire Physiologie
Cellulaire & Végétale) et BioMet (laboratoire Chimie et
Biologie des Métaux). Cette étude a permis de
déterminer les caractéristiques enzymatiques de
HMA6![1]. Dans la continuité de ce travail, la caracté-
risation d’HMA8 a révélé des différences significatives
entre les propriétés enzymatiques des deux
transporteurs![2]. Plus récemment, en collaboration
avec l’équipe Membrane Transporters de l’IBS, les
structures cristallographiques des domaines de liaison
des nucléotides de HMA6 et HMA8 ont été résolues![3].
Dans le dernier volet de leur étude, les équipes D-Phy-
Chloro, BioMet et MCT (laboratoire Chimie et Biologie
des Métaux) se sont intéressées au cheminement du
cuivre à l’intérieur de HMA6 et HMA8, et plus
particulièrement à l’étape de libération du métal. Une
analyse phylogénétique détaillée sur plus de 100
séquences d’ATPase-Cu+ a permis d’identifier une
séquence conservée Cys-X3-His-X2-His, spécifique
de la boucle L1 des ATPases-Cu+ chloroplastiques
(Figure). La combinaison de tests phénotypiques en
levure et de cinétiques enzymatiques sur des mutants
d’HMA6 et d’HMA8 produits dans la bactérie
Lactococcus lactis a révélé le rôle essentiel du motif
Cys-X3-His dans le fonctionnement des deux
transporteurs. À l’aide de modèles 3D, cette étude a
permis de proposer un modèle de cheminement du
cuivre à l’intérieur des domaines membranaires de
HMA6 et HMA8![4].
Références!
[1] Catty et al. Journal of Biological Chemistry, 2011!
[2] Sautron et al. Bioscience Report, 2015!
[3] Mayerhofer et al. Structural insights into the Nucleotide-
Binding Domains of the P1B-type ATPases HMA6 and HMA8
from Arabidopsis thaliana. PLoS One, 2016!
[4] Sautron et al. Identification of two conserved residues
involved in copper release from chloroplast PIB-1-ATPases.
Journal of Biological Chemistry, 2016
Modèle du transport du cuivre au niveau du domaine membranaire
de l'ATPase-Cu+ HMA6. Les résidus cystéines et histidines de la
boucle L1 identifiés et caractérisés biochimiquement dans cette étude
sont colorés en rouge. Ils sont nécessaires à la libération du métal.
Cheminement du Cuivre dans le chloroplaste
Contacts : Daphné Seigneurin-Berny LPCV!
Laboratoire Physiologie Cellulaire & Végétale!
UMR 5168 - CEA - CNRS - UGA - Inra!
Patrice Catty LCBM !
Laboratoire Chimie et Biologie des Métaux!
UMR 5249 - UGA - CEA - CNRS
Site de!
relargage
Cu
Cu
Site!
d’entrée
C161
H165
H168
Cytosol
Enveloppe
Stroma
L1
Cu
HMA6

Les laboratoires
BCI!
Biologie du Cancer
et de l'Infection!
UMR_S 1036!
CEA/Inserm/UGA
!
BGE!
Biologie à Grande
Échelle!
UMR_S 1038!
CEA/Inserm/UGA!
!
CBM
Chimie et Biologie
des Métaux!
UMR 5249!
CEA/CNRS/UGA
!
PCV
Physiologie
Cellulaire &
Végétale!
UMR 5168!
CEA/CNRS/UGA/Inra
GPC
Groupe
Physiopathologie du
Cytosquelette!
BIG et UMR_S 1216
UGA/Inserm/CEA/CHU
Directeur de la publication!
Jérôme Garin!
Éditeur et format électronique!
Pascal Martinez — [email protected]!
Comité de rédaction!
Virginie Brun, Patrice Catty, Vincent Forge,
Anne Fourest-Lieuvin, Philippe Huber, Daphné
Seigneurin-Berny.!
!
Institut de Biosciences et
Biotechnologies de Grenoble
http://big.cea.fr
http://big.cea.fr/drf/big/actu/lettres!
CEA-Grenoble
17 avenue des Martyrs
38 054 Grenoble cedex 09
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Fax : [phone]
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