production de protéines recombinantes à usage thérapeutique

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PRODUCTION DE PROTÉINES RECOMBINANTES À USAGE
THÉRAPEUTIQUE
Exemples de système d’expression :
Production de protéines purifiées.
Quantité (Q) de protéines en fonction des applications :
L’obtention de protéines peut être réalisée :
o Par purification de la protéine à partir de la cellule ou du tissu d’origine.
o Par expression hétérologue dans une cellule (ou un organisme) hôte en utilisant
un système d’expression.
o Par traduction in vitro dans un système acellulaire (lysat cellulaire, lysat de
réticulocytes ou lysat bactérien).
1.Protéines recombinantes à usage thérapeutique.
Différents types de protéines recombinantes.
1.1. Protéines recombinantes en remplacement de protéines de source animale ou
humaine.
1.2.Protéines recombinantes issues directement de la biotechnologie.
 Erythropoïétine (EPO)
 Activateur tissulaire du plasminogène (tPA)
 Interféron
Protéine
Origine
Insuline
Pancréas
Hormone de croissance
Hypophyse de cadavre
Albumine
Sang humain
Facteur VIII
Sang humain
Application
Q de protéine purifiée
Analyse de la fonction
µg
Production d’anticorps
mg
Analyse de la structure d’une protéine
>100mg
Diagnostique ou thérapeutique
g
Industrielle
Kg à tonnes

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1.3.Vaccins recombinants
 Enveloppe protéique de la capside de virus de l’hépatite B.
 Protéine L1 du papillomavirus :
Gardesi I® (HPV 6, 11, 16 , 18) Merck, Sanofi Pasteur, Cervarix ®
GlaxoSmithKlein
1.4.Anticorps monoclonaux
Premier : monoclonal anti-VEGF
Le Bevacizumab se lie au VEGF et prévient son action sur les récepteurs endothéliaux
(VEGFR), d’où une baisse de la vascularisation tumorale et un effet anticancéreux.
Bevacizumab : AVASTIN® approuvé par FDA, comme permettant une survie prolongée
de 30% pour les cancers colorectaux.
Autre exemple : Hercepline® : traitement du cancer du sein Her+.
Toutes les protéines ne peuvent être produites dans la même cellule hôte.
Pour chaque protéine, nécessité de choisir le couple vecteur/cellule hôte permettant de
produire la protéine recombinante active au meilleur prix.
Choix de la cellule dépend de l’objectif et des propriétés de la protéine.
2.Les différentes cellules hôtes.
2.1.Les cellules
Le meilleur système est le plus simple, donnant l’activité biologique recherchée au moindre coût.
1.2.Avantages et inconvénients
Coût et facilité de mise en œuvre, mais aussi :
Cf tableau dans poly.
Difficultés supplémentaires

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· Temps de division : augmente avec la taille.
Les cellules animales nécessitent des conditions d’asepsie très strictes.
· Adhésion obligatoire :
Certaines lignées de cellules de mammifères nécessitent un support pour être viables.
Cela :
‣pose un problème de mise à l’échelle
‣les rends particulièrement susceptibles au cisaillement.
Exemple : tapis cellulaire de myoblastes
Culture sur microporteurs.
3.Les étapes de production d’une protéine recombinante.
1. Création d’une lignée de cellules qui vont effectivement produire la protéine
désirée.
2. Optimisation du rendement
Rendement : quantité de protéines fabriquée par litre de fermenteur et par cycle de
fabrication (un bioréacteur de 20000L peut réaliser 20 cycles/an).
Rendement de l’ordre de 1,5 à 2 g/L/cycle ; les meilleurs espoirs s’orientent vers 5
g/L.
3. Purification de la protéine, éliminant toute trace de cellules productrices, de virus,
de produits de dégradation de la protéine, de milieu de culture.
4. Production d’abord en lots pilotes, puis dans les conditions de BPF (bonnes
pratiques de fabrication). La construction et la mise en état d’un bioréacteur pour
une protéine médicamenteuse commercialisée prennent plusieurs années. La
décision de mise en construction est prise vers le milieu de la phase III. Entre cette
décision et la production de lots validés, 30 à 42 mois s’écoulent.
4.Exemples
1.1.Utilisation de cellules simples : E. coli et levures.
1.1.1.Hormones de croissance : hGH = somatotropine.
Produites par les cellules somatotropes de l’hypophyse.
Précurseurs produits dans la glande pituitaire antérieure
Transcription du gène hGH-N Chr 17q
Maturation et sécrétion dans la circulation générale
Induit la production de somatomédines = facteurs de croissance « insulin-like » qui
stimulent la prolifération de tissus mésodermiques : cartilage, os, muscles.
Formes circulantes :
70% sous la forme d’une protéine de 22 kDa 191 aa, 2 ponts disulfures
10% : protéine de 20 kDa splicing alternatif (exon 3)
20% sous forme de dimère.

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Utilisation : Traitement du nanisme hypophysaire.
1.1.2.Production de la protéine recombinante
2 méthodes de production de la protéine recombinante
Protéine maturée : 191 aa, 2 ponts disulfures.
Production dans la cellule bactérienne : production cytoplasmique.
Criblage d’une banque d’ADNc

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Sécrétion de la protéine.
Production de quantités illimitées, coût faible
Spécialités : HUMATROPE® Lilly
SEROSTIM® Soreno
1.1.3.Production de vaccins recombinants
Principe de la vaccination classique
➡Injection de microorganismes
➡Stimulation du système immunitaire (lymphos B ou T)
➡Destruction de l’agent infectieux
Vaccins recombinants
Vaccins sous unitaires contenant la protéine de surface (Ag).
Premier vaccin recombinant : virus de l’hépatite B (HBV) utilisation de l4antigènes de
surface HB-sAg.
Production dans la levure (S. cerevisiae)
50-100mg/L de culture
Spécialités : Engerix ® GSK
Recombivax HB®
Hbvaxpro ® Sanofi
Genhevax®
4.1.4.Production de vaccins recombinants
Premier médicament issu des biotechnologies approuvées par FDA.
· L’insuline est synthétisée dans les îlots de Langerhans des cellules pancréatiques.
· Elle est constituée d’une chaîne polypeptidique unique, la préproinsuline.
· La préproinsuline est transformée en proinsuline, puis en insuline par clivage.
· Dans la forme mature de l’insuline, les chaînes A et B sont liées par des ponts
disulfures.