Analyse microbiologique d`un produit polymicrobien
publicité
Thème Analyse microbiologique d'un produit polymicrobien 1 2 3 La démarche de l’analyse microbiologique La recherche d’une flore particulière Dénombrement d’une flore d’un produit microbien 1 Chapitre Chapitre La démarche de l’analyse microbiologique ACTIVITÉS COURS 1. Méthode qualitative et/ou méthode quantitative 14 2. Démarche de l’analyse microbiologique dans le domaine médical14 3. Démarche de l’analyse microbiologique dans le domaine des bio-industries 18 N°1 Infection nosocomiale ou communautaire ? 25 N°2 Analyse de plan d’échantillonnage en industrie agroalimentaire 28 N°3 Interprétation de résultats d’une analyse d’un produit cosmétique30 Les objectifs du programme Les compétences développées en classe de première seront réinvesties dans l’analyse microbiologique d’un produit polymicrobien. L’objectif est de comprendre la démarche choisie, dénombrement ou recherche, et de permettre à l’élève de différencier les deux méthodologies. Chapitre 1 La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement 1. MÉTHODE QUALITATIVE ET/OU MÉTHODE QUANTITATIVE L’analyse microbiologique est réalisée dans différents domaines : -- le domaine médical où cette analyse est menée sur un prélèvement biologique effectué chez un patient dans un but de diagnostic et de mise en place d’un traitement adapté ; -- le domaine des bio-industries (industries agroalimentaire, pharmaceutique, cosmétique) où cette analyse est menée : ·· sur les matières premières et les produits finis dans le but de vérifier leur état sanitaire, ·· sur les produits en cours de fabrication, les outils ou les appareils utilisés…, dans le but de valider un procédé de fabrication ; -- le domaine de l’environnement où cette analyse est menée sur un prélèvement d’eau, d’air, de surface…, dans le but de mettre en évidence la pollution microbienne d’un écosystème. Quel que soit le domaine dans lequel elle est réalisée, l’analyse microbiologique permet : -- soit de rechercher dans l’échantillon au moins un micro-organisme spécifique, le plus souvent pathogène. L’analyse doit permettre de l’isoler et de l’identifier même s’il n’est présent qu’en très faible quantité. L’analyse est qualitative et le résultat est rendu sous forme de présence ou d’absence du micro-organisme recherché dans l’échantillon ; -- soit de quantifier dans l’échantillon une flore particulière. Cette quantification est le plus souvent appelée dénombrement. L’analyse est quantitative et le résultat est rendu sous forme d’une concentration en microorganismes (appartenant à une flore particulière) par mL ou par g d’échantillon. Le but, la démarche et les techniques développées lors de l’analyse microbiologique dans le domaine médical sont très différents de ceux développés dans les domaines des bio-industries et de l’environnement. En effet, dans ces domaines, contrairement au domaine médical, les méthodes utilisées reposent le plus souvent sur des normes et les résultats sont interprétés en fonction de critères microbiologiques. 2. DÉMARCHE DE L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DANS LE DOMAINE MÉDICAL Dans le domaine médical, l’analyse microbiologique correspond à la recherche d’un micro-organisme pathogène. C’est donc le plus souvent une analyse qualitative. Elle permet de poser un diagnostic direct, c’est-à-dire la mise en évidence, dans le prélèvement effectué chez un patient, du micro-organisme responsable des symptômes observés. Le micro-organisme pathogène isolé du prélèvement subit une identification la plus complète possible. Traditionnellement, cette identification repose sur la recherche de nombreux caractères biochimiques, associée si nécessaire à la recherche d’antigènes de surface (voir sérogroupage/sérotypage). Une fois le diagnostic posé grâce à la mise en évidence et à l’identification du micro-organisme responsable, un antibiogramme (ou un « anti-fongigramme ») est réalisé pour mettre en place un traitement efficace. L’analyse urinaire est relativement à part dans ce domaine : une urine normale est stérile mais ce produit biologique se retrouve souvent faiblement contaminé lors du prélèvement (flore cutanée du méat urinaire, flore intestinale). Une « urine pathologique » caractéristique d’une infection est par contre riche en bactéries. C’est donc le dénombrement des bactéries urinaires qui constitue dans ce cas un des critères les plus fiables pour le diagnostic : on considère qu’une bactériurie supérieure à 105 bactéries par mL d’urine signe une infection. Le plus souvent 14 on retrouve une seule espèce bactérienne responsable de l’infection (infection mono-microbienne). L’analyse microbiologique dans le domaine médical peut également être réalisée dans un but épidémiologique et/ou dans le cadre de la recherche d’un portage sain (cf. 2.1.2. « La flore pathogène » p. 17). 2.1. Les différents types de flores microbiennes chez l’homme Certains prélèvements biologiques effectués chez un patient, en plus de contenir le micro-organisme pathogène, sont polymicrobiens en raison de l’existence d’une flore commensale importante. 2.1.1. La flore commensale Le commensalisme est une association entre un hôte (ici l’homme) et un micro-organisme qui ne provoque pas de trouble chez l’hôte. L’hôte fournit la « nourriture » et le « gîte » au micro-organisme et peut tirer profit de cette association. Dès la naissance, l’organisme humain est en contact constant avec les micro-organismes de son environnement au niveau des interfaces milieu extérieur / milieu intérieur que sont la peau et les muqueuses. Certains de ces microorganismes colonisent ces interfaces et constituent une flore commensale résidente (document 1 ). 1 La flore commensale résidente L’installation de ces micro-organismes inoffensifs ne se fait pas de façon anarchique : la peau et les diverses muqueuses n’hébergent pas les mêmes espèces microbiennes ; leur implantation et leur développement dépendent de divers facteurs propres à chaque zone : humidité, pH, présence de dioxygène, éléments nutritifs particuliers… De nombreux micro-organismes sont donc normalement présents sur la peau et les muqueuses des sujets sains. Ils constituent les flores commensales résidentes. La notion de flore résidente s’oppose à celle de flore transitoire, flore qui varie au cours de la journée, selon les activités et l’environnement dans lequel évolue l’individu. La flore commensale cutanée La flore cutanée résidente est présente sur la partie la plus superficielle de l’épiderme, dans les conduits des glandes sudoripares, sébacées, et dans les follicules pileux (c’est d’ailleurs à partir de ces cavités que la flore cutanée se renouvelle après des soins corporels). La densité peut varier de quelques milliers à plusieurs millions de microorganismes par cm2. On y retrouve notamment des bactéries Gram + aérobies appartenant essentiellement aux genres Corynebacterium et Staphylococcus (à coagulase négative). Au niveau cutané, on retrouve aussi une flore transitoire composée : -- le plus souvent de micro-organismes issus de l’environnement (eau, surfaces, plantes…) comme les Pseudomonas, les Stenotrophomonas… -- parfois de micro-organismes pathogènes (opportunistes) au niveau des régions cutanées les plus humides, du périnée et des régions avoisinantes (cf. 2.1.2. « La flore pathogène » page 17) : ·· Gram - : Entérobactéries (Klebsiella, E.coli), ·· Gram + : Staphylococcus aureus, Streptococcus, ·· levures : Candida albicans. La flore cutanée est sélectionnée par les conditions physico-chimiques de la peau (pH acide), par les sécrétions antibactériennes des glandes sébacées et sudoripares (lysozyme, acides gras toxiques pour les micro-organismes). Elle est aussi régulièrement éliminée par les lavages (soins corporels) et la desquamation de l’épiderme (élimination naturelle des cellules mortes les plus superficielles). Elle est donc sans cesse en renouvellement. La peau est finalement un environnement hostile pour les micro-organismes et à l’exception de Staphylococcus aureus (25 % de portage sain dans la population), les bactéries appartenant à la flore transitoire en sont rapidement éliminées. Seules les espèces résidentes sont systématiquement retrouvées. Les infections cutanées sont précédées d’un déséquilibre écologique local multifactoriel où interviennent en proportions variables : -- des facteurs locaux (promiscuité, hygiène corporelle, transpiration, frottement, application de corticoïdes...) ; 15 Chapitre 1 La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement -- des facteurs généraux (déficit immunitaire, diabète, traitement avec des immunosuppresseurs ou des corticoïdes pris par voie générale...). Les principales infections cutanées sont dues aux microorganismes suivants : -- infections bactériennes : ·· infections staphylococciques (à Staphylococcus aureus) : folliculite superficielle, furoncle… ·· infections streptococciques (notamment à Streptococcus pyogenes) : impétigo, érysipèle… -- infections fongiques (mycoses cutanées) : ·· les dermatophytoses : teignes dues à des champignons microscopiques filamenteux (peau, ongle, cuir chevelu), ·· les candidoses (à Candida albicans). La flore commensale du tube digestif C’est la flore la plus abondante et la plus diversifiée ; on y retrouve jusqu’à plus de 400 espèces différentes (dont certaines sont très difficilement cultivables in vitro). • Au niveau de la bouche, les espèces retrouvées sont aussi présentes dans le rhinopharynx avec comme particularité l’abondance des streptocoques surtout non groupables (cf. Activité « Recherche de Streptococcus pyogenes » p. 41), la présence éventuelle de Candida albicans, d’entérobactéries et d’anaérobies. Les streptocoques jouent un rôle important dans la genèse de la plaque dentaire. On dénombre habituellement 108 à 109 micro-organismes par mL de salive. • Dans l’estomac et les premiers segments de l’intestin grêle, les espèces retrouvées appartiennent essentiellement aux genres suivants : Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Lactobacillus et Candida. L’estomac possède une flore très pauvre du fait de son acidité (pH voisin de 2). L’intestin grêle possède aussi une flore pauvre en raison du péristaltisme (contractions musculaires à l’origine du déplacement du bol alimentaire) et de l’abondance des sécrétions. • Dans le colon, les espèces prédominantes sont essentiellement des bactéries anaérobies strictes appartenant aux genres : Bactéroides, Bifidobacterium ou Clostridium. Les espèces aéro-anaérobies sont très minoritaires et une espèce emblématique comme E. coli ne représente qu’à peine 0,1 % de la population microbienne totale. La flore colique en plus d’être extrêmement variée est abondante : 1011 à 1012 bactéries par gramme de matière fécale. L’analyse des selles est souvent prescrite lors de pathologies digestives. La flore fécale reflète la composition de la flore du côlon. Elle renferme donc environ 1012 bactéries/g et est constituée de : -- 99 % de bactéries anaérobies strictes : ·· bacilles Gram - : genre Bacteroïdes, ·· bacilles Gram + : genres Bifidobacterium, Eubacterium, Clostridium… ·· coques Gram + : genres Peptococcus, Streptopeptococcus ; -- 1 % de bactéries aéro-anaérobies : ·· bacilles Gram - : l’espèce E. coli est la plus fréquente de toutes les bactéries aéro-anaérobies, 16 L’acné juvénile L’acné est une dermatose inflammatoire des follicules sébacés, affectant 90 % des adolescents. Les conditions nécessaires à la formation des lésions de l’acné sont : - la séborrhée ou hypersécrétion sébacée. La sécrétion du sébum, qui fournit un environnement riche en nutriments (triglycérides), est déclenchée et entretenue par la sécrétion des hormones stéroïdes sexuelles (initiation de leur sécrétion à l’adolescence) ; - la kératinisation infundibulaire = formation d’un comédon qui entraîne l’obstruction et la rétention du sébum dans le follicule, d’où mise en place de conditions anaérobies ; - la flore commensale locale et les facteurs de l’inflammation. L’espèce dominante dans les glandes sébacées est une bactérie anaérobie stricte appelée Propionobacterium acnes. Cette bactérie hydrolyse les triglycérides du sébum en acides gras inflammatoires à courtes chaînes carbonées (et acide propionique) qui pénètrent dans le derme et entrainent une forte réaction inflammatoire. C’est cette réponse exagérée du système immunitaire qui est responsable des lésions causées par l’acné. Schéma d’un follicule sébacé ·· bacilles Gram + anaérobies préférentiels : Lactobacillus, ·· coques Gram + : genres Enterococcus, Streptococcus du groupe D… Lors de l’observation d’un frottis de selles, après coloration de Gram (document 2 ), on observe une flore Gram + / Gram - dite équilibrée (proportion équivalente de Gram + et de Gram -). La flore intestinale est relativement stable chez un individu adulte même si elle peut être influencée par l’alimentation ou des traitements antibiotiques. Elle peut avoir un rôle positif sur la physiologie de l’individu : synthèse de la vitamine K, aide à l’absorption des nutriments, prévention par son équilibre de la prolifération de bactéries commensales potentiellement dangereuses (Clostridium difficile) et obstacle à la colonisation par des bactéries pathogènes strictes (Salmonella, Shigella…). 2 Flore fécale normale : frottis de selles après coloration 3 Flore vaginale normale : frottis vaginal après coloration de Gram de Gram 4 Les principales infections bactériennes humaines Méningites bactériennes . Streptococcus pneumoniae . Neisseria meningitidis . Haemophilus influenzae . Streptococcus agalactiae . Listeria monocytogenes Otites . Streptococcus pneumoniae Pneumonies . Streptococcus pneumoniae . Haemophilus influenzae . Staphylococcus aureus . Mycoplasma pneumoniae . Chlamydia pneumophila . Mycobacterium tuberculosis Infections cutanées . Staphylococcus aureus . Streptococcus pyogenes . Pseudomonas aeruginosa Maladies sexuellement transmissibles . Chlamydia trachomatis . Neisseria gonorrhoeae . Treponema pallidum . Ureaplasma urealyticum . Haemophilus ducreyi La flore commensale vaginale Elle est principalement constituée du bacille de Döderlein (Lactobacillus acidophilus) (document 3 ). Cette bactérie produit localement de l’acide lactique, à partir du glycogène sécrété par les cellules vaginales, créant un environnement acide défavorable à l’implantation d’autres espèces, éventuellement pathogènes. 2.1.2. La flore pathogène La pathogénicité est une association entre un hôte (ici l’homme) et un micro-organisme qui vit aux dépens de l’hôte et provoque chez lui des troubles plus ou moins graves. Le document 4 présente une vue générale des différentes infections bactériennes retrouvées chez l’homme. On distingue deux types de micro-organismes pathogènes : Infections oculaires . Staphylococcus aureus . Neisseria gonorrhoeae . Chlamydia trachomatis Sinusite . Streptococcus pneumoniae . Haemophilus influenzae Infections tractus respiratoire haut . Streptococcus pyogenes . Haemophilus influenzae Gastrite . Helicobacter pylori Intoxications alimentaires . Campylobacter jejuni . Salmonella . Shigella . Clostridium . Staphylococcus aureus . Escherichia coli Infections urinaires . Escherichia coli . Autres Entérobacteriaceae . Staphylococcus saprophyticus . Pseudomonas aeruginosa -- les pathogènes stricts (ou spécifiques) : ce sont des micro-organismes toujours pathogènes qui provoquent chez l’hôte une maladie spécifique (par exemple Mycobacterium tuberculosis et la tuberculose, Salmonella typhi et la fièvre typhoïde). Certains individus, bien qu’hébergeant ce type de micro-organismes, ne développent aucun symptôme ; on parle alors de porteurs sains (ex : Staphylococcus aureus) ; -- les pathogènes opportunistes : ce sont des micro-organismes normalement commensaux qui deviennent pathogènes suite à divers évènements : ·· changement de niche écologique : E. coli, commensal du tube digestif, est le premier micro-organisme responsable d’infections urinaires basses, ·· destruction d’une partie de la flore commensale suite 17 Chapitre 1 La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement à un traitement antibiotique : Candida albicans, commensal de la partie supérieure du tube digestif, est responsable du muguet (infection notamment de la bouche), ·· multiplication chez des sujets immunodéprimés ou fragilisés (personnes ayant subi une greffe, personnes HIV+, personnes âgées…). Voir le Zoom p. 24 : les intoxications alimentaires d’origine microbienne. 2.1.3. Équilibre de la flore Si les micro-organismes commensaux ne sont pas indispensables à la vie comme cela a été démontré grâce à l’élevage d’animaux axéniques (animaux sans flore commensale, car élevés et nourris stérilement), la flore commensale exerce une influence non négligeable sur le déroulement de certaines activités physiologiques. Voici quelques rôles attribués à la flore commensale : -- rôle de barrière écologique : par compétition pour le gîte et les nutriments, la flore commensale empêche l’implantation et le développement de bactéries pathogènes. De plus certaines espèces produisent des substances toxiques pour d’autres micro-organismes : bactériocines, acides (acide lactique et flore vaginale)… -- rôle métabolique : production de diverses vitamines par la flore intestinale, dégradation de certains déchets métaboliques comme l’urée ou les bilirubines ; -- rôle immunitaire : la flore commensale permet un meilleur développement du système immunitaire lié à l’appareil digestif. 2.2. Les différents types de prélèvements et les grandes étapes de leur analyse microbiologique Un enrichissement est nécessaire lorsque le micro-organisme est peu représenté dans le prélèvement mais que sa présence doit être mise en évidence (c’est le cas par exemple de la recherche de Salmonella dans un prélèvement de selles). L’enrichissement a pour but de multiplier sélectivement le micro-organisme recherché tout en inhibant ou limitant le développement des autres flores. Le choix des milieux ensemencés dépend du type de prélèvement et des symptômes observés chez le patient. On ne recherchera pas une bactérie responsable d’une angine dans un prélèvement urinaire ! Si des colonies suspectes apparaissent après incubation, elles sont repiquées pour identifier le(s) microorganisme(s) dont elles sont issues. Les colonies suspectes sont des colonies présentant certaines caractéristiques : -- culturales (temps d’apparition, température d’incubation, atmosphère d’incubation) ; -- macroscopiques (aspect des colonies) ; -- biochimiques (un ou plusieurs caractères biochimiques mis en évidence grâce au milieu utilisé) (document 5 ). 2.2.2. Les prélèvements « mono-microbien » Ce sont des prélèvements effectués dans des zones normalement stériles (sang, urine, liquide amniotique…). Ces prélèvements sont ensemencés sur des milieux non sélectifs, voire particulièrement riches dans le cas des hémocultures (cultures de prélèvement sanguin). Si des colonies apparaissent après incubation, on identifie le plus précisément possible le micro-organisme dont elles sont issues. Rappelons que dans le cadre de l’analyse urinaire, une bactériurie supérieure à 105 bactéries par mL est nécessaire (voir p. 14). 2.2.1. Les prélèvements « polymicrobiens » Ce sont des prélèvements biologiques effectués dans des zones où existe une flore commensale (selles, prélèvements de gorge, crachats,…). Ces prélèvements sont ensemencés sur des milieux sélectifs et discriminatifs (différentiels), après leur éventuel enrichissement. 3. DÉMARCHE DE L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DANS LE DOMAINE DES BIO-INDUSTRIES L’analyse microbiologique dans le domaine des bio-industries peut être réalisée : -- au niveau de la production : validation des procédés de fabrication dans le cadre d’une démarche qualité de l’entreprise, validation de l’état sanitaire des matières premières utilisées et des produits finis, pour éviter que le consommateur ne contracte une pathologie (intoxication alimentaire par exemple) et/ou que l’industriel ne perde sa production. Ces analyses sont menées par le laboratoire contrôle-qualité de l’entreprise ; 18 -- au cours d’une expertise, dans le cas de l’apparition d’une pathologie chez un certain nombre de consommateurs (intoxication alimentaire collective par exemple), pour identifier l’aliment responsable et pour mener des enquêtes épidémiologiques. L’analyse microbiologique peut être réalisée sur une (ou plusieurs) unité(s) d’échantillon. Pour garantir que l’analyse pratiquée permette de conclure sur la qualité du lot entier, il est nécessaire que le plan d’échantillonnage adopté (cf. 3.1.2. page 19) soit conforme à la taille du lot 5 Exemple de colonies suspectes de Salmonella sur milieu SS On observe ici deux types de colonies : - des colonies roses/rouges d’une espèce bactérienne capable de dégrader le lactose du milieu. Cette dégradation s’accompagne d’une acidification visible par l’indicateur coloré de pH présent : rouge neutre de couleur rouge à pH acide ; - des colonies incolores (donc ne dégradant pas le lactose) à centre noir. Le centre noir est lié à la réduction du thiosulfate en sulfure (H2S) puis à la réaction des sulfures avec le fer du milieu pour donner du sulfure de fer de couleur noire. Les Salmonella sont des bactéries lactose - et le plus souvent H2S +. Les colonies suspectes d’être des Salmonella sont donc ici les colonies incolores à centre noir. et que la procédure de fabrication ait bien été la même pour le lot entier. Un lot peut être considéré comme uniforme et l’(les) unité(s) d’échantillon représentative(s) de la qualité du lot si les fabricants ont respecté : -- les bonnes pratiques de fabrication (BPF) pour les médicaments et les cosmétiques ; -- la procédure HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) pour les produits alimentaires. Voir Zoom p. 20. 3.1. Les critères microbiologiques et les plans d’échantillonnage 3.1.1. Les limites ou critères microbiologiques Le résultat de l’analyse microbiologique d’un bioproduit est toujours comparé à des critères microbiologiques qui fixent des limites réglementaires, obligatoires, ou normatives, non obligatoires (une norme est un document descriptif, élaboré par consensus et approuvé par un organisme de normalisation reconnu, comme par exemple l’ISO, International Organization for Standardization). Chaque limite, fixée par la réglementation ou par une norme, définit, en fonction des bioproduits, l’acceptabilité d’un lot ou d’un procédé en fonction : -- de l’absence ou de la présence d’un type de micro-organisme par unité de masse ou de volume ; -- du nombre de micro-organismes d’un type donné par unité de masse ou de volume. Le règlement (CE) n°2073/2005, modifié par le règlement (CE) n°1441/2007, concernant les critères microbiologiques applicables aux denrées alimentaires, définit deux types de critères microbiologiques : -- les critères de sécurité alimentaire définissent l’acceptabilité d’un bioproduit ou d’un lot de denrées alimentaires. Ils sont applicables aux produits tant qu’ils sont présents sur le marché en fonction de leur Date Limite de Consommation (DLC) ou de leur Date Limite d’Utilisation Optimale (DLUO) (cf. Zoom p.23) ; -- les critères d’hygiène des procédés indiquent l’acceptabilité du fonctionnement du procédé de production. Un tel critère n’est pas applicable aux produits mis sur le marché. Il fixe une valeur indicative de contamina- tion dont le dépassement exige des mesures correctives destinées à maintenir l’hygiène du procédé, conformément à la législation, mais ne permet pas de conclure sur la conformité on non d’un bioproduit. 3.1.2. Les plans d’échantillonnage Un plan d’échantillonnage est un ensemble d’instructions qui indique la taille de l’échantillon (nombre d’unité(s) d’échantillon) pour une taille de lot déterminée et qui définit les conditions et les modalités d’une acceptation ou d’un refus d’un lot. Les symboles utilisés dans les plans d’échantillonnage et leurs significations sont les suivants : -- « n » représente le nombre d’unités de l’échantillon prélevées au hasard dans un lot et analysées pour répondre aux exigences définies ; -- « m » représente des concentrations acceptables de micro-organismes : ·· dans un plan à deux classes, « m » sert à distinguer les unités de qualité satisfaisante de celles qui sont de qualité non satisfaisante, ·· dans un plan à trois classes, « m » sert à distinguer les unités de qualité satisfaisante de celles qui sont de qualité acceptable ; -- « M » (plan à trois classes seulement) représente des concentrations inacceptables de micro-organismes, traduisant des conditions d’insalubrité ou d’avarie. « M » sert à distinguer les unités de l’échantillon de qualité acceptable de celles qui sont de qualité non satisfaisante. Si la valeur d’une unité d’échantillonnage est supérieure à « M », le lot dont provient l’échantillon est inacceptable ; -- « c » représente le nombre maximal permis d’unités prélevées de qualité acceptable. Si le nombre d’unités de qualité acceptable est supérieur à « c », le lot dont provient l’échantillon est inacceptable. Les tableaux d’interprétation prévoient donc : -- le nombre d’unités « n » de l’échantillon ; -- le nombre d’unités « c » de l’échantillon pouvant être comprises entre « m » et « M » ; -- des limites sous deux formes : ·· plan à trois classes : deux valeurs limites « m » et « M », ·· plan à deux classes : une valeur limite « m = M ». 19 Chapitre 1 La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement 3.1.3. L’interprétation deux classes selon un plan à Deux classes sont définies par unité de l’échantillon et c = 0 (document 6 ) : -- 1ère classe : le résultat obtenu est inférieur à m (=M) : satisfaisant ; -- 2e classe : le résultat obtenu est supérieur à m (=M) : non satisfaisant (corrompu). Si toutes les unités « n » de l’échantillon ont une valeur inférieure ou égale à m (= M), alors l’échantillon et le lot sont validés comme satisfaisants. Si une unité de l’échan- tillon a une valeur supérieure à m (=M) alors l’échantillon et le lot sont refusés comme corrompus, quel que soit le résultat des autres unités de l’échantillon. Au cours d’une recherche où m (= M) = 0 (cas de Salmonella par exemple), on conclut à la présence ou à l’absence du micro-organisme (pathogène) dans le volume (masse) de bioproduit analysé. Dans ce cas, le règlement ou la norme stipulent toujours : « absence du micro-organisme (pathogène) dans le volume (masse) analysé ». Si la recherche microbiologique met en évidence la présence dans le bioproduit d’au moins un micro-organisme Les BPF Les principes et lignes directrices de Bonnes Pratiques de Fabrication portent essentiellement sur le personnel, les locaux et les équipements, la production, la documentation, le contrôle de la qualité et l’étiquetage. Le personnel Le personnel, recruté pour sa compétence, reçoit une formation régulière. Des programmes d’hygiène adaptés aux activités doivent être établis. Ceux-ci contiennent des procédures relatives à la santé, à l’hygiène et à l’habillement du personnel. Les locaux et les équipements Les locaux et les équipements de fabrication doivent également être soumis à des normes d’hygiène drastiques afin d’éviter toute contamination et tout effet nocif sur la qualité du produit. Documentation Le fabricant doit mettre en place un système de documentation couvrant les différentes opérations de fabrication réalisées. Ces documents retracent l’histoire de chaque lot produit. Contrôle de la qualité Le fabricant doit mettre en place un système de contrôle de la qualité. Ce système est placé sous l’autorité d’une personne indépendante de la production qui possède les qualifications requises. Cette personne peut accéder à des laboratoires de contrôle de la qualité afin de procéder à l’examen indispensable des matières de base et des matériaux d’emballage, ainsi qu’aux essais des produits intermédiaires et finis. Le recours à des laboratoires externes peut être autorisé. Lors du contrôle du produit fini avant sa libération, le système de contrôle de la qualité doit notamment tenir compte des conditions de production, des résultats des contrôles effectués pendant le processus, de l’examen des documents de fabrication et de la conformité du produit aux spécifications. Des échantillons de chaque lot de produit fini doivent être conservés au moins un an après la date de péremption. En outre, des échantillons de certaines matières de base utilisées dans le processus de fabrication doivent être conservés au moins deux ans après la libération du produit, période qui peut être raccourcie dans certains cas. La procédure HACCP L’HACCP pour Hazard Analysis Critical Control Point est un système qui identifie, évalue et maîtrise les dangers au regard de la sécurité des aliments. Dans la chaîne de transformation alimentaire, les dangers et les risques pour la sécurité alimentaire sont identifiés aux différentes étapes. Ces risques conduisent à la détermination de points critiques qui doivent faire l’objet de contrôles permanents (Critical Control Point). Pour chacun de ces points (CCP), des valeurs numériques et des seuils de tolérance sont fixés. Puis les contrôles sont régulièrement menés. Une documentation des enregistrements obtenus par ces contrôles doit être maintenue à jour. Les limites numériques de tolérance sont souvent données par la réglementation. Le Codex Alimentarius décrit la mise en place de l’HACCP, démarche basée sur sept principes dont la mise en œuvre suit une séquence logique de douze étapes. Les 7 principes : 1. Procéder à une analyse des dangers. 2. Déterminer les points critiques pour la maîtrise (CCP). 3. Établir les limites critiques. 4. Établir un système afin de surveiller la maîtrise du CCP. 5. Établir l’action corrective. 6. Établir les procédures de vérification pour confirmer que l’HACCP fonctionne. 7. Établir la documentation des procédures et des enregistrements. 20 Les 12 étapes du HACCP : 1. Constituer l’équipe HACCP (compétences et organisation). 2. Décrire le produit (la cible). 3. Déterminer son utilisation prévue (le contexte). 4. Établir le diagramme des opérations (les processus). 5. Vérifier sur place le diagramme (validation des processus). 6. Énumérer les dangers (agents pathogène), analyser les risques (probabilité d’apparition du dommage). 7. Déterminer les CCP (application de l’analyse des risques). 8. Fixer les seuils limites, souvent réglementaires, pour chaque CCP (quantifier la tolérance). 9. Mettre en place un système de surveillance pour chaque CCP (pilotage, système de surveillance). 10. Prendre les mesures correctives (pilotage et correction). 11. Appliquer les procédures de vérifications (contrôle). 12. Tenir les registres et constituer un dossier (enregistrement qualité). 6 Plan d'interprétation à deux classes non satisfaisant satisfaisant 2 1 7 Plan d'interprétation à trois classes satisfaisant 1 acceptable non satisfaisant 2 recherché, le bioproduit est considéré comme corrompu et il est rejeté, ainsi que le lot dont il est issu. 3.1.4. L’interprétation selon un plan à trois classes Trois classes sont définies par unité de l’échantillon (document 7 ) : -- 1ère classe : le résultat obtenu est inférieur à m : satisfaisant ; -- 2e classe : le résultat obtenu est compris entre m et M : acceptable ; -- 3e classe : le résultat obtenu est supérieur à M : non satisfaisant. Si une seule unité de l’échantillon a une valeur supérieure à M alors l’échantillon et le lot sont refusés comme corrompus, quel que soit le résultat des autres unités de l’échantillon. Si toutes les unités de l’échantillon ont une valeur inférieure à m, l’échantillon et le lot sont validés comme satisfaisants. Si n1 unités de l’échantillon sont inférieures à m et n2 unités sont comprises entre m et M, le paramètre « c » permet alors de conclure : si n2 ≤ « c », l’échantillon et le lot sont validés comme acceptables ; si n2 > « c », l’échantillon et le lot sont refusés comme corrompus. 3.2. Démarche dans le domaine agroalimentaire Les aliments contiennent généralement des micro-organismes de diverses provenances : -- micro-organismes présents dans les matières premières utilisées pour la fabrication de l’aliment (micro-organismes commensaux et/ou pathogènes pour des matières premières d’origine animale, micro-organismes saprophytes pour les matières premières d’origine végétale) ; -- micro-organismes apportés lors de transformation de la matière première : ·· micro-organismes issus des manipulateurs (commensaux et/ou pathogènes) et/ou du matériel et/ou des locaux, 3 ·· micro-organismes utiles, introduits volontairement pour réaliser la transformation de la matière première (lait) en produit fini (yaourts ou fromage). Ces micro-organismes utiles et sélectionnés sont qualifiés de « ferments » ; en effet la transformation de la matière première est souvent liée à un processus fermentaire (fermentation = voie métabolique réalisée sans consommation de dioxygène où l’accepteur terminal d’électrons est une molécule organique). La majorité des aliments ne sont pas des bioproduits stériles (sauf ceux ayant subit une stérilisation comme le lait UHT) ; il est donc nécessaire de respecter un certain nombre de règles pour assurer leur qualité sanitaire et leur qualité marchande, ainsi que le maintien de ces qualités (voir le Zoom sur HACCP p. 30) : -- bonne qualité sanitaire des matières premières pour éviter la présence de micro-organismes pathogènes ; -- bonnes pratiques d’hygiène du personnel, comme le lavage des mains, pour éviter la contamination par des micro-organismes fécaux (Escherichia coli) ou par des micro-organismes pathogènes (Staphylococcus aureus) ; -- bonnes pratiques de nettoyage et de désinfection des locaux et du matériel utilisé ; -- bonnes conditions de conservation, comme la réfrigération, pour éviter la prolifération des micro-organismes. Si ces règles ne sont pas respectées, la flore de l’aliment pourra renfermer des micro-organismes saprophytes et commensaux en grande quantité voire des micro-organismes pathogènes si l’homme ou l’animal sont malades ou porteurs sains : ces micro-organismes peuvent alors provoquer une intoxication alimentaire chez le consommateur. La présence en grande quantité de ces micro-organismes peut aussi être la cause de l’altération des qualités organoleptiques des aliments (modification de l’aspect, de la couleur, de l’odeur, du goût) et engendrer des pertes économiques importantes pour les industriels (perte de la qualité marchande des aliments). L’analyse microbiologique d’un aliment comprend donc : -- le dénombrement de micro-organismes témoins 21 Chapitre 1 La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement d’hygiène générale (flore mésophile aérobie totale FMAT) ; -- le dénombrement de bactéries témoins d’une contamination fécale (Enterococcus, coliformes fécaux et E. coli…) ; -- le dénombrement et/ou la recherche de bactéries pathogènes (Staphylococcus aureus, Salmonella …). Une fois l’analyse microbiologique de l’aliment achevée, tous les résultats sont regroupés et on donne une appréciation globale sur l’aliment. Il suffit d’un seul résultat corrompu pour rejeter l’aliment. 3.3. Démarche dans le domaine des produits cosmétiques Un produit cosmétique est « une substance ou une préparation destinée à être mise en contact avec les diverses parties superficielles du corps humain, notamment l’épiderme, les systèmes pileux et capillaire, les ongles, les lèvres et les organes génitaux externes, ou avec les dents et les muqueuses buccales, en vue, exclusivement ou principalement, de les nettoyer, de les parfumer, d’en modifier l’aspect, de les protéger, de les maintenir en bon état ou de corriger les odeurs corporelles » (cf. article L.5131-1 du code de la santé publique). L’utilisation d’un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant des micro-organismes pathogènes peut avoir des conséquences graves sur l’écologie cutanée de l’utilisateur, surtout sur une peau lésée ou chez des individus immunodéprimés. L’objectif pour les fabricants de matières premières, comme pour ceux des produits finis, est de fournir des produits faiblement contaminés et exempts de micro-organismes pathogènes. De plus, la formulation des produits cosmétiques comprend la présence de conservateurs qui doivent limiter la contamination secondaire du produit et assurer sa conservation dans le temps. L’efficacité de ces conservateurs est évaluée par la technique du Challenge test ou « test de contamination artificielle » (cf. Activité 3 « Challenge test » p. 30). Il n’existe pas d’autorisation préalable de mise sur le marché pour les produits cosmétiques. Il incombe aux fabricants de garantir que leurs produits satisfont aux exigences législatives, réglementaires, et ne présentent aucun danger pour la santé. Afin de répondre à cette exigence (Règlement Cosmétique (CE) 1223/2009 du Parlement européen et du conseil, applicable dès le 11 juillet 2013), les analyses microbiologiques des produits cosmétiques comprennent le contrôle des matières premières et ingrédients, des produits intermédiaires et des produits finis : -- dénombrement de la flore totale (FMAT), comme critère d’hygiène générale. Les critères microbiologiques dépendent du produit analysé : ·· matière première : FMAT : ≤ 105 UFC.g-1, ·· produit fini de catégorie 1 (enfants, yeux et mu- queuses) : FMAT ≤ 102 UFC.g-1, ·· produit fini de catégorie 2 (autres produits) : FMAT ≤ 103 UFC.g-1 ; -- recherche et identification de micro-organismes (pathogènes) dans les produits finis, réalisées si et seulement si la recherche de la FMAT a donné un résultat corrompu : on recherche alors la présence de Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Le résultat attendu est « absence dans 0,1 ou 0,5 g » selon le produit. 3.4. Démarche dans le domaine pharmaceutique Les laboratoires contrôle-qualité de l’industrie pharmaceutique reçoivent deux types d’échantillons à analyser : • les échantillons qui doivent être stériles, tels les médicaments injectables, les collyres ou certains dispositifs médicaux implantables. Quel que soit le mode de préparation des produits stériles, la réglementation impose une vérification de la stérilité des produits (Pharmacopée européenne 1 2.6.1. Essai de stérilité) ; • les échantillons qui peuvent tolérer un certain niveau de contamination. Leur analyse microbiologique doit obéir aux indications de la pharmacopée qui précise les protocoles et les milieux à utiliser en fonction des recherches effectuées : ·· Pharmacopée européenne 2.6.12. : contrôle microbiologique des micro-organismes non stériles et dénombrement des germes aérobies viables totaux, ·· Pharmacopée européenne 2.6.13. : contrôle microbiologique des produits non stériles et recherche de micro-organismes spécifiés (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, E. coli, Salmonella). Le tableau 8 présente des exemples de critères microbiologiques par g ou mL de divers produits non stériles. 1. Pharmacopée = registre officiel, révisé périodiquement par une commission scientifique, publié par chaque pays et qui sert de norme légale et obligatoire pour la spécification, la préparation, l’essai... des médicaments. 22 8 Quelques critères microbiologiques (en UFC.g-1) Produit de Catégorie 3B Produit de Catégorie 2 Préparations pour application locale ou pour administration Préparations pour administration orale contenant dans les voies respiratoires, à l’exception des préparations des matières premières d’origine naturelle, lorsqu’un pré-traitement antimicrobien est impossible et que les obligatoirement stériles, et dispositifs transdermiques. matières premières peuvent avoir une contamination > 103 UFC/g ou 10 mL. - Bactéries aérobies viables : < 102 - Champignons : < 102 - Entérobactéries : < 102 - Pseudomonas aeruginosa : absence - Staphylococcus aureus : absence - Bactéries aérobies viables : < 104 - Champignons : < 102 - Entérobactéries : < 102 - Staphylococcus aureus : absence - E. coli : absence - Salmonella : absence pour 10 g ou 10 mL DLC et DLUO La date limite de consommation (DLC), ou date de péremption, est une date figurant sur les denrées alimentaires microbiologiquement périssables susceptibles, après une courte période, de présenter un danger immédiat pour la santé humaine. Elle est déterminée par le producteur, sauf pour quelques produits pour lesquels elle est fixée par la réglementation. La date limite d’utilisation optimale (DLUO) est une date indiquée sur l’emballage de certaines denrées au-delà de laquelle leurs qualités organoleptiques et nutritionnelles ne sont plus garanties : elles risquent d’avoir moins de goût, moins de vitamines, une consistance différente, sans pour autant constituer un danger pour la santé. Leur vente au-delà de la date limite d’utilisation optimale n’est pas interdite. Les cas groupés de Syndrome Hémolytique et Urémique et de diarrhées sanglantes à E. coli Sud-Ouest de la France, octobre 2005 : « Une bactérie toxique dans des steaks hachés » : C’est la plus importante épidémie de Syndrome Hémolytique et Urémique (SHU) liée à une intoxication alimentaire jamais observée en France (69 cas recensés, entrainant l’hospitalisation de 46 d’entre eux dont 17 enfants âgés de 2 à 11 ans présentant un SHU). L’infection par la bactérie E. coli O157 est une infection rare mais grave… ; la contamination se fait par voie alimentaire, cette bactérie est contenue dans le tube digestif des bovins de manière asymptomatique. À l’origine de cette épidémie, on retrouve une contamination du muscle (la viande) par les intestins infectés. Si la viande avait été vendue sous forme de steak non haché, la cuisson aurait détruit les bactéries localisées à la surface de la viande. En revanche, le fait de l’avoir hachée a projeté les bactéries au cœur du steak et, de ce fait, elles n’ont pas été détruites par la cuisson… Allemagne, printemps 2011 : « La bactérie Escherichia coli O104 a défrayé la chronique, et pour cause : elle a été responsable d’une épidémie meurtrière en Allemagne, 4 000 personnes ayant souffert de diarrhée simple ou sanglante, de colite hémorragique. Plus de 800 d’entre elles ont développé des complications graves entraînant notamment un syndrome hémolytique et urémique (SHU) à l’origine de défaillances rénales. Quelque 50 décès furent recensés ». À l’origine de cette intoxication alimentaire on a suspecté l’ingestion de graines germées ayant été arrosées avec de l’eau contaminée par les excréments de bovins porteurs de cette bactérie. 23 Chapitre 1 La démarche l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement L’eau,deun composant essentiel des organismes vivants Les intoxications alimentaires d’origine microbienne A. L’intoxination alimentaire C’est une maladie contractée suite à l’ingestion d’un aliment contenant une toxine microbienne préformée dans l’aliment et responsable des symptômes observés. C’est par exemple le mode d’action de Staphylococcus aureus enterotoxinogène. L’aliment est initialement contaminé par l’homme : individus porteurs sains (portage au niveau du rhinopharynx) ou malades (atteints de lésions cutanées suppurées par exemple), ou par des animaux : lait de vache contaminé suite à une mammite (inflammation des mamelles). Si l’aliment est laissé au moins 2 à 3 h à température ambiante, S. aureus s’y multiplie et y libère son entérotoxine. Celle-ci est thermostable : elle n’est pas détruite par une cuisson éventuelle. La toxine est par la suite ingérée avec l’aliment et agit rapidement au niveau des entérocytes (cellules de la paroi du tube digestif) en provoquant une fuite hydrominérale (diarrhée), quelques heures après l’ingestion. La toxine peut être présente dans l’aliment alors que le micro-organisme responsable de sa production peut déjà en avoir disparu. B. L’infection d’origine alimentaire ou toxi-infection alimentaire C’est une maladie contractée suite à l’ingestion de nourriture ou de boisson contaminées par des agents pathogènes vivants (bactérie, parasite), qui une fois ingérés vont se multiplier chez l’individu. Si les conditions sont favorables (rupture de la chaîne du froid par exemple), les bactéries entéropathogènes (bactéries pathogènes pour le tube digestif dont la paroi est composée d’entérocytes) se multiplient dans l’aliment et provoquent chez l’individu qui le consomme une toxi-infection si la dose ingérée est suffisante. La dose infectante est très variable selon les bactéries : -- l’ingestion de 1 à 100 bactéries viables suffit pour déclencher une shigellose à Shigella dysenteriae ; -- l’ingestion de 105 à 108 germes viables est nécessaire pour déclencher une salmonellose à Salmonella enterica. Dans ces maladies, les bactéries entéropathogènes affectent les fonctions d’absorption et de sécrétion des entérocytes. Il y a donc fuite hydrominérale (diarrhée) suite à l’augmentation de la quantité d’eau et de sels minéraux dans la lumière intestinale. La diarrhée due à une toxi-infection intestinale peut être considérée comme un mécanisme protecteur puisqu’elle permet à l’hôte d’éliminer des micro-organismes pathogènes. Dans certains cas de diarrhée, le micro-organisme responsable de l’infection est largement prédominant dans les matières fécales : lors de l’analyse microbiologique on le retrouve en culture presque pure. On observe donc une flore fécale déséquilibrée dont il faut identifier la bactérie dominante. C’est le cas du choléra (Vibrio cholerae). Dans d’autres cas, le micro-organisme responsable de l’infection n’est présent qu’en faible concentration dans les selles (on rappelle que la flore commensale digestive au niveau du colon contient jusqu’à 1012 micro-organismes par gramme). On observe donc une flore fécale équilibrée. C’est le cas de la plupart des salmonelloses mineures et des shigelloses. Pourtant la moindre présence de Salmonella ou de Shigella dans une selle indique toujours une infection intestinale (bactéries pathogènes strictes, absentes de la flore commensale normale). Il faut alors être capable de les mettre en évidence parmi tous les autres micro-organismes présents. Les infections d’origine alimentaires peuvent être dues à l’ingestion de deux types de bactéries. 1. L’ingestion de bactéries entérotoxiques C’est le mode d’action de plusieurs espèces du genre Vibrio (V. cholerae, V. parahaemolyticus), de Clostridum perfringens de type A, des E. coli entérotoxiques (ECET) et entérohémorragique (ECEH) et, à un degré moindre, de Bacillus cereus. Une fois dans l’intestin, elles adhèrent à l’épithélium intestinal et sécrètent une entérotoxine. Celle-ci agit alors sur les entérocytes où elle inhibe l’absorption d’eau et d’électrolytes, tandis qu’elle stimule leur sécrétion. Il s’ensuit une fuite hydrominérale vers la lumière intestinale, à l’origine de diarrhées. Les selles ne contiennent ni sang, ni leucocytes car l’épithélium digestif n’est pas détruit (pas d’invasion bactérienne). Remarque : les salmonelloses mineures (gastroentérite bactérienne) reposent sur un mécanisme mixte : invasion de la muqueuse et production lors de la multiplication dans l’individu d’une toxine responsable de certains des symptômes observés. 2. L’ingestion de bactéries entéroinvasives C’est le cas des Salmonella, Shigella, E.coli entéroinvasifs (ECEI), Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejunii. Une fois dans l’intestin, ces bactéries colonisent l’épithélium intestinal selon le mécanisme décrit dans le schéma ci-contre. Généralement, la réaction inflammatoire suffit pour stopper le processus et la guérison est spontanée. Cependant, une dissémination par voie sanguine et lymphatique est possible chez les sujets immunodéprimés. Par ailleurs, certains malades continuent à héberger et donc à éliminer des Salmonella ou des Shigella dans leurs selles, jusqu’à un mois après guérison. Ce sont des porteurs sains (porteurs asymptomatiques). Par la suite, s’ils ne respectent pas les règles élémentaires d’hygiène, ils risquent de contaminer les aliments en les manipulant. 24 Bactéries entéroinvasives INGESTION d’un aliment contaminé INVASION de la muqueuse intestinale : multiplication des bactéries dans l’entérocyte. °bis PROPAGATION des bactéries vers le tissu conjonctif sous-jascent (Salmonella). ADHÉSION des bactéries aux microvillosités des entérocytes. 5°/ FUITE PROPAGATION des bactéries vers les entérocytes voisins et DESTRUCTION des entérocytes (shigella, ECEI) . HYDROMINÉRALE Paroi intestinale DIARRHÉE (avec présence de sang, de mucus, de leucocytes dans les selles) bis RÉACTION INFLAMMATOIRE et phagocytose des bactéries. ACTIVITÉ 1 INFECTION NOSOCOMIALE OU COMMUNAUTAIRE ? PRÉSENTATION Une infection communautaire est une infection contractée dans son environnement quotidien (lieu de travail, transport en commun, école…). Une infection nosocomiale est une infection contractée dans un établissement de santé. Une infection est dite nosocomiale (ou hospitalière) si elle est absente lors de l’admission du patient à l’hôpital et qu’elle se développe 48 heures au moins après son entrée. Ces infections peuvent être : -- d’origine endogène : le malade s’infecte avec ses propres micro-organismes ; -- d’origine exogène. Il peut alors s’agir : ·· d’infections croisées, transmises d’un malade à l’autre par les mains ou les instruments de travail du personnel médical ou paramédical, ·· d’infections provoquées par les micro-organismes du personnel, ·· d’infections liées à la contamination de l’environnement hospitalier (eau, air, matériel, alimentation...). Les infections nosocomiales les plus fréquentes sont les infections urinaires (30 %), les pneumopathies infectieuses (15 %) et les infections de la plaie opératoire (14 %). Les trois bactéries le plus souvent rencontrées, lors de ces infections, sont Escherichia coli (25 %), Staphylococcus aureus (19 %) et Pseudomonas aeruginosa (10 %). Leurs principales caractéristiques sont présentées dans le document 1 . Ces bactéries sont le plus souvent multi-résistantes aux antibiotiques. Le traitement d’infections nosocomiales pour lesquelles sont impliquées des Bactéries Multi Résistantes (BMR) apparaît donc souvent problématique. Suite à une hémoptysie (rejet de sang par la bouche provenant des voies aériennes), Monsieur X est hospitalisé et subit une bronchoscopie. Il développe depuis son hospitalisation une pneumonie importante. Le délai d’apparition des symptômes (environ une cinquantaine d’heures après son admission) ne permet pas à lui seul de déterminer l’origine communautaire ou nosocomiale de cette infection. Le médecin décide d’adresser au laboratoire de microbiologie de l’hôpital les eaux d’un lavage bronchoalvéolaire pour identifier la souche responsable, vérifier sa sensibilité à différents antibiotiques et déterminer son origine (hospitalière ou communautaire). Les pneumonies extrahospitalières (communautaires) sont principalement dues à Streptococcus pneumoniae (document 2 ). 1 Caractéristiques des principales espèces responsables d’infections nosocomiales Nom de l’espèce E.coli Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Caractéristiques culturales Non exigeant, mésophile. Non exigeant, mésophile. Non exigeant, mésophile. Caractéristiques morphologiques Bacille Gram -, mobile par ciliature péritriche. Bacille Gram -, mobile par ciliature polaire. Coques Gram +, regroupés en amas. Caractères biochimiques de famille ou de genre Famille des Enterobacteriaceae . oxydase - , . aéro-anaérobie , . glucose + par voie fermentaire, . nitrate réductase + stade nitrite. Genre Pseudomonas . oxydase + , . aérobie strict , . glucose + par voie oxydative, . nitrate réductase +, stade diazote. Famille des Staphylococcaceae . catalase + , . aéro-anaérobie , . glucose + par voie fermentaire. . lactose + . pyocyanine + , . pyoverdine + , . résistance au cétrimide. . mannitol + , . coagulase + , . thermonuléase + , . halotolérant (capable de supporter de fortes concentrations en sel). Caractéristiques diverses 2 Streptococcus pneumoniae dans une aspiration bronchique. Coloration de Gram (x1000) En présence de quantité importante de mucus et de débris cellulaires, la capsule du pneumocoque devient particulièrement visible, sur un frottis coloré au Gram+. Le pneumocoque est une bactérie du genre Streptococcus (S. pneumoniae). Il est le plus courant des agents responsables de la pneumonie. Le pouvoir pathogène du pneumocoque repose en partie sur la multiplication bactérienne, la présence d’une capsule polysaccharidique étant un de ses principaux facteurs de virulence. C’est une bactérie exigeante en facteurs de croissance donnant des colonies muqueuses et α-hémolytiques sur gélose au sang. 25 Chapitre 1 5 La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement Résultat de l’antibiogramme réalisé sur la souche de Pseudomonas aeruginosa isolée à partir du prélèvement de Monsieur X Disque imprégné d’antibiotique Tapis bactérien Inhibition de la croissance bactérienne autour du disque QUESTIONS 1. Isolement du prélèvement sur différents milieux gélosés : milieu de Chapman, gélose Columbia au sang + ANC, gélose au cétrimide et milieu de Drigalski. Le document 3 donne la composition de ces milieux et leurs principales caractéristiques. 1.1. Q uel composant permet de dire que tous ces milieux sont des géloses ? 1.2. Les milieux de culture doivent pourvoir aux besoins élémentaires (C, H, O, N…) et énergétiques des micro-organismes : 1.2.1. Tous les milieux proposés contiennent une source d’azote, de carbone et d’énergie de même nature. Laquelle ? 1.2.2. Les milieux de Chapman et de Drigalski contiennent en plus une source de carbone et d’énergie utilisable par certains microorganismes seulement. Donner le nom de la molécule correspondante pour chaque milieu. 1.3. La présence de sang dans une gélose permet de lire le caractère hémolytique. Il existe deux types d’hémolyse : l’hémolyse α et l’hémolyse β. 1.3.1. Qu’est-ce qu’une hémolyse ? 1.3.2. Comparer ces deux types d’hémolyse d’après le document 4 . 1.4. À l’aide des documents 1 , 2 et 3 justifier le choix des milieux en précisant pour chaque milieu, parmi les bactéries citées comme pouvant être responsables de la pneumonie de Monsieur X, celles capables de s’y développer. 1.5. Préciser les conditions d’incubation puis donner l’aspect d’une colonie après culture : - de E. coli sur gélose de Drigalski ; - de Staphylococcus aureus sur gélose de Chapman. 26 2. La lecture des isolements après incubation montre : - la présence d’un seul type de colonies bleu/vert sur la gélose de Drigalski, bleu/vert fluorescent sur la gélose au cétrimide ; - l’absence de colonies sur les autres milieux. Interpréter l’ensemble des résultats obtenus. 3. Le technicien identifie la souche responsable de l’infection comme appartenant à l’espèce Pseudomonas aeruginosa. Il décide de réaliser un antibiogramme. Le résultat est présenté dans le document 5 . 3.1. Q ue signifie la présence de colonies (tapis bactérien) au contact d’un disque imprégné d’antibiotique ? 3.2. La souche isolée du lavage broncho-pulmonaire de Monsieur X pourrait-elle faire partie des BMR ? 4. Conclure sur le caractère communautaire ou nosocomial de la pneumonie de Monsieur X. Proposer une origine possible à cette infection. 3 Composition des milieux gélosés Milieu Composition (pour 1 litre de milieu) Tryptone 5,0 g Gélose de Chapman La forte concentration en chlorure de sodium inhibe la croissance des bactéries non halotolérantes. Peptone pepsique de viande 5,0 g Virage du rouge de phénol : . jaune à pH< 6,6 , . orangé entre pH= 6,6 et pH = 8 , . rouge au-delà. Chlorure de sodium 75,0 g Extrait de viande 1,0 g Mannitol 10,0 g Rouge de phénol 25,0 mg Agar agar bactériologique 15,0 g pH du milieu à 25°C 7,4 ± 0,2 Polypeptone 17,0 g Peptone pancréatique de cœur 3,0 g Gélose Columbia au sang + ANC La gélose Columbia à l’acide nalidixique et à la colistine (ANC) est un milieu sélectif de base qui, après addition de 5 % de sang de mouton, est utilisé pour la détection, l’isolement et la détermination du caractère hémolytique des bactéries à Gram positif à partir des prélèvements biologiques d’origine animale. Extrait autolytique de levure 3,0 g Amidon de maïs 1,0 g Chlorure de sodium 5,0 g Colistine 10,0 mg Acide nalidixique 15,0 mg Agar agar bactériologique 14,0 g pH du milieu à 25°C 7,3 ± 0,2 Gélose au cétrimide Gélose de Drigalski . Le cétrimide (bromure de cétyl-triméthylammonium) agit comme inhibiteur d’une grande variété de bactéries, y compris les espèces de Pseudomonas autres que Pseudomonas aeruginosa. . La production de pyocyanine (pigment bleu, non fluorescent, soluble dans l’eau et le chloroforme) est stimulée en présence de chlorure de magnésium et de sulfate de potassium. . Le milieu favorise également la production de pigments verts fluorescents (pyoverdine) par certaines souches de Pseudomonas aeruginosa. Peptone pancréatique de gélatine 20,0 g . L’inhibition des micro-organismes à Gram positif est due à la présence de sels biliaires et de cristal violet. Ce colorant inhibe principalement le développement des entérocoques et des staphylocoques. . La fermentation du lactose est révélée en présence de BBT (indicateur de pH, jaune à pH< 6 ; vert entre pH= 6 et pH = 7,6 ; bleu au-delà). . Les micro-organismes lactose négatif présentent des colonies bleu/vert à incolores. Tryptone 15,0 g Cétrimide 0,3 g Chlorure de magnésium 1,4 g Sulfate de potassium 10,0 g Agar agar bactériologique 15,0 g pH du milieu à 25°C 7,2 ± 0,2 Extrait de viande 3,0 g Extrait autolytique de levure 3,0 g Désoxycholate de sodium 1,0 g Thiosulfate de sodium 1,0 g Lactose 15,0 g Cristal violet 5,0 mg Bleu de bromothymol 80,0 mg Agar agar bactériologique 11,0 g pH du milieu 7,4 ± 0,2 4 Les deux types d’hémolyse observés sur gélose au sang Hémolyse α Hémolyse β 27 Chapitre 1 La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement ACTIVITÉ 2 ANALYSE DE PLAN D’ÉCHANTILLONNAGE EN INDUSTRIE AGROALIMENTAIRE 2. Micro-organismes recherchés ou dénombrés. 2.1. Pourquoi impose-t-on une absence de Salmonella dans la viande hachée ? 2.2. Q uelle pourrait-être l’origine de la contamination d’une viande hachée par Salmonella ? 2.3. Q ue traduit la présence d’ E. coli dans une viande hachée ? Pourquoi ? 2.4. La rubrique Zoom sur « Cas groupés de Syndrome Hémolytique et Urémique (SHU) p. 23 » montre que certaines souches d’ E. coli peuvent provoquer des maladies très graves. Quelles sont les souches incriminées ? Comment peuvent-elles être apportées dans une viande hachée ? PRÉSENTATION Un extrait du règlement (CE) n° 2073/2005 de la Commission européenne du 15 novembre 2005 concernant les critères microbiologiques applicables aux denrées alimentaires est présenté dans le tableau 1 . QUESTIONS 1. Analyse des tableaux de plan d’échantillonnage Répondre aux questions suivantes après une lecture approfondie du cours sur la démarche microbiologique dans les bio-industries (pages 18 à 24). 1.1. R appeler la signification de n, c, m et M. 1.2. D’après les renseignements fournis, précisez s’il s’agit : -- d’une analyse selon un plan à deux classes ou selon un plan à trois classes, -- d’une analyse de critère de sécurité des denrées alimentaires ou d’hygiène des procédés. 3. D’après les résultats obtenus pour deux lots analysés (document 2 ), proposer, si nécessaire, des actions correctives à mettre en œuvre par l’industriel au niveau de la chaîne de production de viande hachée. Placer les actions correctives éventuellement proposées sur le diagramme de production (document 3 ). 1 Critères microbiologiques applicables à la viande hachée Produit Micro-organisme Viande hachée Viande hachée et préparations de viande destinées à être consommées crues E. coli Salmonella Plan d’échantillonnage Limites n c m M 5 2 50 UFC/g 500 UFC/g 5 0 Absence dans 25 g 2 Résultats d’analyses n1 n2 n3 n4 n5 Lot 1 Abs. Abs. Abs. Abs. Abs. Lot 2 Abs. Abs. Abs. Prés. Abs. E.coli (UFC.g ) Lot 1 4.10 3.10 2.10 1 4.10 2.101 E.coli (UFC.g-1) Lot 2 6.102 5.101 7.102 4.102 6.102 Salmonella Salmonella -1 28 1 1 2 Norme Stade d’application ISO 16649-1 ou 2 Fin du procédé de fabrication (document 3) ISO 6579 Produits mis sur le marché pendant leur durée de conservation. 3 Diagramme de production de la viande hachée Réception des carcasses Passage en chaîne de découpe Conditionnement sous air, sous vide ou en atmosphère modifiée 29 Chapitre 1 La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement ACTIVITÉ 3 INTERPRÉTATION DE RÉSULTATS D’UNE ANALYSE D’UN PRODUIT COSMÉTIQUE PRÉSENTATION Il n’existe pas d’autorisation préalable de mise sur le marché pour les produits cosmétiques. Il incombe aux fabricants de garantir que leurs produits satisfont aux exigences législatives, réglementaires et ne présentent aucun danger pour la santé. L’objectif pour les fabricants est donc de fournir des produits cosmétiques faiblement contaminés et exempts de micro-organismes pathogènes selon les spécifications quantitatives et qualitatives précisées dans les tableaux 1 et 2 . Les tableaux 3 et 4 présentent les résultats des analyses réalisées pour différents lots de produits cosmétiques (on représente par X le résultat obtenu pour une unité d’échantillon). QUESTIONS 1. Le tableau 3 présente les résultats d’une analyse microbiologique selon un plan à trois classes correspondant au dénombrement de la FMAT (Flore mésophile aérobie totale). 1.1. Donner la classe à laquelle appartient chaque résultat d’unité d’échantillon compris entre 0 et m / entre m et M / supérieur à M. 1.2. P ourquoi a-t-on réalisé cinq analyses par lot ? 1.3. Préciser, pour chaque série de résultats, si le lot peut être accepté ou doit être refusé. 1.4. Sur quel(s) lot(s) doit-on faire une recherche de micro-organismes spécifiques ? 2. Le tableau 4 présente les résultats d’une analyse microbiologique selon un plan à deux classes avec n = 5 et c = 0 correspondant à la recherche de Candida albicans (ISO 18416/2007 Cosmétiques - Microbiologie - Détection de Candida albicans). 2.1. Préciser la valeur de m. 2.2. Préciser, pour chaque série de résultats, si le lot peut être accepté ou doit être refusé. 1 Spécifications quantitatives - Dénombrement de flore mésophile aérobie totale (FMAT) ISO 21149/2006 Cosmétiques - Microbiologie - Dénombrement et détection des bactéries aérobies mésophiles. Ce dénombrement permet d’évaluer le niveau d’hygiène générale du produit, les micro-organismes dénombrés recouvrant à la fois les bactéries, les levures et les moisissures. Il est réalisé par les techniques classiques de numération des micro-organismes (en milieu liquide, solide ou par filtration) sur des géloses non sélectives type PCA (plate count agar). m = 103 UFC.g-1 ou mL-1 M = 105 UFC.g-1 ou mL-1 n = 5 et c = 2 Produits cosmétiques de catégorie 2 (non destinés aux bébés ni à la zone oculaire) 2 Spécifications qualitatives - Recherche de micro-organismes pathogènes dits « spécifiques » Si la qualité d’hygiène générale du produit cosmétique est mauvaise (dénombrement de la FMAT non satisfaisant), la recherche des micro-organismes spécifiques suivants est effectuée. Pseudomonas aeruginosa Produits cosmétiques à usage général : absence de micro-organisme spécifique dans 1 g ou 1 mL. Staphylococcus aureus Escherichia coli Candida albicans 3 Dénombrement de la FMAT m=103 UFC.g-1 M=105 UFC.g-1 Lot 1 XXXXX Lot 2 XXX Lot 3 XXXX Lot 4 XXXX X Lot 5 XX XXX XX X 4 Recherche de Candida albicans m=M Lot w 30 XXXXX Lot x XXX XX Lot y XXXX X Lot z XX XXX Résultats de classe 1 Résultats de classe 2 CRÉDITS Pour toutes les illustrations de l’ouvrage non référencées ci-dessous : © CRDP Aquitaine PRÉSENTATION biologiste, © JPC-PROD - Fotolia.com / boîte de Petri, © grieze - Fotolia.com / bactéries, © Jezper - Fotolia.com / virus, © Karelmedical - Fotolia.com COURS Doc 1, Bryan Christie, DR / Zoom page 16, schéma d’un follicule sébacé, CC by Helix 84, wikimedia.org / Doc 2, http://bacterioweb.univ-fcomte.fr, DR / Doc 3, Edimark, DR / Doc 4, © Sebastian Kaulitzki, Fotolia.com / Doc 5, © Pascal Fraperie / Doc 6 et 7, © Valérie Perriot, CRDP Aquitaine / Zoom 1 page 23, DR / Zoom 2 page 16, © Frédéric Massard, Fotolia.com. ACTIVITÉS Doc 2, © Loyola University Chicago-Health Sciences Division / Doc 4, DR / Doc 5, http://bacterioweb.univ-fcomte.fr, DR.
