Analyse microbiologique d`un produit polymicrobien

publicité
Thème
Analyse
microbiologique
d'un produit
polymicrobien
1
2
3
La démarche de l’analyse microbiologique
La recherche d’une flore particulière
Dénombrement d’une flore d’un produit microbien
1
Chapitre
Chapitre
La démarche de l’analyse
microbiologique
ACTIVITÉS
COURS
1. Méthode qualitative et/ou méthode quantitative
14
2. Démarche de l’analyse microbiologique dans
le domaine médical14
3. Démarche de l’analyse microbiologique dans
le domaine des bio-industries
18
N°1 Infection nosocomiale ou communautaire ? 25
N°2 Analyse de plan d’échantillonnage en
industrie agroalimentaire 28
N°3 Interprétation de résultats d’une analyse d’un
produit cosmétique30
Les objectifs du
programme
Les compétences développées
en classe de première seront
réinvesties dans l’analyse
microbiologique d’un produit
polymicrobien.
L’objectif est de comprendre
la démarche choisie,
dénombrement ou recherche,
et de permettre à l’élève
de différencier les deux
méthodologies.
Chapitre 1
La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement
1. MÉTHODE QUALITATIVE ET/OU MÉTHODE QUANTITATIVE
L’analyse microbiologique est réalisée dans différents
domaines :
-- le domaine médical où cette analyse est menée sur un
prélèvement biologique effectué chez un patient dans
un but de diagnostic et de mise en place d’un traitement adapté ;
-- le domaine des bio-industries (industries agroalimentaire, pharmaceutique, cosmétique) où cette analyse est
menée :
·· sur les matières premières et les produits finis dans le
but de vérifier leur état sanitaire,
·· sur les produits en cours de fabrication, les outils ou
les appareils utilisés…, dans le but de valider un procédé de fabrication ;
-- le domaine de l’environnement où cette analyse est
menée sur un prélèvement d’eau, d’air, de surface…,
dans le but de mettre en évidence la pollution microbienne d’un écosystème.
Quel que soit le domaine dans lequel elle est réalisée,
l’analyse microbiologique permet :
-- soit de rechercher dans l’échantillon au moins un
micro-organisme spécifique, le plus souvent pathogène. L’analyse doit permettre de l’isoler et de l’identifier même s’il n’est présent qu’en très faible quantité.
L’analyse est qualitative et le résultat est rendu sous
forme de présence ou d’absence du micro-organisme
recherché dans l’échantillon ;
-- soit de quantifier dans l’échantillon une flore particulière. Cette quantification est le plus souvent appelée
dénombrement. L’analyse est quantitative et le résultat
est rendu sous forme d’une concentration en microorganismes (appartenant à une flore particulière) par
mL ou par g d’échantillon.
Le but, la démarche et les techniques développées lors de
l’analyse microbiologique dans le domaine médical sont
très différents de ceux développés dans les domaines des
bio-industries et de l’environnement. En effet, dans ces
domaines, contrairement au domaine médical, les méthodes utilisées reposent le plus souvent sur des normes
et les résultats sont interprétés en fonction de critères
microbiologiques.
2. DÉMARCHE DE L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DANS LE
DOMAINE MÉDICAL
Dans le domaine médical, l’analyse microbiologique correspond à la recherche d’un micro-organisme pathogène.
C’est donc le plus souvent une analyse qualitative.
Elle permet de poser un diagnostic direct, c’est-à-dire la
mise en évidence, dans le prélèvement effectué chez un
patient, du micro-organisme responsable des symptômes
observés.
Le micro-organisme pathogène isolé du prélèvement
subit une identification la plus complète possible. Traditionnellement, cette identification repose sur la recherche de nombreux caractères biochimiques, associée
si nécessaire à la recherche d’antigènes de surface (voir
sérogroupage/sérotypage).
Une fois le diagnostic posé grâce à la mise en évidence
et à l’identification du micro-organisme responsable, un
antibiogramme (ou un « anti-fongigramme ») est réalisé
pour mettre en place un traitement efficace.
L’analyse urinaire est relativement à part dans ce domaine : une urine normale est stérile mais ce produit biologique se retrouve souvent faiblement contaminé lors du
prélèvement (flore cutanée du méat urinaire, flore intestinale). Une « urine pathologique » caractéristique d’une
infection est par contre riche en bactéries. C’est donc le
dénombrement des bactéries urinaires qui constitue dans
ce cas un des critères les plus fiables pour le diagnostic :
on considère qu’une bactériurie supérieure à 105 bactéries par mL d’urine signe une infection. Le plus souvent
14
on retrouve une seule espèce bactérienne responsable de
l’infection (infection mono-microbienne).
L’analyse microbiologique dans le domaine médical peut
également être réalisée dans un but épidémiologique
et/ou dans le cadre de la recherche d’un portage sain
(cf. 2.1.2. « La flore pathogène » p. 17).
2.1. Les différents types de flores
microbiennes chez l’homme
Certains prélèvements biologiques effectués chez un patient, en plus de contenir le micro-organisme pathogène,
sont polymicrobiens en raison de l’existence d’une flore
commensale importante.
2.1.1. La flore commensale
Le commensalisme est une association entre un hôte (ici
l’homme) et un micro-organisme qui ne provoque pas de
trouble chez l’hôte. L’hôte fournit la « nourriture » et le
« gîte » au micro-organisme et peut tirer profit de cette
association.
Dès la naissance, l’organisme humain est en contact
constant avec les micro-organismes de son environnement
au niveau des interfaces milieu extérieur / milieu intérieur
que sont la peau et les muqueuses. Certains de ces microorganismes colonisent ces interfaces et constituent une
flore commensale résidente (document 1 ).
1 La flore commensale résidente
L’installation de ces micro-organismes inoffensifs ne
se fait pas de façon anarchique : la peau et les diverses
muqueuses n’hébergent pas les mêmes espèces microbiennes ; leur implantation et leur développement
dépendent de divers facteurs propres à chaque zone :
humidité, pH, présence de dioxygène, éléments nutritifs
particuliers…
De nombreux micro-organismes sont donc normalement présents sur la peau et les muqueuses des sujets
sains. Ils constituent les flores commensales résidentes.
La notion de flore résidente s’oppose à celle de flore transitoire, flore qui varie au cours de la journée, selon les
activités et l’environnement dans lequel évolue l’individu.
La flore commensale cutanée
La flore cutanée résidente est présente sur la partie la
plus superficielle de l’épiderme, dans les conduits des
glandes sudoripares, sébacées, et dans les follicules pileux
(c’est d’ailleurs à partir de ces cavités que la flore cutanée
se renouvelle après des soins corporels). La densité peut
varier de quelques milliers à plusieurs millions de microorganismes par cm2.
On y retrouve notamment des bactéries Gram + aérobies
appartenant essentiellement aux genres Corynebacterium
et Staphylococcus (à coagulase négative).
Au niveau cutané, on retrouve aussi une flore transitoire
composée :
-- le plus souvent de micro-organismes issus de l’environnement (eau, surfaces, plantes…) comme les
Pseudomonas, les Stenotrophomonas…
-- parfois de micro-organismes pathogènes (opportunistes) au niveau des régions cutanées les plus humides,
du périnée et des régions avoisinantes (cf. 2.1.2. « La
flore pathogène » page 17) :
·· Gram - : Entérobactéries (Klebsiella, E.coli),
·· Gram + : Staphylococcus aureus, Streptococcus,
·· levures : Candida albicans.
La flore cutanée est sélectionnée par les conditions physico-chimiques de la peau (pH acide), par les sécrétions
antibactériennes des glandes sébacées et sudoripares (lysozyme, acides gras toxiques pour les micro-organismes).
Elle est aussi régulièrement éliminée par les lavages (soins
corporels) et la desquamation de l’épiderme (élimination
naturelle des cellules mortes les plus superficielles). Elle
est donc sans cesse en renouvellement.
La peau est finalement un environnement hostile pour
les micro-organismes et à l’exception de Staphylococcus
aureus (25 % de portage sain dans la population), les bactéries appartenant à la flore transitoire en sont rapidement éliminées. Seules les espèces résidentes sont systématiquement retrouvées.
Les infections cutanées sont précédées d’un déséquilibre
écologique local multifactoriel où interviennent en proportions variables :
-- des facteurs locaux (promiscuité, hygiène corporelle, transpiration, frottement, application de corticoïdes...) ;
15
Chapitre 1
La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement
-- des facteurs généraux (déficit immunitaire, diabète,
traitement avec des immunosuppresseurs ou des corticoïdes pris par voie générale...).
Les principales infections cutanées sont dues aux microorganismes suivants :
-- infections bactériennes :
·· infections staphylococciques (à Staphylococcus aureus) : folliculite superficielle, furoncle…
·· infections streptococciques (notamment à Streptococcus pyogenes) : impétigo, érysipèle…
-- infections fongiques (mycoses cutanées) :
·· les dermatophytoses : teignes dues à des champignons microscopiques filamenteux (peau, ongle, cuir
chevelu),
·· les candidoses (à Candida albicans).
La flore commensale du tube digestif
C’est la flore la plus abondante et la plus diversifiée ; on
y retrouve jusqu’à plus de 400 espèces différentes (dont
certaines sont très difficilement cultivables in vitro).
• Au niveau de la bouche, les espèces retrouvées sont
aussi présentes dans le rhinopharynx avec comme particularité l’abondance des streptocoques surtout non
groupables (cf. Activité « Recherche de Streptococcus
pyogenes » p. 41), la présence éventuelle de Candida
albicans, d’entérobactéries et d’anaérobies. Les streptocoques jouent un rôle important dans la genèse de
la plaque dentaire. On dénombre habituellement 108 à
109 micro-organismes par mL de salive.
• Dans l’estomac et les premiers segments de l’intestin
grêle, les espèces retrouvées appartiennent essentiellement aux genres suivants : Streptococcus, Enterococcus,
Staphylococcus, Lactobacillus et Candida. L’estomac possède une flore très pauvre du fait de son acidité (pH
voisin de 2). L’intestin grêle possède aussi une flore
pauvre en raison du péristaltisme (contractions musculaires à l’origine du déplacement du bol alimentaire)
et de l’abondance des sécrétions.
• Dans le colon, les espèces prédominantes sont essentiellement des bactéries anaérobies strictes appartenant
aux genres : Bactéroides, Bifidobacterium ou Clostridium.
Les espèces aéro-anaérobies sont très minoritaires et
une espèce emblématique comme E. coli ne représente
qu’à peine 0,1 % de la population microbienne totale.
La flore colique en plus d’être extrêmement variée est
abondante : 1011 à 1012 bactéries par gramme de matière fécale.
L’analyse des selles est souvent prescrite lors de pathologies digestives. La flore fécale reflète la composition de la flore du côlon. Elle renferme donc environ
1012 bactéries/g et est constituée de :
-- 99 % de bactéries anaérobies strictes :
·· bacilles Gram - : genre Bacteroïdes,
·· bacilles Gram + : genres Bifidobacterium, Eubacterium, Clostridium…
·· coques Gram + : genres Peptococcus, Streptopeptococcus ;
-- 1 % de bactéries aéro-anaérobies :
·· bacilles Gram - : l’espèce E. coli est la plus fréquente
de toutes les bactéries aéro-anaérobies,
16
L’acné juvénile
L’acné est une dermatose inflammatoire des follicules sébacés,
affectant 90 % des adolescents.
Les conditions nécessaires à la formation des lésions de l’acné
sont :
- la séborrhée ou hypersécrétion sébacée. La sécrétion du
sébum, qui fournit un environnement riche en nutriments
(triglycérides), est déclenchée et entretenue par la sécrétion
des hormones stéroïdes sexuelles (initiation de leur sécrétion à l’adolescence) ;
- la kératinisation infundibulaire = formation d’un comédon
qui entraîne l’obstruction et la rétention du sébum dans le
follicule, d’où mise en place de conditions anaérobies ;
- la flore commensale locale et les facteurs de l’inflammation.
L’espèce dominante dans les glandes sébacées est une bactérie anaérobie stricte appelée Propionobacterium acnes.
Cette bactérie hydrolyse les triglycérides du sébum en acides
gras inflammatoires à courtes chaînes carbonées (et acide
propionique) qui pénètrent dans le derme et entrainent une
forte réaction inflammatoire. C’est cette réponse exagérée du
système immunitaire qui est responsable des lésions causées
par l’acné.
Schéma d’un follicule sébacé
·· bacilles Gram + anaérobies préférentiels : Lactobacillus,
·· coques Gram + : genres Enterococcus, Streptococcus du
groupe D…
Lors de l’observation d’un frottis de selles, après coloration
de Gram (document 2 ), on observe une flore Gram + /
Gram - dite équilibrée (proportion équivalente de Gram +
et de Gram -).
La flore intestinale est relativement stable chez un individu adulte même si elle peut être influencée par l’alimentation ou des traitements antibiotiques. Elle peut
avoir un rôle positif sur la physiologie de l’individu :
synthèse de la vitamine K, aide à l’absorption des nutriments, prévention par son équilibre de la prolifération
de bactéries commensales potentiellement dangereuses
(Clostridium difficile) et obstacle à la colonisation par des
bactéries pathogènes strictes (Salmonella, Shigella…).
2 Flore fécale normale : frottis de selles après coloration
3 Flore vaginale normale : frottis vaginal après coloration
de Gram
de Gram
4 Les principales infections bactériennes humaines
Méningites bactériennes
. Streptococcus pneumoniae
. Neisseria meningitidis
. Haemophilus influenzae
. Streptococcus agalactiae
. Listeria monocytogenes
Otites
. Streptococcus pneumoniae
Pneumonies
. Streptococcus pneumoniae
. Haemophilus influenzae
. Staphylococcus aureus
. Mycoplasma pneumoniae
. Chlamydia pneumophila
. Mycobacterium tuberculosis
Infections cutanées
. Staphylococcus aureus
. Streptococcus pyogenes
. Pseudomonas aeruginosa
Maladies sexuellement transmissibles
. Chlamydia trachomatis
. Neisseria gonorrhoeae
. Treponema pallidum
. Ureaplasma urealyticum
. Haemophilus ducreyi
La flore commensale vaginale
Elle est principalement constituée du bacille de Döderlein
(Lactobacillus acidophilus) (document 3 ). Cette bactérie
produit localement de l’acide lactique, à partir du glycogène
sécrété par les cellules vaginales, créant un environnement
acide défavorable à l’implantation d’autres espèces, éventuellement pathogènes.
2.1.2. La flore pathogène
La pathogénicité est une association entre un hôte (ici
l’homme) et un micro-organisme qui vit aux dépens de
l’hôte et provoque chez lui des troubles plus ou moins
graves. Le document 4 présente une vue générale des différentes infections bactériennes retrouvées chez l’homme.
On distingue deux types de micro-organismes pathogènes :
Infections oculaires
. Staphylococcus aureus
. Neisseria gonorrhoeae
. Chlamydia trachomatis
Sinusite
. Streptococcus pneumoniae
. Haemophilus influenzae
Infections tractus respiratoire haut
. Streptococcus pyogenes
. Haemophilus influenzae
Gastrite
. Helicobacter pylori
Intoxications alimentaires
. Campylobacter jejuni
. Salmonella
. Shigella
. Clostridium
. Staphylococcus aureus
. Escherichia coli
Infections urinaires
. Escherichia coli
. Autres Entérobacteriaceae
. Staphylococcus saprophyticus
. Pseudomonas aeruginosa
-- les pathogènes stricts (ou spécifiques) : ce sont des micro-organismes toujours pathogènes qui provoquent
chez l’hôte une maladie spécifique (par exemple Mycobacterium tuberculosis et la tuberculose, Salmonella typhi
et la fièvre typhoïde). Certains individus, bien qu’hébergeant ce type de micro-organismes, ne développent
aucun symptôme ; on parle alors de porteurs sains (ex :
Staphylococcus aureus) ;
-- les pathogènes opportunistes : ce sont des micro-organismes normalement commensaux qui deviennent
pathogènes suite à divers évènements :
·· changement de niche écologique : E. coli, commensal du tube digestif, est le premier micro-organisme
responsable d’infections urinaires basses,
·· destruction d’une partie de la flore commensale suite
17
Chapitre 1
La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement
à un traitement antibiotique : Candida albicans, commensal de la partie supérieure du tube digestif, est
responsable du muguet (infection notamment de la
bouche),
·· multiplication chez des sujets immunodéprimés ou
fragilisés (personnes ayant subi une greffe, personnes
HIV+, personnes âgées…).
Voir le Zoom p. 24 : les intoxications alimentaires d’origine microbienne.
2.1.3. Équilibre de la flore
Si les micro-organismes commensaux ne sont pas indispensables à la vie comme cela a été démontré grâce
à l’élevage d’animaux axéniques (animaux sans flore
commensale, car élevés et nourris stérilement), la flore
commensale exerce une influence non négligeable sur le
déroulement de certaines activités physiologiques.
Voici quelques rôles attribués à la flore commensale :
-- rôle de barrière écologique : par compétition pour le
gîte et les nutriments, la flore commensale empêche
l’implantation et le développement de bactéries pathogènes. De plus certaines espèces produisent des
substances toxiques pour d’autres micro-organismes :
bactériocines, acides (acide lactique et flore vaginale)…
-- rôle métabolique : production de diverses vitamines
par la flore intestinale, dégradation de certains déchets
métaboliques comme l’urée ou les bilirubines ;
-- rôle immunitaire : la flore commensale permet un
meilleur développement du système immunitaire lié à
l’appareil digestif.
2.2. Les différents types de prélèvements et les grandes étapes de leur
analyse microbiologique
Un enrichissement est nécessaire lorsque le micro-organisme est peu représenté dans le prélèvement mais que
sa présence doit être mise en évidence (c’est le cas par
exemple de la recherche de Salmonella dans un prélèvement de selles). L’enrichissement a pour but de multiplier sélectivement le micro-organisme recherché tout en
inhibant ou limitant le développement des autres flores.
Le choix des milieux ensemencés dépend du type de prélèvement et des symptômes observés chez le patient. On ne
recherchera pas une bactérie responsable d’une angine dans
un prélèvement urinaire !
Si des colonies suspectes apparaissent après incubation, elles sont repiquées pour identifier le(s) microorganisme(s) dont elles sont issues.
Les colonies suspectes sont des colonies présentant certaines caractéristiques :
-- culturales (temps d’apparition, température d’incubation, atmosphère d’incubation) ;
-- macroscopiques (aspect des colonies) ;
-- biochimiques (un ou plusieurs caractères biochimiques
mis en évidence grâce au milieu utilisé) (document 5 ).
2.2.2. Les prélèvements « mono-microbien »
Ce sont des prélèvements effectués dans des zones normalement stériles (sang, urine, liquide amniotique…).
Ces prélèvements sont ensemencés sur des milieux non
sélectifs, voire particulièrement riches dans le cas des
hémocultures (cultures de prélèvement sanguin). Si des
colonies apparaissent après incubation, on identifie le
plus précisément possible le micro-organisme dont elles
sont issues.
Rappelons que dans le cadre de l’analyse urinaire, une
bactériurie supérieure à 105 bactéries par mL est nécessaire (voir p. 14).
2.2.1. Les prélèvements « polymicrobiens »
Ce sont des prélèvements biologiques effectués dans
des zones où existe une flore commensale (selles, prélèvements de gorge, crachats,…). Ces prélèvements sont
ensemencés sur des milieux sélectifs et discriminatifs
(différentiels), après leur éventuel enrichissement.
3. DÉMARCHE DE L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DANS LE
DOMAINE DES BIO-INDUSTRIES
L’analyse microbiologique dans le domaine des bio-industries peut être réalisée :
-- au niveau de la production : validation des procédés
de fabrication dans le cadre d’une démarche qualité de
l’entreprise, validation de l’état sanitaire des matières
premières utilisées et des produits finis, pour éviter que
le consommateur ne contracte une pathologie (intoxication alimentaire par exemple) et/ou que l’industriel
ne perde sa production. Ces analyses sont menées par
le laboratoire contrôle-qualité de l’entreprise ;
18
-- au cours d’une expertise, dans le cas de l’apparition
d’une pathologie chez un certain nombre de consommateurs (intoxication alimentaire collective par
exemple), pour identifier l’aliment responsable et pour
mener des enquêtes épidémiologiques.
L’analyse microbiologique peut être réalisée sur une
(ou plusieurs) unité(s) d’échantillon. Pour garantir que
l’analyse pratiquée permette de conclure sur la qualité du
lot entier, il est nécessaire que le plan d’échantillonnage
adopté (cf. 3.1.2. page 19) soit conforme à la taille du lot
5 Exemple de colonies suspectes de Salmonella sur milieu SS
On observe ici deux types de colonies :
- des colonies roses/rouges d’une espèce bactérienne capable de
dégrader le lactose du milieu. Cette dégradation s’accompagne d’une
acidification visible par l’indicateur coloré de pH présent : rouge
neutre de couleur rouge à pH acide ;
- des colonies incolores (donc ne dégradant pas le lactose) à centre
noir. Le centre noir est lié à la réduction du thiosulfate en sulfure (H2S)
puis à la réaction des sulfures avec le fer du milieu pour donner du
sulfure de fer de couleur noire.
Les Salmonella sont des bactéries lactose - et le plus souvent H2S +.
Les colonies suspectes d’être des Salmonella sont donc ici les colonies
incolores à centre noir.
et que la procédure de fabrication ait bien été la même
pour le lot entier.
Un lot peut être considéré comme uniforme et l’(les)
unité(s) d’échantillon représentative(s) de la qualité du
lot si les fabricants ont respecté :
-- les bonnes pratiques de fabrication (BPF) pour les
médicaments et les cosmétiques ;
-- la procédure HACCP (Hazard Analysis Critical Control
Point) pour les produits alimentaires.
Voir Zoom p. 20.
3.1. Les critères microbiologiques et
les plans d’échantillonnage
3.1.1. Les limites ou critères microbiologiques
Le résultat de l’analyse microbiologique d’un bioproduit
est toujours comparé à des critères microbiologiques qui
fixent des limites réglementaires, obligatoires, ou normatives, non obligatoires (une norme est un document
descriptif, élaboré par consensus et approuvé par un organisme de normalisation reconnu, comme par exemple
l’ISO, International Organization for Standardization).
Chaque limite, fixée par la réglementation ou par une
norme, définit, en fonction des bioproduits, l’acceptabilité d’un lot ou d’un procédé en fonction :
-- de l’absence ou de la présence d’un type de micro-organisme par unité de masse ou de volume ;
-- du nombre de micro-organismes d’un type donné par
unité de masse ou de volume.
Le règlement (CE) n°2073/2005, modifié par le règlement (CE) n°1441/2007, concernant les critères microbiologiques applicables aux denrées alimentaires, définit
deux types de critères microbiologiques :
-- les critères de sécurité alimentaire définissent l’acceptabilité d’un bioproduit ou d’un lot de denrées alimentaires. Ils sont applicables aux produits tant qu’ils sont
présents sur le marché en fonction de leur Date Limite
de Consommation (DLC) ou de leur Date Limite
d’Utilisation Optimale (DLUO) (cf. Zoom p.23) ;
-- les critères d’hygiène des procédés indiquent l’acceptabilité du fonctionnement du procédé de production.
Un tel critère n’est pas applicable aux produits mis sur
le marché. Il fixe une valeur indicative de contamina-
tion dont le dépassement exige des mesures correctives
destinées à maintenir l’hygiène du procédé, conformément à la législation, mais ne permet pas de conclure
sur la conformité on non d’un bioproduit.
3.1.2. Les plans d’échantillonnage
Un plan d’échantillonnage est un ensemble d’instructions
qui indique la taille de l’échantillon (nombre d’unité(s)
d’échantillon) pour une taille de lot déterminée et qui
définit les conditions et les modalités d’une acceptation
ou d’un refus d’un lot.
Les symboles utilisés dans les plans d’échantillonnage et
leurs significations sont les suivants :
-- « n » représente le nombre d’unités de l’échantillon
prélevées au hasard dans un lot et analysées pour répondre aux exigences définies ;
-- « m » représente des concentrations acceptables de
micro-organismes :
·· dans un plan à deux classes, « m » sert à distinguer
les unités de qualité satisfaisante de celles qui sont de
qualité non satisfaisante,
·· dans un plan à trois classes, « m » sert à distinguer
les unités de qualité satisfaisante de celles qui sont de
qualité acceptable ;
-- « M » (plan à trois classes seulement) représente des
concentrations inacceptables de micro-organismes,
traduisant des conditions d’insalubrité ou d’avarie.
« M » sert à distinguer les unités de l’échantillon de
qualité acceptable de celles qui sont de qualité non
satisfaisante. Si la valeur d’une unité d’échantillonnage
est supérieure à « M », le lot dont provient l’échantillon
est inacceptable ;
-- « c » représente le nombre maximal permis d’unités
prélevées de qualité acceptable. Si le nombre d’unités
de qualité acceptable est supérieur à « c », le lot dont
provient l’échantillon est inacceptable.
Les tableaux d’interprétation prévoient donc :
-- le nombre d’unités « n » de l’échantillon ;
-- le nombre d’unités « c » de l’échantillon pouvant être
comprises entre « m » et « M » ;
-- des limites sous deux formes :
·· plan à trois classes : deux valeurs limites « m » et
« M »,
·· plan à deux classes : une valeur limite « m = M ».
19
Chapitre 1
La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement
3.1.3. L’interprétation
deux classes
selon
un
plan
à
Deux classes sont définies par unité de l’échantillon et
c = 0 (document 6 ) :
-- 1ère classe : le résultat obtenu est inférieur à m (=M) :
satisfaisant ;
-- 2e classe : le résultat obtenu est supérieur à m (=M) :
non satisfaisant (corrompu).
Si toutes les unités « n » de l’échantillon ont une valeur
inférieure ou égale à m (= M), alors l’échantillon et le lot
sont validés comme satisfaisants. Si une unité de l’échan-
tillon a une valeur supérieure à m (=M) alors l’échantillon et le lot sont refusés comme corrompus, quel que
soit le résultat des autres unités de l’échantillon.
Au cours d’une recherche où m (= M) = 0 (cas de Salmonella par exemple), on conclut à la présence ou à l’absence
du micro-organisme (pathogène) dans le volume (masse)
de bioproduit analysé. Dans ce cas, le règlement ou la
norme stipulent toujours : « absence du micro-organisme
(pathogène) dans le volume (masse) analysé ».
Si la recherche microbiologique met en évidence la présence dans le bioproduit d’au moins un micro-organisme
Les BPF
Les principes et lignes directrices de Bonnes Pratiques de Fabrication portent essentiellement sur le personnel, les
locaux et les équipements, la production, la documentation, le contrôle de la qualité et l’étiquetage.
Le personnel
Le personnel, recruté pour sa
compétence, reçoit une formation régulière. Des programmes
d’hygiène adaptés aux activités
doivent être établis. Ceux-ci
contiennent des procédures
relatives à la santé, à l’hygiène et
à l’habillement du personnel.
Les locaux et les équipements
Les locaux et les équipements de
fabrication doivent également être
soumis à des normes d’hygiène
drastiques afin d’éviter toute contamination et tout effet nocif sur la qualité
du produit.
Documentation
Le fabricant doit mettre en place un système de
documentation couvrant les différentes opérations
de fabrication réalisées. Ces documents retracent l’histoire de chaque lot produit.
Contrôle de la qualité
Le fabricant doit mettre en place un système de contrôle de la qualité. Ce système est placé sous l’autorité d’une personne indépendante de la production qui possède les qualifications requises. Cette personne peut accéder à des laboratoires de contrôle
de la qualité afin de procéder à l’examen indispensable des matières de base et des matériaux d’emballage, ainsi qu’aux essais
des produits intermédiaires et finis. Le recours à des laboratoires externes peut être autorisé. Lors du contrôle du produit fini avant
sa libération, le système de contrôle de la qualité doit notamment tenir compte des conditions de production, des résultats des
contrôles effectués pendant le processus, de l’examen des documents de fabrication et de la conformité du produit aux spécifications. Des échantillons de chaque lot de produit fini doivent être conservés au moins un an après la date de péremption. En outre,
des échantillons de certaines matières de base utilisées dans le processus de fabrication doivent être conservés au moins deux ans
après la libération du produit, période qui peut être raccourcie dans certains cas.
La procédure HACCP
L’HACCP pour Hazard Analysis Critical Control Point est un système qui identifie, évalue et maîtrise les dangers au
regard de la sécurité des aliments.
Dans la chaîne de transformation alimentaire, les dangers et les risques pour la sécurité alimentaire sont identifiés aux différentes
étapes. Ces risques conduisent à la détermination de points critiques qui doivent faire l’objet de contrôles permanents (Critical Control
Point). Pour chacun de ces points (CCP), des valeurs numériques et des seuils de tolérance sont fixés. Puis les contrôles sont régulièrement menés. Une documentation des enregistrements obtenus par ces contrôles doit être maintenue à jour. Les limites numériques de
tolérance sont souvent données par la réglementation.
Le Codex Alimentarius décrit la mise en place de l’HACCP, démarche basée sur sept principes dont la mise en œuvre suit une séquence
logique de douze étapes.
Les 7 principes :
1. Procéder à une analyse des dangers.
2. Déterminer les points critiques pour la maîtrise (CCP).
3. Établir les limites critiques.
4. Établir un système afin de surveiller la maîtrise du CCP.
5. Établir l’action corrective.
6. Établir les procédures de vérification pour confirmer que
l’HACCP fonctionne.
7. Établir la documentation des procédures et des enregistrements.
20
Les 12 étapes du HACCP :
1.  Constituer l’équipe HACCP (compétences et organisation).
2.  Décrire le produit (la cible).
3.  Déterminer son utilisation prévue (le contexte).
4.  Établir le diagramme des opérations (les processus).
5.  Vérifier sur place le diagramme (validation des processus).
6.  Énumérer les dangers (agents pathogène), analyser les
risques (probabilité d’apparition du dommage).
7.  Déterminer les CCP (application de l’analyse des risques).
8. Fixer les seuils limites, souvent réglementaires, pour chaque
CCP (quantifier la tolérance).
9. Mettre en place un système de surveillance pour chaque CCP
(pilotage, système de surveillance).
10. Prendre les mesures correctives (pilotage et correction).
11. Appliquer les procédures de vérifications (contrôle).
12. Tenir les registres et constituer un dossier (enregistrement
qualité).
6 Plan d'interprétation à deux classes
non
satisfaisant
satisfaisant
2
1
7 Plan d'interprétation à trois classes
satisfaisant
1
acceptable
non
satisfaisant
2
recherché, le bioproduit est considéré comme corrompu
et il est rejeté, ainsi que le lot dont il est issu.
3.1.4. L’interprétation selon un plan à trois
classes
Trois classes sont définies par unité de l’échantillon (document 7 ) :
-- 1ère classe : le résultat obtenu est inférieur à m : satisfaisant ;
-- 2e classe : le résultat obtenu est compris entre m et M :
acceptable ;
-- 3e classe : le résultat obtenu est supérieur à M : non
satisfaisant.
Si une seule unité de l’échantillon a une valeur supérieure
à M alors l’échantillon et le lot sont refusés comme corrompus, quel que soit le résultat des autres unités de
l’échantillon. Si toutes les unités de l’échantillon ont une
valeur inférieure à m, l’échantillon et le lot sont validés
comme satisfaisants.
Si n1 unités de l’échantillon sont inférieures à m et n2
unités sont comprises entre m et M, le paramètre « c »
permet alors de conclure : si n2 ≤ « c », l’échantillon et le
lot sont validés comme acceptables ; si n2 > « c », l’échantillon et le lot sont refusés comme corrompus.
3.2. Démarche dans le domaine
agroalimentaire
Les aliments contiennent généralement des micro-organismes de diverses provenances :
-- micro-organismes présents dans les matières premières
utilisées pour la fabrication de l’aliment (micro-organismes commensaux et/ou pathogènes pour des matières premières d’origine animale, micro-organismes
saprophytes pour les matières premières d’origine végétale) ;
-- micro-organismes apportés lors de transformation de
la matière première :
·· micro-organismes issus des manipulateurs (commensaux et/ou pathogènes) et/ou du matériel et/ou
des locaux,
3
·· micro-organismes utiles, introduits volontairement
pour réaliser la transformation de la matière première (lait) en produit fini (yaourts ou fromage). Ces
micro-organismes utiles et sélectionnés sont qualifiés de « ferments » ; en effet la transformation de
la matière première est souvent liée à un processus
fermentaire (fermentation = voie métabolique réalisée sans consommation de dioxygène où l’accepteur
terminal d’électrons est une molécule organique).
La majorité des aliments ne sont pas des bioproduits stériles (sauf ceux ayant subit une stérilisation comme le
lait UHT) ; il est donc nécessaire de respecter un certain
nombre de règles pour assurer leur qualité sanitaire et
leur qualité marchande, ainsi que le maintien de ces qualités (voir le Zoom sur HACCP p. 30) :
-- bonne qualité sanitaire des matières premières pour
éviter la présence de micro-organismes pathogènes ;
-- bonnes pratiques d’hygiène du personnel, comme le
lavage des mains, pour éviter la contamination par des
micro-organismes fécaux (Escherichia coli) ou par des
micro-organismes pathogènes (Staphylococcus aureus) ;
-- bonnes pratiques de nettoyage et de désinfection des
locaux et du matériel utilisé ;
-- bonnes conditions de conservation, comme la réfrigération, pour éviter la prolifération des micro-organismes.
Si ces règles ne sont pas respectées, la flore de l’aliment
pourra renfermer des micro-organismes saprophytes et
commensaux en grande quantité voire des micro-organismes pathogènes si l’homme ou l’animal sont malades
ou porteurs sains : ces micro-organismes peuvent alors
provoquer une intoxication alimentaire chez le consommateur.
La présence en grande quantité de ces micro-organismes
peut aussi être la cause de l’altération des qualités organoleptiques des aliments (modification de l’aspect, de la
couleur, de l’odeur, du goût) et engendrer des pertes économiques importantes pour les industriels (perte de la
qualité marchande des aliments).
L’analyse microbiologique d’un aliment comprend donc :
-- le dénombrement de micro-organismes témoins
21
Chapitre 1
La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement
d’hygiène générale (flore mésophile aérobie totale
FMAT) ;
-- le dénombrement de bactéries témoins d’une contamination fécale (Enterococcus, coliformes fécaux et
E. coli…) ;
-- le dénombrement et/ou la recherche de bactéries pathogènes (Staphylococcus aureus, Salmonella …).
Une fois l’analyse microbiologique de l’aliment achevée,
tous les résultats sont regroupés et on donne une appréciation globale sur l’aliment. Il suffit d’un seul résultat
corrompu pour rejeter l’aliment.
3.3. Démarche dans le domaine des
produits cosmétiques
Un produit cosmétique est « une substance ou une préparation destinée à être mise en contact avec les diverses
parties superficielles du corps humain, notamment l’épiderme, les systèmes pileux et capillaire, les ongles, les
lèvres et les organes génitaux externes, ou avec les dents
et les muqueuses buccales, en vue, exclusivement ou principalement, de les nettoyer, de les parfumer, d’en modifier
l’aspect, de les protéger, de les maintenir en bon état ou
de corriger les odeurs corporelles » (cf. article L.5131-1
du code de la santé publique).
L’utilisation d’un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant des micro-organismes pathogènes
peut avoir des conséquences graves sur l’écologie cutanée
de l’utilisateur, surtout sur une peau lésée ou chez des
individus immunodéprimés. L’objectif pour les fabricants
de matières premières, comme pour ceux des produits
finis, est de fournir des produits faiblement contaminés
et exempts de micro-organismes pathogènes.
De plus, la formulation des produits cosmétiques comprend la présence de conservateurs qui doivent limiter
la contamination secondaire du produit et assurer sa
conservation dans le temps. L’efficacité de ces conservateurs est évaluée par la technique du Challenge test
ou « test de contamination artificielle » (cf. Activité 3
« Challenge test » p. 30).
Il n’existe pas d’autorisation préalable de mise sur le
marché pour les produits cosmétiques. Il incombe aux
fabricants de garantir que leurs produits satisfont aux
exigences législatives, réglementaires, et ne présentent
aucun danger pour la santé. Afin de répondre à cette
exigence (Règlement Cosmétique (CE) 1223/2009
du Parlement européen et du conseil, applicable dès le
11 juillet 2013), les analyses microbiologiques des produits cosmétiques comprennent le contrôle des matières
premières et ingrédients, des produits intermédiaires et
des produits finis :
-- dénombrement de la flore totale (FMAT), comme critère d’hygiène générale. Les critères microbiologiques
dépendent du produit analysé :
·· matière première : FMAT : ≤ 105 UFC.g-1,
·· produit fini de catégorie 1 (enfants, yeux et mu-
queuses) : FMAT ≤ 102 UFC.g-1,
·· produit fini de catégorie 2 (autres produits) : FMAT
≤ 103 UFC.g-1 ;
-- recherche et identification de micro-organismes (pathogènes) dans les produits finis, réalisées si et seulement si la recherche de la FMAT a donné un résultat
corrompu : on recherche alors la présence de Candida
albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli. Le résultat attendu est « absence dans
0,1 ou 0,5 g » selon le produit.
3.4. Démarche dans le domaine
pharmaceutique
Les laboratoires contrôle-qualité de l’industrie pharmaceutique reçoivent deux types d’échantillons à analyser :
• les échantillons qui doivent être stériles, tels les médicaments injectables, les collyres ou certains dispositifs médicaux implantables. Quel que soit le mode
de préparation des produits stériles, la réglementation
impose une vérification de la stérilité des produits
(Pharmacopée européenne 1 2.6.1. Essai de stérilité) ;
• les échantillons qui peuvent tolérer un certain niveau
de contamination. Leur analyse microbiologique doit
obéir aux indications de la pharmacopée qui précise
les protocoles et les milieux à utiliser en fonction des
recherches effectuées :
·· Pharmacopée européenne 2.6.12. : contrôle microbiologique des micro-organismes non stériles et
dénombrement des germes aérobies viables totaux,
·· Pharmacopée européenne 2.6.13. : contrôle microbiologique des produits non stériles et recherche de
micro-organismes spécifiés (Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, E. coli, Salmonella).
Le tableau 8 présente des exemples de critères microbiologiques par g ou mL de divers produits non stériles.
1. Pharmacopée = registre officiel, révisé périodiquement par une commission scientifique, publié par chaque pays et qui sert de norme légale et obligatoire
pour la spécification, la préparation, l’essai... des médicaments.
22
8 Quelques critères microbiologiques (en UFC.g-1)
Produit de Catégorie 3B
Produit de Catégorie 2
Préparations pour application locale ou pour administration Préparations pour administration orale contenant
dans les voies respiratoires, à l’exception des préparations des matières premières d’origine naturelle, lorsqu’un
pré-traitement antimicrobien est impossible et que les
obligatoirement stériles, et dispositifs transdermiques.
matières premières peuvent avoir une contamination
> 103 UFC/g ou 10 mL.
- Bactéries aérobies viables : < 102
- Champignons : < 102
- Entérobactéries : < 102
- Pseudomonas aeruginosa : absence
- Staphylococcus aureus : absence
- Bactéries aérobies viables : < 104
- Champignons : < 102
- Entérobactéries : < 102
- Staphylococcus aureus : absence
- E. coli : absence
- Salmonella : absence pour 10 g ou 10 mL
DLC et DLUO
La date limite de consommation (DLC), ou date de
péremption, est une date figurant sur les denrées alimentaires
microbiologiquement périssables susceptibles, après une
courte période, de présenter un danger immédiat pour la
santé humaine. Elle est déterminée par le producteur, sauf
pour quelques produits pour lesquels elle est fixée par la
réglementation.
La date limite d’utilisation optimale (DLUO) est une date
indiquée sur l’emballage de certaines denrées au-delà de
laquelle leurs qualités organoleptiques et nutritionnelles ne
sont plus garanties : elles risquent d’avoir moins de goût,
moins de vitamines, une consistance différente, sans pour
autant constituer un danger pour la santé. Leur vente au-delà
de la date limite d’utilisation optimale n’est pas interdite.
Les cas groupés de
Syndrome Hémolytique et
Urémique et de diarrhées sanglantes à
E. coli
Sud-Ouest de la France, octobre 2005 :
« Une bactérie toxique
dans des steaks
hachés » : C’est la plus
importante épidémie de
Syndrome Hémolytique
et Urémique (SHU) liée à
une intoxication alimentaire jamais observée en
France (69 cas recensés,
entrainant l’hospitalisation de 46 d’entre eux
dont 17 enfants âgés de
2 à 11 ans présentant un
SHU).
L’infection par la bactérie
E. coli O157 est une
infection rare mais
grave… ; la contamination se fait par voie
alimentaire, cette bactérie est contenue dans le tube digestif
des bovins de manière asymptomatique. À l’origine de
cette épidémie, on retrouve une contamination du muscle
(la viande) par les intestins infectés. Si la viande avait été
vendue sous forme de steak non haché, la cuisson aurait
détruit les bactéries localisées à la surface de la viande. En
revanche, le fait de l’avoir hachée a projeté les bactéries au
cœur du steak et, de ce fait, elles n’ont pas été détruites par
la cuisson… Allemagne, printemps 2011 :
« La bactérie Escherichia coli O104 a défrayé la chronique,
et pour cause : elle a été responsable d’une épidémie
meurtrière en Allemagne, 4 000 personnes ayant souffert de
diarrhée simple ou sanglante, de colite hémorragique. Plus
de 800 d’entre elles ont développé des complications graves
entraînant notamment un syndrome hémolytique et urémique
(SHU) à l’origine de défaillances rénales. Quelque 50 décès
furent recensés ». À l’origine de cette intoxication alimentaire
on a suspecté l’ingestion de graines germées ayant été arrosées avec de l’eau contaminée par les excréments de bovins
porteurs de cette bactérie.
23
Chapitre 1
La démarche
l’analyse
microbiologique
: recherche
et/ou dénombrement
L’eau,deun
composant
essentiel des
organismes
vivants
Les intoxications alimentaires d’origine microbienne
A. L’intoxination alimentaire
C’est une maladie contractée suite à l’ingestion d’un aliment contenant une toxine microbienne préformée dans l’aliment et responsable
des symptômes observés.
C’est par exemple le mode d’action de Staphylococcus aureus enterotoxinogène. L’aliment est initialement contaminé par l’homme :
individus porteurs sains (portage au niveau du rhinopharynx) ou malades (atteints de lésions cutanées suppurées par exemple), ou par
des animaux : lait de vache contaminé suite à une mammite (inflammation des mamelles). Si l’aliment est laissé au moins 2 à 3 h à température ambiante, S. aureus s’y multiplie et y libère son entérotoxine. Celle-ci est thermostable : elle n’est pas détruite par une cuisson
éventuelle. La toxine est par la suite ingérée avec l’aliment et agit rapidement au niveau des entérocytes (cellules de la paroi du tube
digestif) en provoquant une fuite hydrominérale (diarrhée), quelques heures après l’ingestion. La toxine peut être présente dans l’aliment
alors que le micro-organisme responsable de sa production peut déjà en avoir disparu.
B. L’infection d’origine alimentaire ou toxi-infection alimentaire
C’est une maladie contractée suite à l’ingestion de nourriture ou de boisson contaminées par des agents pathogènes vivants (bactérie,
parasite), qui une fois ingérés vont se multiplier chez l’individu. Si les conditions sont favorables (rupture de la chaîne du froid par
exemple), les bactéries entéropathogènes (bactéries pathogènes pour le tube digestif dont la paroi est composée d’entérocytes) se multiplient dans l’aliment et provoquent chez l’individu qui le consomme une toxi-infection si la dose ingérée est suffisante.
La dose infectante est très variable selon les bactéries :
-- l’ingestion de 1 à 100 bactéries viables suffit pour déclencher une shigellose à Shigella dysenteriae ;
-- l’ingestion de 105 à 108 germes viables est nécessaire pour déclencher une salmonellose à Salmonella enterica.
Dans ces maladies, les bactéries entéropathogènes affectent les fonctions d’absorption et de sécrétion des entérocytes. Il y a donc fuite
hydrominérale (diarrhée) suite à l’augmentation de la quantité d’eau et de sels minéraux dans la lumière intestinale. La diarrhée due à
une toxi-infection intestinale peut être considérée comme un mécanisme protecteur puisqu’elle permet à l’hôte d’éliminer des micro-organismes pathogènes.
Dans certains cas de diarrhée, le micro-organisme responsable de l’infection est largement prédominant dans les matières fécales : lors
de l’analyse microbiologique on le retrouve en culture presque pure. On observe donc une flore fécale déséquilibrée dont il faut identifier la bactérie dominante. C’est le cas du choléra (Vibrio cholerae).
Dans d’autres cas, le micro-organisme responsable de l’infection n’est présent qu’en faible concentration dans les selles (on rappelle
que la flore commensale digestive au niveau du colon contient jusqu’à 1012 micro-organismes par gramme). On observe donc une flore
fécale équilibrée.
C’est le cas de la plupart des salmonelloses mineures et des shigelloses. Pourtant la moindre présence de Salmonella ou de Shigella
dans une selle indique toujours une infection intestinale (bactéries pathogènes strictes, absentes de la flore commensale normale). Il faut
alors être capable de les mettre en évidence parmi tous les autres micro-organismes présents.
Les infections d’origine alimentaires peuvent être dues à l’ingestion de deux types de bactéries.
1. L’ingestion de bactéries entérotoxiques
C’est le mode d’action de plusieurs espèces du genre Vibrio
(V. cholerae, V. parahaemolyticus), de Clostridum perfringens
de type A, des E. coli entérotoxiques (ECET) et entérohémorragique (ECEH) et, à un degré moindre, de Bacillus cereus.
Une fois dans l’intestin, elles adhèrent à l’épithélium intestinal
et sécrètent une entérotoxine. Celle-ci agit alors sur les
entérocytes où elle inhibe l’absorption d’eau et d’électrolytes,
tandis qu’elle stimule leur sécrétion. Il s’ensuit une fuite
hydrominérale vers la lumière intestinale, à l’origine de
diarrhées. Les selles ne contiennent ni sang, ni leucocytes car
l’épithélium digestif n’est pas détruit (pas d’invasion bactérienne).
Remarque : les salmonelloses mineures (gastroentérite
bactérienne) reposent sur un mécanisme mixte : invasion de la
muqueuse et production lors de la multiplication dans l’individu
d’une toxine responsable de certains des symptômes observés.
2. L’ingestion de bactéries entéroinvasives
C’est le cas des Salmonella, Shigella, E.coli entéroinvasifs
(ECEI), Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejunii. Une fois
dans l’intestin, ces bactéries colonisent l’épithélium intestinal
selon le mécanisme décrit dans le schéma ci-contre.
Généralement, la réaction inflammatoire suffit pour stopper le
processus et la guérison est spontanée. Cependant, une dissémination par voie sanguine et lymphatique est possible chez
les sujets immunodéprimés.
Par ailleurs, certains malades continuent à héberger et donc
à éliminer des Salmonella ou des Shigella dans leurs selles,
jusqu’à un mois après guérison. Ce sont des porteurs sains
(porteurs asymptomatiques). Par la suite, s’ils ne respectent pas
les règles élémentaires d’hygiène, ils risquent de contaminer
les aliments en les manipulant.
24
Bactéries entéroinvasives
 INGESTION d’un aliment contaminé
 INVASION de la muqueuse intestinale :
multiplication des bactéries dans l’entérocyte.
°bis PROPAGATION des
bactéries vers le tissu
conjonctif sous-jascent
(Salmonella).
 ADHÉSION des
bactéries aux
microvillosités des
entérocytes.
5°/ FUITE
 PROPAGATION des
bactéries vers les entérocytes
voisins et DESTRUCTION des
entérocytes (shigella, ECEI) .
HYDROMINÉRALE
Paroi intestinale
DIARRHÉE (avec présence de sang, de
mucus, de leucocytes dans les selles)
 bis RÉACTION INFLAMMATOIRE et
phagocytose des bactéries.
ACTIVITÉ 1
INFECTION NOSOCOMIALE OU COMMUNAUTAIRE ?
PRÉSENTATION
Une infection communautaire est une infection contractée
dans son environnement quotidien (lieu de travail,
transport en commun, école…).
Une infection nosocomiale est une infection contractée
dans un établissement de santé. Une infection est dite
nosocomiale (ou hospitalière) si elle est absente lors de
l’admission du patient à l’hôpital et qu’elle se développe
48 heures au moins après son entrée.
Ces infections peuvent être :
-- d’origine endogène : le malade s’infecte avec ses propres
micro-organismes ;
-- d’origine exogène. Il peut alors s’agir :
·· d’infections croisées, transmises d’un malade à l’autre
par les mains ou les instruments de travail du personnel médical ou paramédical,
·· d’infections provoquées par les micro-organismes du
personnel,
·· d’infections liées à la contamination de l’environnement hospitalier (eau, air, matériel, alimentation...).
Les infections nosocomiales les plus fréquentes sont les
infections urinaires (30 %), les pneumopathies infectieuses
(15 %) et les infections de la plaie opératoire (14 %).
Les trois bactéries le plus souvent rencontrées, lors de ces
infections, sont Escherichia coli (25 %), Staphylococcus aureus
(19 %) et Pseudomonas aeruginosa (10 %). Leurs principales
caractéristiques sont présentées dans le document 1 .
Ces bactéries sont le plus souvent multi-résistantes aux
antibiotiques. Le traitement d’infections nosocomiales
pour lesquelles sont impliquées des Bactéries Multi
Résistantes (BMR) apparaît donc souvent problématique.
Suite à une hémoptysie (rejet de sang par la bouche
provenant des voies aériennes), Monsieur X est hospitalisé
et subit une bronchoscopie. Il développe depuis son
hospitalisation une pneumonie importante. Le délai
d’apparition des symptômes (environ une cinquantaine
d’heures après son admission) ne permet pas à lui seul de
déterminer l’origine communautaire ou nosocomiale de
cette infection. Le médecin décide d’adresser au laboratoire
de microbiologie de l’hôpital les eaux d’un lavage bronchoalvéolaire pour identifier la souche responsable, vérifier sa
sensibilité à différents antibiotiques et déterminer son
origine (hospitalière ou communautaire).
Les pneumonies extrahospitalières (communautaires)
sont principalement dues à Streptococcus pneumoniae
(document 2 ).
1 Caractéristiques des principales espèces responsables d’infections nosocomiales
Nom de l’espèce
E.coli
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Caractéristiques
culturales
Non exigeant, mésophile.
Non exigeant, mésophile.
Non exigeant, mésophile.
Caractéristiques
morphologiques
Bacille Gram -, mobile par
ciliature péritriche.
Bacille Gram -, mobile par
ciliature polaire.
Coques Gram +, regroupés en amas.
Caractères
biochimiques de
famille ou de genre
Famille des Enterobacteriaceae
. oxydase - ,
. aéro-anaérobie ,
. glucose + par voie fermentaire,
. nitrate réductase + stade
nitrite.
Genre Pseudomonas
. oxydase + ,
. aérobie strict ,
. glucose + par voie oxydative,
. nitrate réductase +, stade
diazote.
Famille des Staphylococcaceae
. catalase + ,
. aéro-anaérobie ,
. glucose + par voie fermentaire.
. lactose +
. pyocyanine + ,
. pyoverdine + ,
. résistance au cétrimide.
. mannitol + ,
. coagulase + ,
. thermonuléase + ,
. halotolérant (capable de supporter de
fortes concentrations en sel).
Caractéristiques
diverses
2 Streptococcus pneumoniae dans une aspiration bronchique. Coloration de Gram (x1000)
En présence de quantité
importante de mucus et de
débris cellulaires, la capsule
du pneumocoque devient
particulièrement visible, sur
un frottis coloré au Gram+.
Le pneumocoque est une bactérie du genre Streptococcus
(S. pneumoniae). Il est le plus courant des agents responsables de la
pneumonie.
Le pouvoir pathogène du pneumocoque repose en partie
sur la multiplication bactérienne, la présence d’une capsule
polysaccharidique étant un de ses principaux facteurs de virulence.
C’est une bactérie exigeante en facteurs de croissance donnant des
colonies muqueuses et α-hémolytiques sur gélose au sang.
25
Chapitre 1
5 La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement
Résultat de l’antibiogramme réalisé sur la souche de Pseudomonas aeruginosa isolée à partir du
prélèvement de Monsieur X
Disque imprégné d’antibiotique
Tapis bactérien
Inhibition de la croissance
bactérienne autour du disque
QUESTIONS
1. Isolement du prélèvement sur différents milieux
gélosés : milieu de Chapman, gélose Columbia au sang
+ ANC, gélose au cétrimide et milieu de Drigalski.
Le document 3 donne la composition de ces milieux
et leurs principales caractéristiques.
1.1. Q uel composant permet de dire que tous ces
milieux sont des géloses ?
1.2. Les milieux de culture doivent pourvoir aux besoins
élémentaires (C, H, O, N…) et énergétiques des
micro-organismes :
1.2.1. Tous les milieux proposés contiennent une
source d’azote, de carbone et d’énergie de
même nature. Laquelle ?
1.2.2. Les milieux de Chapman et de Drigalski
contiennent en plus une source de carbone
et d’énergie utilisable par certains microorganismes seulement. Donner le nom de
la molécule correspondante pour chaque
milieu.
1.3. La présence de sang dans une gélose permet de
lire le caractère hémolytique. Il existe deux types
d’hémolyse : l’hémolyse α et l’hémolyse β.
1.3.1. Qu’est-ce qu’une hémolyse ?
1.3.2. Comparer ces deux types d’hémolyse
d’après le document 4 .
1.4. À l’aide des documents 1 , 2 et 3 justifier
le choix des milieux en précisant pour chaque
milieu, parmi les bactéries citées comme pouvant
être responsables de la pneumonie de Monsieur
X, celles capables de s’y développer.
1.5. Préciser les conditions d’incubation puis donner
l’aspect d’une colonie après culture :
- de E. coli sur gélose de Drigalski ;
- de Staphylococcus aureus sur gélose de Chapman.
26
2. La lecture des isolements après incubation montre :
- la présence d’un seul type de colonies bleu/vert sur
la gélose de Drigalski, bleu/vert fluorescent sur la
gélose au cétrimide ;
- l’absence de colonies sur les autres milieux.
Interpréter l’ensemble des résultats obtenus.
3. Le technicien identifie la souche responsable de
l’infection comme appartenant à l’espèce Pseudomonas
aeruginosa. Il décide de réaliser un antibiogramme. Le
résultat est présenté dans le document 5 .
3.1. Q ue signifie la présence de colonies (tapis
bactérien) au contact d’un disque imprégné
d’antibiotique ?
3.2. La souche isolée du lavage broncho-pulmonaire
de Monsieur X pourrait-elle faire partie des
BMR ?
4. Conclure sur le caractère communautaire ou
nosocomial de la pneumonie de Monsieur X. Proposer
une origine possible à cette infection.
3 Composition des milieux gélosés
Milieu
Composition (pour 1 litre de milieu)
Tryptone 5,0 g
Gélose de
Chapman
La forte concentration en chlorure de sodium
inhibe la croissance des bactéries non
halotolérantes.
Peptone pepsique de viande 5,0 g
Virage du rouge de phénol :
. jaune à pH< 6,6 ,
. orangé entre pH= 6,6 et pH = 8 ,
. rouge au-delà.
Chlorure de sodium 75,0 g
Extrait de viande 1,0 g
Mannitol 10,0 g
Rouge de phénol 25,0 mg
Agar agar bactériologique 15,0 g
pH du milieu à 25°C 7,4 ± 0,2
Polypeptone 17,0 g
Peptone pancréatique de cœur 3,0 g
Gélose
Columbia
au sang +
ANC
La gélose Columbia à l’acide nalidixique et à la
colistine (ANC) est un milieu sélectif de base
qui, après addition de 5 % de sang de mouton,
est utilisé pour la détection, l’isolement et la
détermination du caractère hémolytique des
bactéries à Gram positif à partir des prélèvements
biologiques d’origine animale.
Extrait autolytique de levure 3,0 g
Amidon de maïs 1,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Colistine 10,0 mg
Acide nalidixique 15,0 mg
Agar agar bactériologique 14,0 g
pH du milieu à 25°C 7,3 ± 0,2
Gélose au
cétrimide
Gélose de
Drigalski
. Le cétrimide (bromure de cétyl-triméthylammonium) agit comme inhibiteur d’une grande
variété de bactéries, y compris les espèces
de Pseudomonas autres que Pseudomonas
aeruginosa.
. La production de pyocyanine (pigment bleu, non
fluorescent, soluble dans l’eau et le chloroforme)
est stimulée en présence de chlorure de
magnésium et de sulfate de potassium.
. Le milieu favorise également la production de
pigments verts fluorescents (pyoverdine) par
certaines souches de Pseudomonas aeruginosa.
Peptone pancréatique de gélatine 20,0 g
. L’inhibition des micro-organismes à Gram positif
est due à la présence de sels biliaires et de
cristal violet. Ce colorant inhibe principalement
le développement des entérocoques et des
staphylocoques.
. La fermentation du lactose est révélée en
présence de BBT (indicateur de pH, jaune à
pH< 6 ; vert entre pH= 6 et pH = 7,6 ; bleu au-delà).
. Les micro-organismes lactose négatif présentent
des colonies bleu/vert à incolores.
Tryptone 15,0 g
Cétrimide 0,3 g
Chlorure de magnésium 1,4 g
Sulfate de potassium 10,0 g
Agar agar bactériologique 15,0 g
pH du milieu à 25°C 7,2 ± 0,2
Extrait de viande 3,0 g
Extrait autolytique de levure 3,0 g
Désoxycholate de sodium 1,0 g
Thiosulfate de sodium 1,0 g
Lactose 15,0 g
Cristal violet 5,0 mg
Bleu de bromothymol 80,0 mg
Agar agar bactériologique 11,0 g
pH du milieu 7,4 ± 0,2
4 Les deux types d’hémolyse observés sur gélose au sang
Hémolyse α
Hémolyse β
27
Chapitre 1
La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement
ACTIVITÉ 2
ANALYSE DE PLAN D’ÉCHANTILLONNAGE EN INDUSTRIE AGROALIMENTAIRE
2. Micro-organismes recherchés ou dénombrés.
2.1. Pourquoi impose-t-on une absence de Salmonella
dans la viande hachée ?
2.2. Q uelle pourrait-être l’origine de la contamination
d’une viande hachée par Salmonella ?
2.3. Q ue traduit la présence d’ E. coli dans une viande
hachée ? Pourquoi ?
2.4. La rubrique Zoom sur « Cas groupés de Syndrome
Hémolytique et Urémique (SHU) p. 23 » montre
que certaines souches d’ E. coli peuvent provoquer
des maladies très graves. Quelles sont les souches
incriminées ? Comment peuvent-elles être
apportées dans une viande hachée ?
PRÉSENTATION
Un extrait du règlement (CE) n° 2073/2005 de la
Commission européenne du 15 novembre 2005
concernant les critères microbiologiques applicables aux
denrées alimentaires est présenté dans le tableau 1 .
QUESTIONS
1. Analyse des tableaux de plan d’échantillonnage
Répondre aux questions suivantes après une lecture
approfondie du cours sur la démarche microbiologique
dans les bio-industries (pages 18 à 24).
1.1. R
appeler la signification de n, c, m et M.
1.2. D’après les renseignements fournis, précisez s’il
s’agit :
-- d’une analyse selon un plan à deux classes ou
selon un plan à trois classes,
-- d’une analyse de critère de sécurité des denrées
alimentaires ou d’hygiène des procédés.
3. D’après les résultats obtenus pour deux lots analysés (document 2 ), proposer, si nécessaire, des actions
correctives à mettre en œuvre par l’industriel au niveau
de la chaîne de production de viande hachée. Placer
les actions correctives éventuellement proposées sur le
diagramme de production (document 3 ).
1 Critères microbiologiques applicables à la viande hachée
Produit
Micro-organisme
Viande hachée
Viande hachée
et préparations
de viande
destinées à être
consommées
crues
E. coli
Salmonella
Plan
d’échantillonnage
Limites
n
c
m
M
5
2
50 UFC/g
500 UFC/g
5
0
Absence dans 25 g
2 Résultats d’analyses
n1
n2
n3
n4
n5
Lot 1
Abs.
Abs.
Abs.
Abs.
Abs.
Lot 2
Abs.
Abs.
Abs.
Prés.
Abs.
E.coli (UFC.g )
Lot 1
4.10
3.10
2.10
1
4.10
2.101
E.coli (UFC.g-1)
Lot 2
6.102
5.101
7.102
4.102
6.102
Salmonella
Salmonella
-1
28
1
1
2
Norme
Stade
d’application
ISO 16649-1
ou 2
Fin du procédé
de fabrication
(document 3)
ISO 6579
Produits mis sur le
marché pendant
leur durée de
conservation.
3 Diagramme de production de la viande hachée
Réception des carcasses
Passage en chaîne de découpe
Conditionnement sous air, sous
vide ou en atmosphère modifiée
29
Chapitre 1
La démarche de l’analyse microbiologique : recherche et/ou dénombrement
ACTIVITÉ 3
INTERPRÉTATION DE RÉSULTATS D’UNE ANALYSE D’UN PRODUIT COSMÉTIQUE
PRÉSENTATION
Il n’existe pas d’autorisation préalable de mise sur le
marché pour les produits cosmétiques. Il incombe aux
fabricants de garantir que leurs produits satisfont aux
exigences législatives, réglementaires et ne présentent
aucun danger pour la santé.
L’objectif pour les fabricants est donc de fournir des
produits cosmétiques faiblement contaminés et
exempts de micro-organismes pathogènes selon les
spécifications quantitatives et qualitatives précisées
dans les tableaux 1 et 2 .
Les tableaux 3 et 4 présentent les résultats des
analyses réalisées pour différents lots de produits
cosmétiques (on représente par X le résultat obtenu
pour une unité d’échantillon).
QUESTIONS
1. Le tableau 3 présente les résultats d’une analyse
microbiologique selon un plan à trois classes
correspondant au dénombrement de la FMAT
(Flore mésophile aérobie totale).
1.1. Donner la classe à laquelle appartient chaque
résultat d’unité d’échantillon compris entre 0
et m / entre m et M / supérieur à M.
1.2. P
ourquoi a-t-on réalisé cinq analyses par lot ?
1.3. Préciser, pour chaque série de résultats, si le
lot peut être accepté ou doit être refusé.
1.4. Sur quel(s) lot(s) doit-on faire une recherche
de micro-organismes spécifiques ?
2. Le tableau 4 présente les résultats d’une analyse
microbiologique selon un plan à deux classes avec
n = 5 et c = 0 correspondant à la recherche de
Candida albicans (ISO 18416/2007 Cosmétiques
- Microbiologie - Détection de Candida albicans).
2.1. Préciser la valeur de m.
2.2. Préciser, pour chaque série de résultats, si le
lot peut être accepté ou doit être refusé.
1 Spécifications quantitatives - Dénombrement de flore
mésophile aérobie totale (FMAT)
ISO 21149/2006 Cosmétiques - Microbiologie - Dénombrement et
détection des bactéries aérobies mésophiles.
Ce dénombrement permet d’évaluer le niveau d’hygiène
générale du produit, les micro-organismes dénombrés
recouvrant à la fois les bactéries, les levures et les moisissures.
Il est réalisé par les techniques classiques de numération des
micro-organismes (en milieu liquide, solide ou par filtration) sur
des géloses non sélectives type PCA (plate count agar).
m = 103 UFC.g-1 ou mL-1
M = 105 UFC.g-1 ou mL-1
n = 5 et c = 2
Produits cosmétiques de
catégorie 2 (non destinés aux
bébés ni à la zone oculaire)
2 Spécifications qualitatives - Recherche de micro-organismes
pathogènes dits « spécifiques »
Si la qualité d’hygiène générale du produit cosmétique est mauvaise (dénombrement de la FMAT non satisfaisant), la recherche
des micro-organismes spécifiques suivants est effectuée.
Pseudomonas
aeruginosa
Produits cosmétiques à usage
général : absence de micro-organisme
spécifique dans 1 g ou 1 mL.
Staphylococcus
aureus
Escherichia coli
Candida albicans
3 Dénombrement de la FMAT
m=103 UFC.g-1
M=105 UFC.g-1
Lot 1
XXXXX
Lot 2
XXX
Lot 3
XXXX
Lot 4
XXXX
X
Lot 5
XX
XXX
XX
X
4 Recherche de Candida albicans
m=M
Lot w
30
XXXXX
Lot x
XXX
XX
Lot y
XXXX
X
Lot z
XX
XXX
Résultats de
classe 1
Résultats de
classe 2
CRÉDITS
Pour toutes les illustrations de l’ouvrage non référencées ci-dessous : © CRDP Aquitaine
PRÉSENTATION biologiste, © JPC-PROD - Fotolia.com / boîte de Petri, © grieze - Fotolia.com / bactéries, ©
Jezper - Fotolia.com / virus, © Karelmedical - Fotolia.com
COURS Doc 1, Bryan Christie, DR / Zoom page 16, schéma d’un follicule sébacé, CC by Helix 84, wikimedia.org /
Doc 2, http://bacterioweb.univ-fcomte.fr, DR / Doc 3, Edimark, DR / Doc 4, © Sebastian Kaulitzki, Fotolia.com /
Doc 5, © Pascal Fraperie / Doc 6 et 7, © Valérie Perriot, CRDP Aquitaine / Zoom 1 page 23, DR / Zoom 2 page
16, © Frédéric Massard, Fotolia.com.
ACTIVITÉS Doc 2, © Loyola University Chicago-Health Sciences Division / Doc 4, DR / Doc 5,
http://bacterioweb.univ-fcomte.fr, DR.
Téléchargement
Random flashcards
Ce que beaucoup devaient savoir

0 Cartes Jule EDOH

Le lapin

5 Cartes Christine Tourangeau

aaaaaaaaaaaaaaaa

4 Cartes Beniani Ilyes

Anatomie membre inf

0 Cartes Axelle Bailleau

Fonction exponentielle.

3 Cartes axlb48

Créer des cartes mémoire