Téléchargez le PDF - Revue Médicale Suisse

le point sur…
Thérapies ciblées du cancer
pulmonaire : tests moléculaires
à partir d’échantillons cytologiques
D’importants progrès thérapeutiques ont été réalisés au cours
de la dernière décennie pour le cancer pulmonaire. Des thé­
rapies ciblant les voies de signalisation impliquées dans la
croissance et la survie des cellules tumorales ont démontré
leur efficacité pour une fraction des patients (l 20%). L’effica­
cité de ces thérapies ciblées est influencée notamment par la
présence de mutations de différents gènes impliqués dans les
voies de signalisation (par exemple : EGFR, KRAS). La recher­
che de ces mutations avant traitement se fait idéalement sur
du matériel histologique (biopsie/pièce opératoire). Néanmoins,
en raison des nouvelles approches diagnostiques dont l’écho­
graphie endobronchique (EBUS), il y a une demande croissante
pour la réalisation des tests moléculaires sur du matériel cyto­
logique. Cette application cytologique est discutée dans cet
article.
Rev Med Suisse 2011 ; 7 :1486-90
M. Pusztaszeri
J.-C. Pache
N. Mach
P. M. Soccal
T. McKee
Targeted therapy in lung cancer :
molecular testing using cytological
specimens
Important advances in lung cancer treatment
have been made over the last decade. Several
drugs designed to target molecular pathways
involved in cancer­cell growth and survival
have been shown to be effective in a selec­
ted fraction (l 20%) of non­small cell lung
cancer patients. Somatic mutations in several
genes (i.e. : EGFR and KRAS) can predict pa­
tient’s response to targeted therapies. Those
mutations are commonly detected on histo­
pathological samples (core­needle biopsy/
surgical resection). However, when tissue
biopsies are not available, molecular testing
has to be performed on cytological speci­
mens. Issues raised by molecular testing on
cytological specimen are discussed in this
article.
1486
introduction
Le cancer du poumon est l’affection tumorale qui fait le plus
de victimes dans le monde tant chez l’homme que chez la
femme. Le carcinome non à petites cellules (CNPC), catégorie
constituée majoritairement par l’adénocarcinome, représente
environ 80% des cancers pulmonaires.1,2 Lors du diagnostic,
environ 70% des patients présentent une maladie locale­
ment avancée et/ou métastatique et ne sont pas opérables.
Parmi les patients opérables, la majorité développera une
récidive.
Au cours de la dernière décennie, d’importants progrès thérapeutiques ont été
réalisés avec le développement et l’application de nouvelles thérapies ciblant
des voies de signalisation impliquées dans la croissance et la survie des cel­
lules cancéreuses (thérapies ciblées) et adaptées en fonction des caractéristi­
ques morphologiques et moléculaires de la tumeur (thérapies personnalisées).
Un nombre croissant d’agents ciblant ces voies de signalisation est actuelle­
ment disponible sur le marché ou en cours de développement. Il s’agit généra­
lement de petites molécules (par exemple : inhibiteurs de tyrosine kinase
(TKI) : géfitinib, erlotinib et afatinib pour l’EGFR ; crizotinib pour ALK-EML4)
agissant à l’intérieur de la cellule, ou d’anticorps monoclonaux (par exemple :
cétuximab pour l’EGFR et bévacizumab pour le VEGF), agissant à l’extérieur de
la cellule.
L’efficacité de ces thérapies ciblées dépend directement de l’état d’activation/
inactivation de ces voies de signalisation (et de leurs diverses molécules) dans
les cellules tumorales ainsi que de l’affinité du médicament avec sa cible, influen­
cés par la présence de certaines mutations, en particulier de l’EGFR et du KRAS
pour l’adénocarcinome. D’autres mécanismes d’activation (nombre augmenté de
copies du gène et/ou surexpression de la protéine, comme l’HER­2/neu pour le
cancer du sein) existent et peuvent également être recherchés en vue d’une thé­
rapie ciblée.1 Dans cette revue, nous allons considérer uniquement les mutations,
altérations dont l’impact clinique est le mieux défini.2
Revue Médicale Suisse – www.revmed.ch – 27 juillet 2011
06_10_35820.indd 1
Revue Médicale Suisse – www.revmed.ch – 27 juillet 2011
0
21.07.11 07:26
mutations courantes dans le carcinome
non à petites cellules
Les mutations les plus fréquemment retrouvées dans
l’adénocarcinome pulmonaire sont mentionnées dans la fi­
gure 1.2­4 Ces mutations sont généralement activatrices et
mutuellement exclusives.2
Le gène EGFR, situé sur le bras court du chromosome 7
(7p11.2), comporte 28 exons et code pour une protéine
transmembranaire comportant un site extra­membranaire
(récepteur) et un domaine cytoplasmique avec une activi­
té tyrosine kinase.1,5 L’EGFR fait partie de la famille de ré­
cepteurs tyrosine kinase HER/erbB comprenant quatre pro­
téines (EGFR/HER­1, HER­2/neu, HER­3, HER­4) avec une
structure moléculaire similaire. La liaison du ligand avec
l’EGFR entraîne une activation du système tyrosine kinase
et une transduction du signal en aval contrôlant la prolifé­
ration, l’apoptose, l’angiogenèse, l’invasion tumorale et la
métastatisation (figure 2).1,6 Les mutations de l’EGFR sont
présentes dans environ 10% des CNPC.4,6 Elles sont plus
fréquentes dans les adénocarcinomes (15­20%),4 en parti­
culier chez les patients de sexe féminin, non fumeurs et
d’origine asiatique (environ 40­50%).3­6 Elles sont associées
à un meilleur pronostic (survie globale de 37 mois).3,7 Il s’agit
majoritairement de mutations des exons 18­21 avec dans
90% des cas des délétions de l’exon 19 (associées à 70­100%
de réponses aux TKI) ou des mutations ponctuelles dans
l’exon 21 (associées à 20­70% de réponses aux TKI).2,5 Les
cellules cancéreuses avec ces mutations de l’EGFR ont une
sensibilité augmentée aux TKI, d’une part, parce que leur
survie dépend de cette voie de signalisation et, d’autre part,
parce que les TKI ont vraisemblablement une plus grande
affinité avec l’EGFR muté.
L’évaluation de l’efficacité potentielle des traitements
anti­EGFR chez des patients avec un CNPC est malheureu­
sement compliquée du fait qu’il existe de nombreuses
mutations différentes de l’EGFR. Certaines mutations de
l’EGFR comme T790M (primaire ou secondaire), en dimi­
nuant l’affinité du médicament avec l’EGFR, prédisent à
l’inverse une résistance à la thérapie. Par ailleurs, une ré­
sistance acquise s’observe chez les patients après traite­
ment par des anti­EGFR de type TKI, due au développe­
ment de nouvelles mutations (par exemple : T790M).1,2,8 Des
Pas de mutation
décelable 40%
KRAS 25-30%
EGFR 15-20%
ELM4-ALK 3-7%
BRAF 3%
Autres 10% (CTNNB1
(bêtacaténine), PIK3CA,
MEK, HER-2, PTEN)
Figure 1. Profil mutationnel des adénocarcinomes
pulmonaires
0
Revue Médicale Suisse – www.revmed.ch – 27 juillet 2011
06_10_35820.indd 2
anti­EGFR de deuxième génération sont en cours d’éva­
luation clinique pour ces patients.9
KRAS est une GTPase qui se trouve en aval de la voie
de signalisation d’EGFR (figure 2). Bien qu’il s’agisse de la
mutation la plus fréquente (25­30%),4 il n’existe pour l’ins­
tant pas de thérapie ciblée pour KRAS. Typique chez les
patients fumeurs, elle est associée à une résistance aux anti­
EGFR et à un mauvais pronostic (survie globale de quinze
mois).3,7
Figure 2. Voie de signalisation de l’EGFR
(source : http://healthcare.sourcebioscience.com/diagnostic-tests/egfr).
Les mutations du gène BRAF (par exemple : V600E),
codant pour une kinase située immédiatement en aval de
KRAS dans la voie de signalisation, se retrouvent dans en­
viron 3% des adénocarcinomes avec EGFR et KRAS non
mutés.4 Elles sont aussi associées à une résistance aux anti­
EGFR. Des inhibiteurs sélectifs de BRAF (par exemple :
PLX4032) sont en cours d’évaluation.4,10
Le gène de fusion ALK-EML4 (Anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase-Echinoderm microtubule-associated protein-like 4)
sur le chromosome 2p est présent dans environ 3­7% des
adénocarcinomes. Ces cancers ne répondant pas non plus
aux TKI.7,11 La recherche de cette altération moléculaire
rare sera peut­être généralisée sous réserve de la confir­
mation des résultats encourageants sur l’efficacité d’un inhi­
biteur sélectif des récepteurs tyrosine kinase ALK et MET/
HGF et leurs variantes oncogéniques (crizotinib).
Certaines mutations peuvent être associées à une mor­
phologie et/ou à des sous­types histologiques particuliers
d’adénocarcinomes (tableau 1).9 De ce fait, les mutations
les plus probables et à rechercher en priorité pourraient
être prédites sur la base de la morphologie de l’adénocar­
cinome.
diagnostic et typisation tumorale
sur les spécimens cytologiques
A l’ère des thérapies ciblées, un diagnostic générique
de CNPC est devenu insuffisant pour la prise en charge
thérapeutique et le cytopathologiste doit pouvoir, si pos­
sible, trancher entre l’adénocarcinome et le carcinome épi­
dermoïde. En effet, ce dernier n’est pas éligible pour une
Revue Médicale Suisse – www.revmed.ch – 27 juillet 2011
1487
21.07.11 07:26
Tableau 1. Association possible entre le type d’altération génétique et le sous-type d’adénocarcinome
pulmonaire
Type de mutation/
altération
Sous-type histologique
d’adénocarcinome
EGFR
Adénocarcinome bien différencié,
avec composante bronchioloalvéolaire
non mucineuse, papillaire et/ou micropapillaire
KRAS
Adénocarcinome (bronchioloalvéolaire
ou non) de type mucineux
BRAF
Adénocarcinome papillaire
ELM4-ALK
Adénocarcinome de type solide et/ou
avec composante à cellules isolées
CTNNB1
(Bêtacaténine)
Adénocarcinome à cellules claires
ou de type fœtal
thérapie ciblée anti­EGFR et anti­VEGF (bévacizumab) com­
me l’adénocarcinome ; il existe sous bévacizumab, un risque
d’hémorragie pulmonaire fatale chez les patients avec un
carcinome épidermoïde (souvent central et massif).2,9,12,13
L’immunocytochimie à l’aide de plusieurs anticorps (par
exemple : TTF­1, p63, cytokératines 7 et 5/6), utilisée de
manière complémentaire sur des frottis cytologiques déjà
colorés et/ou sur des cell-blocks, permet dans la majorité des
cas de faire pencher la balance d’un côté ou de l’autre lors­
que la morphologie du CNPC est ambiguë. Les adénocar­
cinomes pulmonaires sont typiquement positifs pour TTF­1
et les cytokératines 7 et sont négatifs pour p63 et les cyto­
kératines 5/6. Les carcinomes épidermoïdes ont typique­
ment le profil inverse.13 Néanmoins, cette sous­typisation
à partir d’un nombre limité de cellules tumorales soulève
le problème de la représentativité et de l’hétérogénéité
tumorale sur le plan morphologique mais également molé­
culaire (par exemple : mutations). Les carcinomes adéno­
squameux (au moins 10% de l’une des deux composantes
en histologie) existent mais sont rares. Une fois le diagnos­
tic d’adénocarcinome (ou de CNPC compatible avec un
adénocarcinome) posé, la réalisation de tests moléculaires
(EGFR, KRAS, autres) peut être entreprise.
utilisation des échantillons cytologiques pour les tests moléculaires
Les échantillons histologiques obtenus par biopsies
transpariétales/transbronchiques ou par résection chirurgi­
cale sont le plus souvent utilisés et sont adéquats pour
tester les mutations spécifiques en vue d’une thérapie ci­
blée.12 Toutefois, chez un nombre croissant de patients
susceptibles de bénéficier d’une thérapie ciblée, seul du
matériel cytologique est disponible pour le diagnostic de
la tumeur et pour les tests moléculaires. Selon le cas, il peut
s’agir de matériel provenant de l’épanchement pleural/pé­
ricardique, de l’aspiration ou du brossage bronchique, du
lavage bronchoalvéolaire (LBA), de la ponction à l’aiguille
1488
Revue Médicale Suisse – www.revmed.ch – 27 juillet 2011
06_10_35820.indd 3
fine (21­22G) de la masse pulmonaire ou de la cytoponc­
tion transbronchique d’adénopathies (Transbronchial needle
aspiration – TBNA ) guidée ou pas par ultrasons (Endobronchial-ultrasound – EBUS). Cette dernière technique, apparue
dès 2007 dans les algorithmes européens de stratégies
diagnostiques,14 remplace progressivement la médiasti­
noscopie pour le diagnostic et le staging initial des cancers
pulmonaires.5,15
Plusieurs études récentes ont montré que la faisabilité
et la sensibilité de ces analyses (EGFR, KRAS, BRAF et
PIK3CA) sont aussi bonnes sur du matériel cytologique
qu’histologique.1,5,6,15,16 Tous les types de préparation cy­
tologique sont potentiellement utilisables (frottis, cytospin,
cell-blocks), en particulier les cell-blocks. La proportion de cas
ou le matériel cytologique est insuffisant pour les analyses
moléculaires est globalement inférieure à 25% mais varie
beaucoup en fonction du type de prélèvement (nettement
moindre pour les épanchements et le TBNA­EBUS que
pour les aspirations bronchiques et les LBA).5,6,15 L’évalua­
tion immédiate du matériel par le cytopathologiste lors des
prélèvements (Rapid on-site evaluation – ROSE), applicable
en particulier pour le TBNA­EBUS, permet de s’assurer que
le matériel soit qualitativement et quantitativement suffi­
sant tant pour le diagnostic que pour les analyses complé­
mentaires nécessaires (immunocytochimie et tests molé­
culaires). Elle permet ainsi d’éviter les complications et les
coûts liés à un nombre élevé de prélèvements, voire la ré­
pétition d’une procédure diagnostique.
Une étude a montré que le matériel provenant de lames
cytologiques colorées de manière standard (Papanicolaou)
se prêtait même mieux à l’analyse des mutations d’EGFR
par PCR (Polymerase chain reaction) que le matériel provenant
de biopsies. Ceci pourrait être expliqué par une meilleure
conservation de l’ADN dans le méthanol (cytologie) que
dans le formol (histologie).1
Néanmoins, la faisabilité de ces analyses sur du maté­
riel cytologique doit être évaluée de cas en cas, car elle dé­
pend de l’abondance et surtout de la proportion de cel­
lules tumorales. En effet, contrairement à l’histologie où la
zone tumorale peut être adéquatement sélectionnée, en
cytologie, les cellules tumorales sont mélangées aux diffé­
rentes cellules bénignes (population hétérogène de cel­
lules), ce qui a pour effet de «diluer» l’échantillon et donc
de diminuer la sensibilité des analyses.
Les méthodes les plus fréquemment utilisées pour dé­
terminer les mutations d’EGFR ou de KRAS sont la RT­PCR
et le séquençage.2 Le séquençage direct permet de détec­
ter toutes les mutations possibles dans les exons mais la
technique est moins sensible que la RT­PCR et elle est li­
mitée par la présence des cellules non néoplasiques.1,6 La
RT­PCR utilise des oligonucléotides (primers) qui se lient
spécifiquement aux régions bordant les mutations les plus
fréquentes lorsqu’elles sont présentes. Cette méthode est
très sensible mais elle ne permet de détecter que les mu­
tations connues, qui sont aussi les plus fréquentes. Elle ne
permet pas de détecter des mutations rares ou qui n’ont
pas encore été documentées.
Idéalement, il faut au moins une centaine de cellules
tumorales avec une proportion de cellules tumorales/non
tumorales supérieure à 25% pour pouvoir procéder à une
Revue Médicale Suisse – www.revmed.ch – 27 juillet 2011
0
21.07.11 07:26
recherche de mutation de l’EGFR ou de KRAS. Certaines
études ont réussi à mettre en évidence des mutations dans
des échantillons avec seulement 30 cellules tumorales ou
avec une proportion de cellules tumorales de 1% en utili­
sant des techniques encore plus sensibles (High resolution
melting analysis – HRMA) ou PNA­LNA (Peptide nucleic acid-Locked nucleic acid – PCR).1,17 Globalement, la qualité de l’ADN
semble être plus importante que sa quantité (nombre de
cellules tumorales).1
Une dissection manuelle peut augmenter la sensibilité
de l’analyse en augmentant la proportion de cellules tumo­
rales. Alternativement, une microdissection au laser peut
être utilisée dans les cas où une dissection manuelle ne
permet pas d’obtenir une proportion de cellules tumorales
suffisante (25%). Cependant, en raison des coûts élevés des
analyses et du délai supplémentaire dans la disponibilité
des résultats, cette méthode reste encore peu accessible
et donc limitée en pratique clinique.
Dans un certain nombre de cas, le matériel reste quan­
titativement et/ou qualitativement insuffisant et un nouveau
prélèvement histologique ou cytologique doit être réalisé
pour pouvoir effectuer ces analyses.
tres cibles thérapeutiques potentielles sont en cours d’in­
vestigation (par exemple : BRAF, HER­2, c­KIT,). Il est donc
très probable que le nombre et la diversité de ces ana­
lyses moléculaires augmentent dans le futur, globalement
mais aussi pour chaque cas individuel. A terme, l’utilisation
optimale des échantillons cytologiques devrait permettre
d’élargir le nombre de patients pouvant bénéficier d’une
thérapie ciblée basée sur la/les anomalie(s) moléculaire(s)
détectée(s). L’amélioration des techniques de laboratoire
ainsi que l’identification de nouveaux facteurs pronostics/
prédictifs de réponse aux traitements seront les prochains
défis pour augmenter encore l’efficacité de la prise en charge
des patients souffrant de cancers pulmonaires.
Implications pratiques
> Les thérapies ciblées font maintenant partie des options thérapeutiques pour les patients avec un cancer pulmonaire, en
particulier de type adénocarcinome
> Les mutations de certains gènes, en particulier EGFR, sont
des facteurs prédictifs de réponse aux thérapies ciblées
conclusion
> La recherche de ces mutations peut se faire aussi bien sur du
La détermination du type de CNPC ainsi que les ana­
lyses moléculaires sont maintenant indispensables pour
pouvoir offrir les meilleurs traitements aux patients. L’amé­
lioration des techniques non (ou minimalement) invasives
permet d’obtenir des prélèvements de matériel tumoral,
le plus souvent sous la forme de prélèvement cytologique.
Il est donc impératif de disposer des techniques permet­
tant d’exploiter le matériel prélevé pour orienter le diag­
nostic et le choix thérapeutique. Les tests moléculaires des
CNPC du poumon (en particulier d’EGFR et de KRAS)
peuvent être effectués aussi bien à partir d’échantillons
cytologiques qu’histologiques. Néanmoins, les spécimens
cytologiques doivent contenir un nombre et une propor­
tion suffisants de cellules tumorales pour permettre ces
analyses. La ROSE, si elle est disponible, permet d’optimi­
ser les chances d’obtenir un matériel quantitativement et
qualitativement suffisant à la fois pour le diagnostic et pour
les tests moléculaires. Différentes techniques (dissection
manuelle et microdissection au laser) permettent d’aug­
menter la proportion de cellules tumorales.
Bien que les mutations de l’EGFR fassent actuellement
partie des tests moléculaires courants pour le CNPC, d’au­
matériel cytologique que sur du matériel histologique
> Néanmoins, les spécimens cytologiques doivent contenir un
nombre et une proportion suffisants de cellules tumorales
pour permettre ces analyses
Adresse
Drs Marc Pusztaszeri, Jean-Claude Pache
et Thomas McKee
Service de pathologie clinique
Département de médecine génétique et de laboratoire
Dr Nicolas Mach
Service d’oncologie
Dr Paola M. Soccal
Service de pneumologie
Département des spécialités de médecine
Dr Paola M. Soccal
Service de chirurgie thoracique
Département de chirurgie
HUG, 1211 Genève 14
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
Bibliographie
1 ** Da Cunha Santos G, Saieg MA, Geddie W, Leighl
N. EGFR gene status in cytological samples of nonsmall
cell lung carcinoma : Controversies and opportunities.
Cancer Cytopathol 2011;119:80-91.
2 Ladanyi M, Pao W. Lung adenocarcinoma : Guiding
EGFR-targeted therapy and beyond. Mod Pathol 2008;
21(Suppl. 2):S16-22.
3 Ding L, Getz G, Wheeler DA, et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature 2008;455:1069-75.
4 Paik PK, Arcila ME, Fara M, et al. Clinical characte-
0
ristics of patients with lung adenocarcinomas harboring BRAF mutations. J Clin Oncol 2011 ; epub ahead
of print.
5 Billah S, Stewart J, Staerkel G, et al. EGFR and KRAS
mutations in lung carcinoma : Molecular testing by using
cytology specimens. Cancer Cytopathol 2011;119:111-7.
6 * Smouse JH, Cibas ES, Jänne PA, et al. EGFR mutations are detected comparably in cytologic and surgical pathology specimens of nonsmall cell lung cancer.
Cancer 2009;117:67-72.
7 * Ganti AK, Huang CH, Klein MA, Keefe S, Kelley
Revue Médicale Suisse – www.revmed.ch – 27 juillet 2011
06_10_35820.indd 4
MJ. Lung cancer management in 2010. Oncology 2011;
25:64-73.
8 Giaccone G, Wang Y. Strategies for overcoming
resistance to EGFR family tyrosine kinase inhibitors.
Cancer Treat Rev 2011 ; epub ahead of print.
9 Pratilas CA, Solit DB. Targeting the mitogen-activated protein kinase pathway : Physiological feedback
and drug response. Clin Cancer Res 2010;16:3329-34.
10 * Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, et al. Clinical features and outcome of patients with non-smallcell lung cancer who harbor EML4-ALK. J Clin Oncol
Revue Médicale Suisse – www.revmed.ch – 27 juillet 2011
1489
21.07.11 07:26
2009;27:4247-53.
11 ** Cagle PT, Allen TC, Dacic S, et al. Revolution in
lung cancer : New challenges for the surgical pathologist. Arch Pathol Lab Med 2011;135:110-6.
12 ** Travis WD, Rekhtman N. Pathological diagnosis
and classification of lung cancer in small biopsies and
cytology : Strategic management of tissue for molecular testing. Semin Respir Crit Care Med 2011;32:22-31.
13 Khayyata S, Yun S, Pasha T, et al. Value of P63 and
CK5/6 in distinguishing squamous cell carcinoma from
adenocarcinoma in lung fine-needle aspiration specimens. Diagn Cytopathol 2009;37:178-83.
1490
Revue Médicale Suisse – www.revmed.ch – 27 juillet 2011
06_10_35820.indd 5
14 * De Leyn P, Lardinois D, Van Schil PE, et al. ESTS
guidelines for preoperative lymph node staging for
non-small cell lung cancer. Eur J Cardiothorac Surg
2007;32:1-8.
15 Schuurbiers OC, Looijen-Salamon MG, Ligtenberg
MJ, van der Heijden HF. A brief retrospective report
on the feasibility of epidermal growth factor receptor
and KRAS mutation analysis in transesophageal ultrasound- and endobronchial ultrasound-guided fine needle
cytological aspirates. J Thorac Oncol 2010;5:1664-7.
16 * van Eijk R, Licht J, Schrumpf M, et al. Rapid KRAS,
EGFR, BRAF and PIK3CA mutation analysis of fine
needle aspirates from non-small-cell lung cancer using
allele-apecific qPCR. PLoS One 2011;6:e17791.
17 Tanaka T, Nagai Y, Miyazawa H, et al. Reliability of
the peptide nucleic acid-locked nucleic acid polymerase
chain reaction clamp-based test for epidermal growth
factor receptor mutations integrated into the clinical
practice for non-small cell lung cancers. Cancer Sci 2007;
98:246-52.
* à lire
** à lire absolument
Revue Médicale Suisse – www.revmed.ch – 27 juillet 2011
0
21.07.11 07:26