Le gène du PSA

Progrès en Urologie (1997), 7, 930-936
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Le gène du PSA : intérêt pour la détection des cellules circulantes
dans le cancer de la prostate
Alexandre de la TAILLE(1, 4), Marc COLOMBEL (1), Serge AMSELLEM (2), Béatrice MUSCATELLI (1),
François RADVANYI (3), Etienne MAZEMAN(4), Claude Clément ABBOU (1), Dominique CHOPIN (1)
(1) Service d’Urologie, 2) Service de Biochimie, Groupe d’Etude des Tumeurs Urologiques,
Hôpital Henri Mondor, Créteil, France
(3) UMR 144, Institut Curie, Paris, France, (4) Service d’Urologie, CHRU, Lille, France
RESUME
La détection des cellules circulantes dans les can-
cers connait un regain d’attention grâce à la simpli-
cité, la spécificité et la sensibilité d’une technique de
biologie moléculaire : la RT-PCR. Cette détection
repose sur la notion de spécificité d’une séquence
d’ARN exprimée par la cellule cancéreuse.
Pour le cancer de prostate, le PSA apparaît comme
le marqueur idéal des cellules prostatiques circu-
lantes par sa spécificité. Il semble donc essentiel de
connaître ce gène ainsi que ses caractères molécu-
laires. Nous proposons une revue didactique des
gènes de la famille des kallicréines dans le but d’ex-
poser les avantages et les difficultés de l’utilisation
de l’ARN messager du PSA comme marqueur des
cellules prostatiques circulantes.
Mots clés : Kallicréine, PSA, prostate, cancer, RT-PCR.
Progrès en Urologie (1997), 7, 930-936.
Depuis quelques années, la notion de cellules circulantes
dans les cancers connaît un regain d’attention grâce à la
PCR (Polymerase Chain Reaction). Technique inventée
par M U L L I S en 1985 [31], découverte pour laquelle il
reçut le prix Nobel de Chimie en 1993, la PCR permet
l’amplification, à des milliards de copies, d’un segment
connu d’Acide DésoxyriboNucléique (ADN).
L’application en routine est devenue possible par l’utili-
sation de cycles thermiques alternant des températures de
synthèse d’ADN et de séparation des hélices (Figure 1),
par l’apparition d’une ADN Polymérase Thermostable
[40] et la possibilité de transcrire les Acides
RiboNucléiques (ARN) en ADN complémentaire
( Transcription reverse ou RT ) .
La détection de cellules circulantes repose sur la trans-
cription d’un gène spécifique de la cellule prostatique.
Le succès de cette technique de biologie moléculaire
est triple : simple d’utilisation, sensible et spécifique.
Seule l’hématologie a actuellement une application en
routine de cette technique par la recherche de maladie
résiduelle après traitement de la leucémie lymphoblas-
tique aiguë par amplification génétique d’un fragment
d’ADN spécifique, siège de translocation 14/18 [27].
Entre le domaine de la recherche et la clinique, plu-
sieurs autres spécialités médicales s’intéressent à la RT-
PCR et à la détection de cellules soit dans le sang péri-
phérique soit dans la moëlle par exemple en dermatolo-
gie pour les mélanomes [44], en neurologie pour les
neuroblastomes [32] ou en gynécologie où la présence
de cellules dans la moelle détectée par RT-PCR est un
indice de mauvais pronostic du cancer du sein [8].
En urologie, une des premières applications a été la
possibilité de détecter des cellules tumorales prosta-
tiques dans les adénopathies métastatiques par RT-PCR
de l’ARN messager du PSA (Antigène Spécifique de
Prostate), méthode de plus grande sensibilité que l’exa-
men anatomopathologique [29]. En 1994, KATZ a intro-
duit la possibilité de stadification du cancer par RT-
PCR : la présence de cellules circulantes serait corrélée
au stade extracapsulaire du cancer [17]. Dans les stades
avancés, il semble que la fréquence des patients posi-
tifs soit supérieure à 80% [17, 34].
Du fait du développement de ces techniques avec
comme principal objectif d’améliorer la stadification
des cancers de prostate, il est essentiel de comprendre
la structure du gène du PSA qui est actuellement le plus
utilisé pour reconnaître spécifiquement les cellules cir-
culantes prostatiques.
SYNTHESE
Le PSA est une protéine du groupe des kallicréines.
Ces protéines sont isolées initialement par FREY et al.
en 1930, qui isole une substance à partir d’urines
humaines ayant la propriété d’être hypotensive [13].
Elle est aussi détectée dans le pancréas [18], d’où le
nom de kallicréine venant du grec «kallikréas» qui
signifie pancréas (actuellement appelé hK1). Cette pro-
téine fut dans les années suivantes retrouvée au niveau
Manuscrit reçu : janvier 1997, accepté : juin 1997.
Adresse pour correspondance : Dr.M. Colombel, Service d’Urologie, Hôpital
Henri Mondor, 51, avenue du Général de Lattre de Tassigny, 94010 Créteil Cedex.
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du sang, des glandes salivaires, de l’intestin, du pou-
mon et du cerveau.
Les kallicréines sont des protéines ayant un poids
moléculaire entre 27 et 40 KiloDalton (kD) et un point
isoélectrique de pH 4 [6]. Comme l’élastase, le throm-
bine, la plasmine, le kininogène, la chymotrypsine et la
trypsine, elles composent la famille des serines pro-
téases clivant le kininogène et produites par les glandes
salivaires, le rein, la prostate et le pancréas [24].
Il existe 3 kallicréines humaines dont la nomenclature
a été établie par la conférence de consensus (Figure 2)
de Munich en 1991 [2]. Les 3 protéines sont appelées
hK 1, première kallicréine identifiée, hK 2 et hK 3 qui
est plus connue sous le nom de PSA. Les gènes corres-
pondants désignés par hKLK (hsignifiant human) suivi
du numéro 1, 2 ou 3, ont la même structure génique : 4
introns et 5 exons. Le locus des kallicréines est sur le
chromosome 19q13.2-13.4 [12, 37, 46].
hK 3 ou PSA
Le PSA a été mis en évidence initialement dans le sper-
me sous le nom de gamma séminoprotéine (E1 ou p30)
[3] et utilisé comme marqueur du liquide séminal dans
les enquêtes criminelles sur le viol [43], puis dans le
tissu prostatique [47, 48]. Cette protéine est présente en
grande quantité dans le sperme et en très faible quanti-
té dans le sang. Aujourd’hui, le PSA sérique est consi-
déré comme le meilleur marqueur de la pathologie
tumorale prostatique [33, 45].
Protéine PSA : Le PSA est une glycoprotéine d’un
poids moléculaire de 33 kD, ayant une activité protéo-
lytique chymotrypsine like. Son poids moléculaire de
28.5 kD est déterminé par spectrométrie de masse [21,
49]. Elle est synthétisée sous forme d’une prépropro-
téine de 261 acides aminés. La protéine mature est
constituée de 237 acides aminés. Une séquence pepti-
dique de signal de 17 acides aminés, hydrophobe, lui
permet d’entrer dans le réticulum endoblastique (voie
de sécrétion). Un profragment de 7 acides aminés a
pour fonction de garder la protéine inactive. La propro-
téine est ensuite transportée dans une vésicule vers la
membrane plasmatique et sécrétée. Le lieu et les condi-
tions de passage de la proprotéine en protéine ne sont
pas encore connus [24].
Rôle du PSA : Son rôle est la liquéfaction du sperme à
l’éjaculation par clivage des séminogélines I et II et des
fibronectines sécrétées par les vésicules séminales [22,
23]. Il a été montré récemment que le PSA pouvait cli-
ver la protéine porteuse de l’IGF (Insulin Growth
Factor). La protéolyse de l’IGF-BP3 par le PSA entraî-
nerait une baisse de l’action de l’IGF d’où l’idée que le
PSA pourrait moduler localement l’action de l’IGF sur
le système de reproduction et sur le cancer de la pros-
tate [7]. D’autre part, l’addition de PSA purifié dans les
cultures de cellules épithéliales prostatiques augmente-
rait leur prolifération [7] mais le mécanisme d’action
est encore à l’étude.
Gène du PSA : l’ADN complémentaire a été déduit de
la séquence protéique en 1987 par L UNDWALL [25] et
par R IEGMAN en 1988 [36]. Par hybridation à une
sonde spécifique de PSA, 7 transcrits du PSA diffé-
rents ont été identifiés chez les lignées cellulaires can-
céreuses de prostate PC 82 et PC EW (respectivement
isolées à partir d’une tumeur primitive et d’une adéno-
pathie métastatique) de 0.5 à 5.6 kb. Le plus important,
PA 75 est de 1.5 kb et l’ADN complémentaire corres-
pondant à une préproprotéine de 261 acides ami-
nés[25, 36] et contient l’information complète d’une
protéine de 35 kD. Deux autres transcrits moins impor-
tants sont le résultat d’un épissage alternatif. Un trans-
crit de 0.9 kD, PA 424, est formé par une rétention
intronique et une polyadénylation alternative (Figure
3). Le second de 1.9 kD, PA 525, résulte d’un épissa-
ge alternatif lié à un site cryptique donneur [36]. Ces 3
transcrits diffèrent dans la terminaison 3’. Il est donc
possible pour R IEGMAN [36] que ces transcrits synthé-
tisent 3 formes de protéines différentes. G ALLEE [15] a
extrait la protéine PSA d’un adénome prostatique et
trouve, après purification, une protéine de 35 kD et
une ou deux protéines de 20-25 kD qui pourraient
résulter pour R IEGMAN [36] soit des autres transcrits
soit d’une dégradation de la protéine PSA de 35 kD.
La fonction de PA 424 et PA 525 n’est pas connue et
seule une purification des protéines correspondantes et
leur caractérisation pourraient montrer leur activité
enzymatique.
En utilisant des fragments d’ADN complémentaire
comme sonde d’hybridation, RIEGMAN isole le clone de
cette protéine sur le génome humain [36]. Le gène
complet (environ 6 kb) est constitué de 4 introns et 5
exons (Figure 4). Deux sites de transcription sont trou-
vés 42 et 35 pb en amont du premier ATG. L’exon 1
code pour la majeure partie du peptide signal; l’exon 2
code pour les 2 derniers acides aminés du peptide
séquence, les 7 acides aminés du profragment et la par-
tie aminoterminale de la protéine mature; les exons 3 et
4 codent pour la protéine mature et l’exon 5 pour la
partie carboxyl terminal (51 acides aminés) et la partie
3’ non codante. Le locus de hKLK 3 est sur le chromo-
some 19 entre hKLK 1 et h KLK 2 [12].
Régulation de la sécrétion de PSA : La sécrétion de la
protéine PSA n’est pas constante : les lignées cellu-
laires androgéno-dépendantes (PC 82 ET PC EW) et
androgéno-sensibles (LnCap) l’expriment alors que PC
133, PC 135 et PC 3 ne sécrètent pas de PSA [36)].
EP S T E I N [10], par méthode immunohistochimique,
montre que l’expression du PSA diminue dans les
tumeurs indifférenciées. Cette hypothèse est confirmée
en 1990 par GALLEE qui étudie l’expression du PSA
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dans les tumeurs de prostate et en particulier dans les
tumeurs indifférenciées [14].
Le niveau du PSA peut être modulé in vitro sur les
lignées LnCap en moins de 6 heures par apport d’an-
drogènes [36, 38]. Les androgènes ont un rôle primor-
dial dans le développement et le maintien de la mor-
phologie prostatique. L’absence d’androgènes entraîne
une absence de développement de la prostate. La régu-
lation des androgènes se fait au niveau de la transcrip-
tion de l’ARN du PSA, de la synthèse protéique et/ou
de sa stabilité [38]. Le récepteur aux androgènes fait
partie d’une superfamille de récepteurs [11] comme les
récepteurs aux stéroïdes, aux hormones thyroïdiennes
et à l’acide rétinoïque. Ils se fixent directement et spé-
cifiquement sur l’ADN et régule la transcription du
gène [38]. Ces récepteurs ont une structure fonction-
nelle similaire.
En général les éléments de régulation des gènes sont
situés à -200 bp en amont du site de transcription. Dans
cette région, le gène du PSA a plusieurs éléments de
régulation bien connus. Une TATA box est située à -28
et -23 pb, une GC box en -53 et -48, une CACC box
entre -129 et -125. Puis en -170, se trouve une région
spécifique, AGAACAgcaAGTGCT, séquence inverse
de récepteurs hormonaux [38].
Spécificité du PSA : L’expression du PSA ne semble
pas spécifique des cellules épithéliales de prostate. Par
études immunologiques, le PSA est présent dans les
glandes périuréthrales, dans 30% des tumeurs du sein,
dans les tumeurs du poumon, du côlon, de l’ovaire, du
foie, du rein, des parotides, des glandes salivaires [53],
dans le liquide amniotique [51] et dans le lait maternel
[52]. Par RT-PCR, le tissu mammaire normal [28] et le
tissu endométrial expriment des ARNmessagers du
PSA [5]. YUpense que le PSA est synthétisé par tous
les tissus possédant des récepteurs aux stéroïdes.
Cependant leur taux d’expression est très faible et il est
nécessaire d’utiliser des méthodes hyper-sensibles pour
le détecter.
Les 2 autres kallicréines
hK 1 : connue sous différents noms comme kallicréine
tissulaire, kallicréine urinaire, kallicréine réno-pancréa-
tique, la protéine hK 1 mature composée de 238 acides
aminés (et dont la séquence suggère une activité trypsi-
ne like) est exprimée par les cellules Bêta et les cellules
des acini du pancréas, le rein et les glandes salivaires
sous-maxillaires [24] et plus récemment par les cellules
du myomètre et de l’endométrium [5]. Présente en
quantité importante dans le sérum elle présente 62%
d’homologie avec la protéine hK 3 (ou PSA) d’où la
possibilité de réactions croisées avec des anticorps
polyclonaux contre le PSA [35].
Elle a un rôle important dans la régulation de la pres-
sion artérielle, la circulation capillaire et la balance
sodique dans le système kallicréine-rénine [26]. En
effet, hK 1 clive le kininogène en kallidine qui devient
après action d’une aminopeptidase la bradykinine
(induisant vasodilatation, augmentation du flux capil-
laire et causant une contraction des muscles lisses
intestinaux et bronchiques). Il n’est donc pas étonnant
connaissant cette action, de retrouver hK 1 au niveau
des urines, de la salive, du liquide amniotique, du pla-
centa, du myomètre, du liquide synovial, des sécrétions
nasales des allergiques et des lavages bronchiques des
asthmatiques [4].
BAKER en 1985 [1] séquence l’ADN complémentaire,
séquence génomique de 4.5 kb [12] et son gène hKLK
1 est situé sur le chromosome 19 avec les 2 autres
gènes des kallicréines.
hK 2 : La protéine hK 2 ou anciennement hGK 1 (pour
Human Glandular Kallikrein) est synthétisée par les
cellules épithéliales de prostate [30]. Par RT-PCR, hK
2 a été détecté dans les cellules endométriales [5] mais
elle est absente dans le rein, le pancréas, le foie, le
muscle strié, le poumon, la rate, le thymus foetal, le
cerveau et la moelle épinière [30].
SCHELDICH en 1987 [41] isole et séquence le cDNA de
hK 2. Par hybridation «northern blot» avec des sondes
spécifiques de hK 2, hK 2 a 2 transcrits principaux de
1.2 et 1.5 kb [25]. HENTTU [16] trouve une multitude de
transcrits différents entre 1.6 et 4.5 kb dans l’hypertro-
phie bénigne et le cancer prostatique. Le plus important
est le 1.5 kb codant pour une préproprotéine de 261
acides aminés présentant 78% d’homologie avec hK 3
et 66% avec hK 1 [6, 16] (Figure 5). Sa séquence sug-
gère une activité trypsine like [41]. Cette protéine n’a
pas encore été purifiée [4]. Le gène hKLK 2 se situe
sur le chromosome 19.
Une étude faite sur les cellules LnCap, cellules cancé-
reuses de prostate androgénosensibles, prélevées sur
une adénopathie métastatique, montre que l’expression
de hK 2 peut être stimulée par les androgènes [39]. Par
contre les tumeurs androgénoindépendantes comme
PC 133 ou PC 135 n’expriment pas hK 2. Le rapport
hK2/PSA n’est pas constant dans les lignées cellulaires
étudiées [39] mais peut être évalué entre 10 et 30%
[16].
Sa fonction reste encore inconnue. Etant exprimé par
les cellules épithéliales prostatiques, certains auteurs
envisagent de l’étudier comme marqueur de l’adéno-
carcinome de prostate [5].
Les différentes techniques d’amplification génique
Les cellules circulantes dans le sang sont en quantité
très faible, diluées parmi des milliards de cellules san-
guines (globules rouges, plaquettes, monocytes, lym-
phocytes, polynucléaires...).
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Figure 1. Boucle thermique de la PCR permettant l’amplifica -
tion à des millions de copies d’une séquence d’ADN. Figure 2. Nomenclature des protéines et des gènes des kalli -
créines humaines.
Figure 4. Taille (kb : 103paire de base) et locus des gènes des kallicréines.
Figure 5. Pourcentage d’homologie entre les gènes de kKLK 3 et hKLK 2.
Figure 3. Comparaison des principaux transcrits du PSA et
localisation des amorces publiées sur les exons (pb : paire de
base).
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La première étape utilisée dans tous les protocoles
publiés dans la littérature passe par une concentration
de ces cellules par élimination des cellules sanguines,
soit par éclatement par choc osmotique avec l’adjonc-
tion d’un concentré hypoosmolaire ou soit par une
séparation sur gradient de concentration permettant de
récupérer seulement les cellules mononucléées.
A partir de ces échantillons cellulaires, l’ARN est
extrait puis retranscrit en ADN complémentaire. La
PCR amplifie les fragments d’ADN grâce à des
amorces choisies comme étant spécifiques de la cellu-
le à détecter et exprimées exclusivement par elles.
Chaque auteur a ses amorces personnelles (Figure 3)
rendant de ce fait difficilement comparables les études
entre elles. C’est ainsi que pour les cellules épithéliales
circulantes de prostate, le PSA est choisi de façon plus
importante, plus que le PSM (antigène spécifique de
membrane de prostate) ayant comme inconvénient de
présenter de fortes homologies avec le récepteur de la
transferrine (54%) exprimée par certaines cellules san-
guines [19]. Le gène et les transcrits du PSA sont bien
connus contrairement au PSM qui ne l’est pas complè-
tement. Il est donc plus difficile de créer des amorces
de PSM que de PSA. Malgré les techniques de concen-
tration, le nombre de cellules est faible et il est néces-
saire d’employer des techniques sensibles pour pou-
voir détecter l’ARN du PSA. Il en existe plusieurs
mais toutes passent d’abord par une première réaction
de PCR puis diffèrent.
- La technique de KATZ et al. [17] utilise une technique
de révélation du produit de PCR par un immunomar-
quage des bases préalablement marquées.
- ISRAELI et al. [19] ont préféré utiliser une «nested
PCR», technique hypersensible, consistant à réampli-
fier les fragments déjà obtenus par de nouvelles
amorces. La révélation est alors simple par migration
du produit sur gel d’agarose. Cette technique, bien que
séduisante car facile d’utilisation, s’expose au risque
de contamination d’un tube à l’autre par erreurs de
manipulation mais aussi risque de réamplifier des pro-
duits non spécifiques sources de faux positifs (6% dans
sa série).
- Une autre technique hypersensible [20] consiste,
après migration sur gel d’agarose, d’hybrider les pro-
duits obtenus par une sonde radioactive et de les révé-
ler par apposition de film hypersensible radiologique.
Toutes les variantes et dérives sont possibles mais plus
la technique se veut hypersensible et plus elle perd de
sa spécificité et fait apparaître des faux positifs pou-
vant résulter du concept de transcription illégitime,
terme sous lequel se regroupent 2 hypothèses : soit
l’ARN est sécrété à bas bruit par l’ensemble des cel-
lules et donc en augmentant la sensibilité ces ARN
sont amplifiés, soit l’ARN est synthétisé par quelques
cellules (lié au hasard) non prostatiques.
CONCLUSION
Le PSA reste une protéine sécrétée de façon majoritai-
re par les cellules épithéliales prostatiques et donc
l’amplification de son ARN messager reste une métho-
de permettant de détecter des cellules épithéliales pros-
tatiques circulantes dans le sang veineux périphérique.
Cependant, le taux d’expression du PSA est variable en
fonction du grade (les cellules les moins différenciées
correspondant à des tumeurs les plus agressives) et du
traitement institué (antiandrogènes). L’homologie de
séquence de l’ADN complémentaire entre hKLK 1,
hKLK 2 et PSA expose au risque d’amplifier des gènes
dont on ne connaît pas la signification (pour hKLK 2)
ou qui sont exprimés par d’autres cellules de l’organis-
me (hKLK 1) d’où une perte de spécificité.
Les années à venir seront riches d’études cliniques
comportant des applications de la PCR ou RT-PCR
dans le domaine carcinologique. La connaissance du
gène du PSA et de la famille des kallicréines permet de
comprendre le fondement de la détection des cellules
circulantes dans le cancer de prostate.
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