Production et sécrétion de l`insuline par les cellules β pancréatiques
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Production et sécrétion de l’insuline par les cellules β pancréatiques Pr Catherine OIRY-CUQ ,Laboratoire de Pharmacologie, Faculté de pharmacie, UM [email protected] I- Généralités – Rôles de l’insuline II- Structure de l'insuline III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline I- Généralités – Rôles de l’insuline II- Structure de l'insuline III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline (20%) (75%) (5%) Inh. Sécrétion insuline et glucagon I- Généralités – Rôles de l’insuline L’INSULINE - Participe au contrôle du métabolisme énergétique (métabolisme du glucose) - Seule hormone hypoglycémiante - Production et sécrétion par les cellules β du pancréas endocrine finement contrôlées - Régulateur le plus important : le glucose - Existence d’agents régulateurs hormonaux et nerveux I- Généralités – Rôles de l’insuline L’INSULINE - Hormone définitive synthétisée à partir de pro-hormone de haut poids moléculaire - Libération de l’insuline par exocytose des vésicules sécrétoires - Adaptation du fonctionnement coordonné des cellules β aux variations de l ’équilibre glycémique I- Généralités – Rôles de l’insuline ROLES DE L’INSULINE Au niveau du métabolisme glucidique, action hypoglycémiante / divers mécanismes : - elle augmente l’entrée du glucose au niveau cellulaire en stimulant la translocation de son transporteur (GLUT 4) à la membrane plasmique (muscle squelettique, tissu adipeux), - elle stimule le stockage du glucose sous forme de glycogène (glycogénogénèse) en activant la glycogène synthase dans le foie, les muscles squelettiques et le tissu adipeux, I- Généralités – Rôles de l’insuline ROLES DE L’INSULINE Au niveau du métabolisme glucidique, action hypoglycémiante / divers mécanismes : - elle diminue la glycogénolyse hépatique en inhibant l’activité de la glycogène phosphorylase, - elle inhibe la néoglucogénèse hépatique (formation de glucose à partir de résidus non glucidiques comme les acides aminés ou le glycérol). Pathologie : déficit insulinique est à l'origine du diabète, problème majeur de santé publique I- Généralités – Rôles de l’insuline ROLES DE L’INSULINE Au niveau du métabolisme lipidique, l’insuline favorise le stockage des graisses : -Elle stimule la lipogénèse (stimule la lipoprotéine lipase) et inhibe la lipolyse (inhibe la triglycéride lipase = diminution de la sécrétion d’acides gras et de glycérol) - Au niveau du foie et du tissu adipeux I- Généralités – Rôles de l’insuline ROLES DE L’INSULINE Au niveau du métabolisme protidique, l’insuline a une action anabolisante: - Elle stimule le transport actif des acides aminés dans les muscles squelettiques et dans de nombreux tissus, et leur incorporation dans les protéines - Elle a une action anti-catabolique en diminuant l’activité des enzymes protéolytiques - Elle participe à la croissance et à la régénération tissulaire ↓ cétogenèse corps cétoniques FOIE acétylCoA lipogénèse LPL CM + alanine ↓ neoglucogenèse - anti-lipolytique TGL - AG + TG glycérol 3P VLDL glucose + glucose T. ADIPEUX + glycogène ↑ glycogénogenèse + + glucose hypoglycémiante + + glycogène glucose REIN filtration glomérulaire acétylCoA + + 100% GLUT réabsorption tubulaire Krebs alanine Protéines Rôle de l’insuline MUSCLE I- Généralités – Rôles de l’insuline II- Structure de l'insuline III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline II- Structure de l'insuline - Séquence primaire en acides aminés par Sanger (1955) - Poids moléculaire d'environ 6 kDa - Hétérodimère constitué de deux chaînes polypeptidiques, la chaîne A et la chaîne B, reliées entre elles par deux ponts disulfures - Chaîne A : 21 acides aminés et chaîne B : 30 acides aminés - Pont disulfure intracaténaire relie les acides aminés 6 et 11 de la chaîne A - Structure primaire de l'insuline humaine très proche de l'insuline porcine ou bovine II- Structure de l'insuline Structure primaire de l'insuline humaine II- Structure de l'insuline - Forme monomérique est la forme active de l'hormone (à concentrations physiologiques, pH neutre) - Insuline peut se dimériser spontanément aux concentrations supraphysiologiques et à pH neutre ou acide (sans intervention d’atome de zinc) II- Structure de l'insuline - Association possible de trois dimères = formation d’hexamères d’insuline (intervention de 2 atomes de zinc, rôle de coordinateurs entre les deux monomères) - forment des cristaux - représentent la forme de stockage majeure de l'hormone dans les granules de sécrétion - cette capacité de polymérisation de l'insuline est mise à profit pour la production d'insuline « retard » utilisée dans le traitement des diabétiques I- Généralités II- Structure de l'insuline III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline 1) Du gène à l'ARNm A- Structure du gène de l’insuline - Structure remarquablement conservée au cours de l'évolution - Gène situé sur le bras court du chromosome 11 - Gène constitué de 1355 paires de bases - Gène constitué de trois exons (régions codantes) séparés de deux introns (régions non transcrites) - Transcription du gène et le processus d'épissage aboutissent à l’ARNm - Contrôle la synthèse d'un précurseur de haut poids moléculaire, la prépro-insuline cDNA 600 nucléotides protéine de 11,5kDa Structure du gène de l'insuline III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline B- Contrôle de la transcription du gène de l'insuline Facteurs régulateurs en cis - Le site du contrôle de la transcription du gène de l'insuline est localisé en amont de l'exon 1 - Ce site de contrôle est constitué d'un promoteur qui comportent de courtes séquences d’ADN (ou « boîtes ») régulatrices en cis - Les séquences régulatrices en cis principales chez l'homme : boîtes A, E, CRE, C2, ILPR régulatrices en cis Promoteur du gène de l'insuline humaine et principaux facteurs de transcription associés III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Abréviations des séquences régulatrices en cis: - insulin linked polymorphic region (ILPR) ; - negative regulatory element (NRE) ; - Z minienhancer (Z) ; - cAMP response element (CRE) ; - E2-like (E2L) III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Facteurs régulateurs en trans - Séquences régulatrices en cis interagissent avec des facteurs de transcription protéiques régulateurs en trans - L'interaction entre ces séquences et les facteurs de transcription contrôle l'expression du gène de l’insuline et sa modulation par des agents métaboliques ou hormonaux régulateurs en trans III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Abréviations des facteurs régulateurs en trans: - purine rich 1 (PUR-1) ; - pancreatic duodenal homeobox 1 (PDX1) ; - glucocorticoid receptor (GR) ; - rat insulin promoter element (RIPE 3b) like ; - islet-specific protein (unindentified) (ISP [un]) ; - helix loop binding protein ß2 (HEBß2) ; - upstream stimulatory factor (USF) ; - CRE modulator (CREM) ; - CRE binding protein (CREB) ; - C-element binding (CEB). III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Facteurs régulateurs en cis Boîtes A séquences riches en AT contiennent, à l'exception de A2, des motifs TAAT (séquence consensus) Importance des boîtes A (en particulier A3* et A5*) : / capacité de lier PDX-1 PDX-1 : - facteur de transcription - exprimé principalement dans la cellule β - rôle majeur dans le fonctionnement et le développement de la cellule β et du pancréas (expression du gène de l'insuline et des gènes de la glucocompétence Glut-2, GK…) III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Boîtes E (E1 et E2 like) propriété de porter les séquences consensus CAANTG assurent en grande partie la spécificité tissulaire de l'expression des gènes lient des facteurs de transcription de la famille hélice-boucle-hélice (helix-loop-helix [HLH]) III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Boîtes E (E1 et E2 like) BOITE E1: - Étape 1 : liaison de l'hétérodimère insulin enhancer factor-1 (IEF-1) ou E47 - Étape 2 : interaction entre IEF-1 ou E47 avec BETA2/NEURO D (famille HLH) (facteur de transcription exprimé dans les cellules β et le système nerveux) BETA2/NEURO D: joue un rôle important dans le développement du pancréas et l'expression du gène de l'insuline Boite E2-like Liaison à une protéine HLH nommée upstream stimulatory factor (USF) III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Boîtes E (E1 et E2 like) REMARQUE Répression de la transcription du gène de l'insuline via les boîtes E : - de façon indirecte - par divers facteurs : BETA3, c-Jun, c/EBPβ - empêchent la liaison des transactivateurs BETA2 ou d'autres protéines HLH (ex. E47) III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Élément de réponse à l'AMPc (CRE) CRE : retrouvé sur tous les gènes capables de répondre à l'AMPc CRE : liaison du facteur de transcription CREB (cf séquence d’activation) Ex. GLP-1, Glucagon CBP: CREB binding protein Insuline III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Élément de réponse à l'AMPc (CRE) CRE : liaison des facteurs de transcription modulateurs CREM (CRE modulators) il existe plusieurs isoformes de CREM Certaines isoformes ont un effet activateur et d'autres un effet inhibiteur vis-à-vis de la transcription du gène de l’insuline III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Séquence C2 contient la séquence CAGG site de liaison de 2 facteurs de transcription , PAX 4 et PAX 6 ces deux facteurs jouent un rôle fondamental dans le développement du pancréas PAX6 paired-box 6 : agit activateur de la transcription du gène de l’insuline PAX4 : agit comme répresseur de la transcription du gène de l’insuline (expression limitée à la période embryonnaire. Pas d’influence majeure chez l’adulte) III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Région ILPR ILPR : « insulin linked polymorphic region » très haut degré de polymorphisme lié surtout au nombre de répétitions en tandem Lien possible entre certains polymorphismes d’ILPR dans le diabète (altération de la transcription du gène de l'insuline) III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline REMARQUES Existence d’interactions entre les séquences en cis Ex. interaction entre les séquences A et E : formation de complexes transactivateurs entre PDX-1 et des protéines HLH Il existerait une répression en cis liée, dans l'espèce humaine, à l'existence d'une séquence NRE « negative regulatory element » qui lie différentes protéines nucléaires (ex. R des glucocorticoïdes) Production et sécrétion de l’insuline par les cellules β pancréatiques Pr Catherine OIRY-CUQ ,Laboratoire de Pharmacologie, Faculté de pharmacie, UM [email protected] III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline B- Contrôle de la transcription du gène de l'insuline Modulation de la transcription par les substrats énergétiques et les hormones a. Par le glucose Agent stimulant puissant de la biosynthèse de l’insuline Mécanisme d’action : stimulation de l’expression du gène de l’insuline Résulte de deux effets : - stimulation de l’activité de transcription - stabilisation des ARNm Séquences activatrices en cis du promoteur les plus importantes sont situées dans les boîtes E1, A3 , C1 , Z III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Pas d’effet direct du glucose sur les régions activatrices en cis Implication de métabolites du glucose (par ex. glyceraldéhyde) Activation des facteurs de transcription en trans (PDX-1**) Implication de voies de signalisations activées par le glucose (AMPc, PKA, calcium, CaMK, PKC, MAPK, PI3K) III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline B- Contrôle de la transcription du gène de l'insuline Modulation de la transcription par les substrats énergétiques et les hormones b. Par les facteurs hormonaux Le GLP-1 o stimule la transcription du gène de l'insuline et augmente la stabilité des ARNm o mécanisme d’action : implique l’AMPc donc PKA, CREB et CRE : stimule également l'expression de PDX-1 et l'efficacité de son effet transactivateur après sa liaison sur les régions E2 et A3 (donc pas uniquement implication de la séquence CRE) III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline GH, la prolactine o stimulent la transcription du gène de l'insuline Insuline o effet discuté o classiquement décrite pour exercer un rétrocontrôle négatif sur l'expression de son gène o plus récemment décrite pour favoriser la transcription du gène de l’insuline (l'insuline favoriserait la liaison de PDX-1 sur la séquence A3 du promoteur du gène de l'insuline humaine) III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline C- De l’ARNm à la molécule d'insuline Traduction de l'ARNm et mise en réserve de la protéine - La traduction de l'ARNm aboutit à la formation de la prépro-insuline, polypeptide de 11,5 kDa - Passage de la prépro-insuline en formation dans la lumière du réticulum endoplasmique favorisée par le peptide signal (partie N-terminale de 25 acides aminés) - Clivage du peptide signal par des enzymes protéolytiques du RE et formation la proinsuline, peptide de 9kDa RE Cis golgi Trans golgi III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline - La pro-insuline est transportée dans des microvésicules intermédiaires (en 20 min environ) vers le cis -golgi - Conversion complète de la pro-insuline en insuline dans le trans- golgi (2 peptidases) – Vésicules recouvertes de clathrine - L'action conjuguée de ces enzymes permet le clivage du peptide C en libérant deux dipeptides et l'insuline III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline - Les vésicules deviennent des vésicules matures - L'insuline et le peptide C contenus dans les mêmes vésicules sont sécrétés (exocytose) de façon équimolaire - Dans des conditions physiologiques, plus de 95 % de l'hormone sont sécrétés sous forme d'insuline et 5 % sous forme de pro-insuline Synthèse d'insuline et transport intracellulaire Synthèse d'insuline et transport intracellulaire III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline D- Exocytose des vésicules de sécrétion - Une cellule β humaine contient en moyenne 10 000 vésicules de sécrétion - L’exocytose de l'insuline est finement régulée - Variations d'insulinémie à court et à moyen terme sont majoritairement dues à une régulation de l'exocytose plutôt qu'à la synthèse d'insuline III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline D- Exocytose des vésicules de sécrétion Différents pools de granules Différents pools de granules définis en fonction : - de leur cinétique de fusion avec la membrane plasmique (localisations différentes) - de leur sensibilité au calcium intracellulaire - pool rapidement relargable (Readily Releasable Pool-RRP), pool immédiatement relargable (Immediatly Releasable Pool-IRP) = granules sont directement liés aux VDCC - pool hypersensible au calcium (Highly Calcium-Sensitive Pool-HCSP) - pool de réserve (Reserve Pool-RP) Pools RRP et HCSP Pool RP Renouvellement du pool RRP par le pool RP - nécessite une maturation préalable des granules - dépendant du métabolisme de l’ATP et de la concentration de calcium intracellulaire Etape 1 : les granules sont arrimés à proximité de la membrane plasmique (docking) Etape 2 : les granules vont subir des modifications dépendantes de l’ATP pour être amorcées à la membrane plasmique (priming) = granules compétentes pour fusionner avec la membrane plasmique et libérer l’insuline. Contrôlé en partie par le cytosquelette 1% III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline D- Exocytose des vésicules de sécrétion Rôle du cytosquelette La majorité des vésicules de sécrétion (RP) est localisée dans le cytoplasme associées à des microfilaments d’actine du cytosquelette et des microtubules. Basal : filaments d'actine réseau dense au niveau de la MP Stimulus glucose : Remodelage filaments actine SNARE RP III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Implication du cytosquelette dans le recrutement des granules d'insuline à la membrane plasmique sous l'influence du métabolisme du glucose ATP, calcium Reserve pool Le glucose induit la polymérisation des microtubules. Permet le transport des granules d'insuline du pool de réserve jusqu'aux filaments d'actine III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline D- Exocytose des vésicules de sécrétion Protéines de l’exocytose - des protéines monomériques à activité GTPasique (ex Rho, Rab, Ras like) - des canaux calcium de type L - le complexe NSF/SNAP/SNARE NSF : N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein SNAP : soluble NSF attachment protein SNARE : SNAP receptors Ca2+ III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline D- Exocytose des vésicules de sécrétion Protéines de l’exocytose Les SNARE : - présentes au niveau de la mb. plasmique ou t-SNARE (target- SNARE) : syntaxine et SNAP-25 (Synaptosomal Associated Protein of 25 kDa) - présentes au niveau de la mb. de la vésicule ou v-SNARE : vesicle SNARE: synaptobrévine (VAMP-2), synaptotagmine - molécules-clés du mécanisme de fusion membranaire - s’associent ce qui permet le rapprochement puis la fusion des deux bicouches lipidiques Les régulateurs du complexe SNARE Principales protéines impliquées dans le processus d'exocytose Modèle du cycle de fusion des granules d'insuline Munc 18 : I - syntaxine 1- Docking (arrivée près de la MP. Peu d’influence des SNAREs) 2- Amorçage : rôle des SNAREs Munc 13 déplace Munc 18 E + syntaxine docking priming 3- Interaction syntaxine et SNAP25 avec synaptobrévine (VAMP) Etat d'assemblage « incomplet » 4- Entrée Calcium Synaptotagmine : senseur calcique Liaison Ca / Synaptotagmine Complexe SNARE « complet » Fusion des membranes et exocytose de l'insuline Modèle du cycle de fusion des granules d'insuline 5- Complexe SNARE : devient récepteur des protéines NSF et SNAP Hydrolyse ATP (NSF: ATPase) Dissociation du complexe 6- Recyclage des granules et de leurs constituants membranaires par endocytose III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Remarque : Rôle des protéines monomériques à activité GTPase Famille des Rho GTPases : protéines Rho, Rac, Cdc42 - Rac1 et Cdc42 colocalisées avec les granules de sécrétion - Rac1 et Cdc42 auraient un rôle dans le remodelage des filaments d’actine - Cdc42 serait impliquée dans l’amorçage des granules (facilite interaction entre protéines du complexe SNARE = syntaxine et VAMP2) Famille des Rab GTPases - Rab3A et Rab27A sont associées avec les granules d’insuline - Rab3A impliquée dans le renouvellement du RRP par le RP - Rab27A serait impliquée dans l'étape d’amorçage des granules à la membrane III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline Remarque : Rôle des protéines monomériques à activité GTPase Famille des "Ras-like" GTPases - Rap1 et RalA sont impliquées dans le docking et le priming - Rap1 est une protéine activée par Epac2 (AMPc-GEF) Implication des petites GTPases dans l’exocytose des granules d’insuline Rho GTPases : protéines Rho, Rac, Cdc42; Rab GTPases; "Ras-like" GTPases : Rap1, RalA I- Généralités II- Structure de l'insuline III- Biosynthèse et sécrétion de l'insuline IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 1) Sécrétion basale o Sécrétion basale selon un mode pulsatile o Ce caractère pulsatile aurait une importance physiologique: améliorerait la réponse à l'insuline - en évitant la diminution du nombre de récepteur à l'insuline - en évitant le développement d'une insulino-résistance o Les oscillations sont de 2 types : - oscillations lentes de période entre 2 et 3 heures -oscillations rapides de période de 5 à 15 minutes. Production et sécrétion de l’insuline par les cellules β pancréatiques Pr Catherine OIRY-CUQ ,Laboratoire de Pharmacologie, Faculté de pharmacie, UM [email protected] IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée La capacité de stockage de l'insuline par la cellule β est particulièrement élevée Toute molécule capable d'influencer la sécrétion de l'insuline est, par définition, une molécule qui agira en modulant le processus d'exocytose. Hormis certaines exceptions (glucose, GLP-1), les stimuli de la sécrétion d'insuline n'ont pas une influence majeure sur la biosynthèse de l'hormone. IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée Les agents stimulants de la sécrétion d'insuline sont classés en deux grands groupes : - stimuli primaires (ou déclencheurs), - stimuli secondaires (ou potentialisateurs ou amplificateurs). Les agents dits « atténuateurs » de la sécrétion d'insuline IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline Les agents stimulants: Les stimuli primaires (ou déclencheurs) : déclenchent à eux seuls la sécrétion d'insuline -ex. glucose (agent stimulant le plus puissant) – Stimule à des concentrations physiologiques - ex. acides aminés, mannose, glycéraldéhyde AGNE - ex. sulphonylurées et glinides Stimulent à des concentrations supraphysiologiques IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline Les agents stimulants: Les stimuli secondaires (ou potentialisateurs ou amplificateurs) : o Pas d'effet stimulant direct sur la sécrétion d'insuline o Amplifient la sécrétion d'insuline induite par un stimulus primaire -ex. substrats énergétiques, hormones digestives (ex. GLP-1), acétylcholine, etc - ex. analogues GLP1 (antidiabétiques) Remarque : Rôle central du glucose : protection contre l'hypoglycémie Aucune autre substance ne peut stimuler la sécrétion d'insuline, si la glycémie est trop basse IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline Les agents « atténuateurs » de la sécrétion d'insuline - Capables de diminuer l'intensité de la réponse sécrétoire au glucose - Neuromédiateurs libérés par les terminaisons nerveuses sympathiques de l'îlot, en particulier la noradrénaline - Certaines hormones agissant par voie endocrine ou paracrine (ex. somatostatine) Principaux facteurs humoraux et nerveux de contrôle de la sécrétion d'insuline IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline Contrôle de la sécrétion d'insuline fait appel à des nutriments et des substrats énergétiques, des hormones et des neuromédiateurs, en interaction complexe. Le glucose conditionne la réponse sécrétoire à tous les autres stimuli. IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée A) Sécrétion d’insuline induite par le glucose Glucose - Agent stimulant le plus puissant - Conditionne la réponse sécrétoire de tous les autres stimuli (effet dit « permissif » du glucose) - 2 caractéristiques majeures de la réponse insulinique / glucose : - rapidité - sensibilité IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée A) Sécrétion d’insuline induite par le glucose Sécrétion Insuline Courbe concentration - effet Courbe sigmoïdale IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée A) Sécrétion d’insuline induite par le glucose Sécrétion Insuline In vitro - Cinétique de sécrétion – concentration fixe de glucose (20 mM) Stimulus glucose constant et prolongé Profil sécrétoire biphasique 1er pic: pic précoce (1ère phase de SI) Pic tardif : 2ème phase de SI Aug. progressive de la SI = valeur d’équilibre Se maintient jusqu’à l’arrêt de la stimulation IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée A) Sécrétion d’insuline induite par le glucose La signification physiologique du caractère biphasique de la sécrétion d'insuline n’est pas tout à fait établie HYP rôle du pic précoce de sécrétion : - sensibiliser les tissus cibles aux effets de l'hormone et d'empêcher une hyperinsulinémie trop prononcée et une hypoglycémie réactionnelle - inhiber la production hépatique de glucose Disparition du pic précoce : caractéristique majeure de l'altération de la fonction pancréatique chez le diabétique de type 2. Signe le plus précoce IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée B) Mécanismes cellulaires de la réponse insulinosécrétoire au glucose Rôle central de la concentration intracytosolique de calcium: - dans l’activation des protéines du cytosquelette - dans le couplage stimulus-sécrétion, quels que soient les mécanismes mis en jeu en amont - importance du contrôle de cette concentration IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée B) Mécanismes cellulaires de la réponse insulinosécrétoire au glucose Contrôle de la concentration intracytosolique de calcium dans la cellule β - Concentration intracytosolique de calcium très faible / concentration cellulaire totale et de sa concentration extracellulaire. - À l'état basal, il existe un gradient très important entre sa concentration extracellulaire (10-3M) et sa concentration intracytosolique (10-7M) - Le maintien de la concentration intracytosolique de Ca2+ à un niveau très bas est assuré par un transport actif qui rejette l'ion hors de la cellule (pompe Ca2+/ATP-dépendante) - Certains organites cellulaires concentrent l'ion : - soit grâce à une ATPase (réticulum endoplasmique) - soit par un échangeur Na+ / Ca2+ (mitochondrie) IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée B) Mécanismes cellulaires de la réponse insulinosécrétoire au glucose La sécrétion d'insuline induite par le glucose implique deux mécanismes complémentaires: 1- Voie initiatrice de la sécrétion d'insuline : voie dépendante des KATP ("triggering pathway ") = à l'origine du premier pic de sécrétion – Pools de vésicules RRP 2- Voie amplificatrice de la sécrétion d'insuline : voie indépendante des KATP ("amplifying pathway") = voie complémentaire de la 1ère = contribue à expliquer le maintien d'une réponse soutenue à un stimulus constant de glucose. Pools de vésicules RP Voie initiatrice de la sécrétion d'insuline : voie dépendante des KATP F6P Au repos, la membrane plasmique est polarisée aux environs de -70mV (courant sortant de K+) Importance du canal KATP (sensible à l'ATP) - Hétéro-octamère - Sulfonylurées Glucose - Élévation du rapport ATP/ADP, entraîne une fermeture des canaux KATP … Nombreux arguments expérimentaux montrent : Le processus impliquant les canaux KATP n‘est pas suffisant pour expliquer le maintien d'une réponse soutenue à un stimulus constant de glucose et surtout à son caractère biphasique L'absence de coïncidence entre le profil de sécrétion d'insuline en réponse au glucose et les événements ioniques et électriques Existence d'une autre voie, complémentaire de la voie dépendante des KATP Voie amplificatrice de la sécrétion d'insuline: voie indépendante des KATP Effet activateur du glucose sur la PLC et adénylate cyclase (AC) via le calcium Glucose Glucose Ca++ Ca/caM Voie amplificatrice de la sécrétion d'insuline: voie indépendante des KATP Rôle des intermédiaires du cycle de Krebs IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée C) Sécrétion d’insuline induite par les acides aminés Les acides aminés sont capables, dans leur majorité, de stimuler la sécrétion d'insuline. Les plus puissants sont la leucine, l'arginine et la lysine. Ils stimulent de façon modeste la sécrétion d'insuline en présence de faibles concentrations de glucose Ils stimulent plus fortement la sécrétion d'insuline lorsque la concentration de glucose s'élève = amplificateurs très efficaces IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée C) Sécrétion d’insuline induite par les acides aminés MECANISMES D’ACTION La leucine : métabolisée par la cellule β. Métabolite intègre le cycle de Krebs – Production d’équivalents réduits et ATP … Effet insulinosécréteur par des voies semblables à celles du glucose La lysine et l’arginine pénètrent facilement dans la cellule. Leur charge positive permet de dépolariser la membrane plasmique et favorise l’entrée de calcium dans la cellule. L’aspartate et le glutamate, deux acides aminés chargés négativement sont également capable de stimuler la sécrétion d’insuline via des récepteurs glutamatergiques (AMPA). Effet moindre par rapport aux trois acides aminés décrits précédemment IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée D) Les modulateurs de la sécrétion d'insuline La sécrétion d'insuline induite par le glucose peut être modulée par: - des sécrétagogues non nutritifs, - des hormones, - des facteurs de croissance, -ou des neurotransmetteurs. Implication de différentes voies de signalisation intracellulaire D) Les modulateurs de la sécrétion d'insuline 1- Voie de l'adénylate cyclase – AMPc – PKA Amplification de la sécrétion d’insuline par activation de AC: RCPG couplés à Gs - GLP-1 (Glucagon Like Peptide 1) - GIP (Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide) Incrétines (hormones digestives libérées par l'intestin lors du passage des nutriments) GLP-1: produit dans les cellules L du jéjunum et de l'iléon (régions distales de l'intestin) GIP : produit par les cellules K du duodénum (régions proximales de l'intestin) Sécrétion de GIP et de GLP-1 : déclenchée par le glucose***, les acides aminés et les AGL Effet insulinotrope observé en présence de concentrations de glucose supérieures ou égales à la normoglycémie = GLUCO-DEPENDANCE D) Les modulateurs de la sécrétion d'insuline 1- Voie de l'adénylate cyclase et de l'AMPc – PKA Amplification de la sécrétion d’insuline par activation de AC: RCPG couplés à Gs - Glucagon (hormone insulaire, voie paracrine** ou endocrine) - PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide) - VIP (Vasoactive Intestinal Peptide) Libérés suite à activation du système nerveux parasympathique (!!! Également Ach et GRP mais RCPG/Gq) Remarque : les actions de l'AMPc peuvent être médiées par deux mécanismes distincts: Rap-1 et Rap-2 (petites protéines G) Modèle de l'exocytose de l'insuline dépendante de l'AMPc Epac ou cAMP-GEF (cAMP regulated Guanine nucleotide Exchange Factor) IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée D) Les modulateurs de la sécrétion d'insuline 1- Voie de l'adénylate cyclase et de l'AMPc Diminution de la sécrétion d’insuline par inhibition de AC : RCPG couplés à Gi - Somatostatine (hormone insulaire – voie paracrine** et libérée par les terminaisons nerveuses sympathiques) - CGRP (calcitonin gene-related peptide) - Noradrénaline - Galanine - NPY Libérés suite à activation du système nerveux sympathique Stress Rôle physiologique au cours de l’exercice physique D) Les modulateurs de la sécrétion d'insuline 2- Voie de la PLC Amplification de la sécrétion d’insuline par activation de PLC β: RCPG couplés à Gq - CCK (cholécystokinine 33 – Hormone intestinale (incrétine)) - Ach - GRP (Gastrin Releasing Peptide) Libérés suite à activation du système nerveux parasympathique - Acides gras libres Remarque : les AGL peuvent aussi potentialiser la sécrétion d’insuline en pénétrant dans la cellule β puis en subissant une métabolisation avec production d’acyl-CoA Principaux facteurs humoraux et nerveux de contrôle de la sécrétion d'insuline (R. β2, couplés Gs) (R. M3 , M4, couplés Gq) (R. α2, couplés Gi) Différentes modulations de la sécrétion d'insuline IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée D) Les modulateurs de la sécrétion d'insuline 3- Les rôles des protéines kinases La PKA (activée par l’AMPc) Phosphoryle divers substrats cibles sur des résidus sérine ou thréonine Implication de la PKA dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline: - sensibilisation au calcium la "machinerie sécrétoire" : l’exocytose des granules à de plus faibles concentrations de calcium intracellulaire = augmente le nombre de vésicules fortement sensibles au calcium (HCSP) - favorise le transport des granules RP à la membrane plasmique - phosphoryle différentes protéines impliquées dans l’exocytose (ex. Rim-1 (effecteur de Rab3-A), SNAP-25, la snapine et la synapsine …) 3- Les rôles des protéines kinases La PKA (activée par l’AMPc) - phosphoryle des canaux calciques dépendants du voltage de type L = augmentation du calcium intracellulaire - phosphoryle des récepteurs de l’IP3 localisés au niveau réticulum endoplasmique = relargage du calcium contenu dans les stocks intracellulaires - phosphoryle GLUT-2 = augmentation de la sécrétion d’insuline 3- Les rôles des protéines kinases La PKC (activée par l’AMPc) Phosphoryle divers substrats cibles sur des résidus sérine ou thréonine Plusieurs isoformes exprimées dans la cellule β Implication de la PKC dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline: - favorise le processus d'exocytose en phosphorylant plusieurs protéines du complexe SNARE (ex. Munc-18, SNAP-25 et la synaptotagmine), - phosphoryle les canaux calciques, - augmente le nombre de vésicules fortement sensibles au calcium (HCSP). 3- Les rôles des protéines kinases La CaMK II Phosphoryle divers substrats cibles sur des résidus sérine ou thréonine Son activation est dépendante de la présence de calcium et de calmoduline Plusieurs isoformes exprimées dans la cellule β Implication de la CaMK II dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline: - phosphorylation de protéines du complexe SNARE favorisant directement l’exocytose (ex. VAMP-2, synaptotagmine) - mobilisation des granules d'insuline du pool de réserve vers le pool immédiatement relargable 3- Les rôles des protéines kinases ERK1/2 Phosphoryle divers substrats cibles sur des résidus sérine ou thréonine (famille des MAPK) Classiquement décrite comme impliquée dans les phénomènes de prolifération, de différentiation et de survie des cellules Peut phosphoryler différentes protéines cibles localisées sous la membrane, associées aux microtubules dans le cytoplasme Peut être transloquée dans le noyau où elle peut phosphoryler divers facteurs de transcription régulant l'expression des gènes (ex. CREB, PDX-1) 3- Les rôles des protéines kinases ERK1/2 Principalement activée par des récepteurs tyrosine kinase tels que le récepteur de l’insuline ou de l’IGF-1 Activée par le glucose dans la cellule β (via aug. Calcium intracellulaire) Activée par différentes hormones (RCPG) (ex. GLP-1, PACAP, GIP) Peut aussi être activée via différentes voies de signalisation : PKA, Epac, PKC et CaMK II (croisement des voies de signalisation ) Croisement des voies de signalisations dans la cellule β et activation de ERK1/2 CaMKII PKC Epac Survie des cellules β Sécrétion d’insuline Production et sécrétion de l’insuline par les cellules β pancréatiques Pr Catherine OIRY-CUQ ,Laboratoire de Pharmacologie, Faculté de pharmacie, UM [email protected] IV- Contrôle de la sécrétion d’insuline 2) Sécrétion régulée D) Les modulateurs de la sécrétion d'insuline 3- Les rôles des protéines kinases La PKA (activée par l’AMPc) Phosphoryle divers substrats cibles sur des résidus sérine ou thréonine Implication de la PKA dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline: - sensibilisation au calcium la "machinerie sécrétoire" : l’exocytose des granules à de plus faibles concentrations de calcium intracellulaire = augmente le nombre de vésicules fortement sensibles au calcium (HCSP) - favorise le transport des granules RP à la membrane plasmique - phosphoryle différentes protéines impliquées dans l’exocytose (ex. Rim-1 (effecteur de Rab3-A), SNAP-25, la snapine et la synapsine …) 3- Les rôles des protéines kinases La PKA (activée par l’AMPc) - phosphoryle des canaux calciques dépendants du voltage de type L = augmentation du calcium intracellulaire - phosphoryle des récepteurs de l’IP3 localisés au niveau réticulum endoplasmique = relargage du calcium contenu dans les stocks intracellulaires - phosphoryle GLUT-2 = augmentation de la sécrétion d’insuline 3- Les rôles des protéines kinases La PKC Phosphoryle divers substrats cibles sur des résidus sérine ou thréonine Plusieurs isoformes exprimées dans la cellule β Implication de la PKC dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline: - favorise le processus d'exocytose en phosphorylant plusieurs protéines du complexe SNARE (ex. Munc-18, SNAP-25 et la synaptotagmine), - phosphoryle les canaux calciques, - augmente le nombre de vésicules fortement sensibles au calcium (HCSP). 3- Les rôles des protéines kinases La CaMK II Phosphoryle divers substrats cibles sur des résidus sérine ou thréonine Son activation est dépendante de la présence de calcium et de calmoduline Plusieurs isoformes exprimées dans la cellule β Implication de la CaMK II dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline: - phosphorylation de protéines du complexe SNARE favorisant directement l’exocytose (ex. VAMP-2, synaptotagmine) - mobilisation des granules d'insuline du pool de réserve vers le pool immédiatement relargable 3- Les rôles des protéines kinases ERK1/2 Phosphoryle divers substrats cibles sur des résidus sérine ou thréonine (famille des MAPK) Classiquement décrite comme impliquée dans les phénomènes de prolifération, de différentiation et de survie des cellules Peut phosphoryler différentes protéines cibles localisées sous la membrane, associées aux microtubules dans le cytoplasme Peut être transloquée dans le noyau où elle peut phosphoryler divers facteurs de transcription régulant l'expression des gènes (ex. CREB, PDX-1) 3- Les rôles des protéines kinases ERK1/2 Principalement activée par des récepteurs tyrosine kinase tels que le récepteur de l’insuline ou de l’IGF-1 Activée par le glucose dans la cellule β (via aug. Calcium intracellulaire) Activée par différentes hormones (RCPG) (ex. GLP-1, PACAP, GIP) Peut aussi être activée via différentes voies de signalisation : PKA, Epac, PKC et CaMK II (croisement des voies de signalisation ) Croisement des voies de signalisations dans la cellule β et activation de ERK1/2 CaMKII PKC Epac Survie des cellules β Sécrétion d’insuline Le diabète de type 2 Définition du diabète (OMS) Le diabète est défini par: - glycémie à jeun supérieure à 1.26 g/l (7 mmol/l) et vérifiée à deux reprises. - présence de symptômes de diabète (polyurie, polydipsie, amaigrissement ) associée à une glycémie supérieure ou égale à 2 g/l (11 mmol/l) - glycémie supérieure ou égale à 2 g/l (11 mmol/l) deux heures après une charge orale de 75 g de glucose (HGPO). Dans le DT2 : existence période intermédiaire "état pré diabétique" Le diabète de type 2 (diabète non insulinodépendant, DNID) - environ 90% des patients diabétiques, - diabète "gras" ou de "maturité" (après 40 ans). !!! la maladie est en constante progression chez l'enfant !!! - évolue de façon insidieuse. Longtemps asymptomatique !!! de nombreux diabétiques ignorent leur état !!! - les complications cardio-vasculaires : principale cause de décès des patients DT2. Facteurs de risque du diabète de type 2 Obésité et facteurs environnementaux (alimentation, sédentarité) Hérédité (maladie à prédisposition familiale) Âge (risque de diabète de type 2 augmente avec l'âge) Diabète gestationnel ou femmes ayant donné naissance à un enfant de plus de 4 kg Syndrome métabolique : Association d’au moins 3 des facteurs de risque suivants: o Obésité abdominale o Dyslipidémie o HTA o Glycémie à jeun ≥ 1.1 g/l Physiopathologie du diabète de type 2 Le DT2 conjugue deux troubles métaboliques: - une défaillance précoce des cellules β des îlots de Langerhans du pancréas (perte de fonctionnalité (sécrétion d’insuline) associée à diminution de la masse cellulaire β), - une insulinorésistance dans le foie, le muscle et le tissu adipeux. IR aggravée par la sédentarité, l’obésité, les déséquilibres nutritionnels et l’hyperglycémie elle-même. Tissu adipeux Foie Production AGL ( lipolyse) Production de glucose ( néoglucogénèse) Altération signalisation de l’insuline Insulino-résistance SANG glucose acides gras libres (AGL) Insulinopénie Altération sécrétion insuline Pancréas (cellules β) Muscle Altération captation de glucose ( stockage du glycogène) Complications du diabète de type 2 Rétinopathie diabétique AVC 1ère cause de cessité chez adulte Maladie Cardio-vasculaire Néphropathie diabétique 1ère cause de mise en dialyse pour palier insuffisance rénale 8/10 diabétiques meurent d’une maladie cardiovasculaire Neuropathie diabétique Troubles de la sensibilité membres inf. Amputation Signes cliniques du diabète de type 2 - LE PROBLEME : ABSENCE DE SIGNE CLINIQUE diagnostiqué par dépistage ou au stade des complications - Signes possibles d’alerte: polyurie, soif intense, infections récidivantes, - Recommandation de l’ANAES: dépistage systématique au moins tous les trois ans à partir de 45 ans. Les traitements du diabète de type 2 Tissu adipeux Foie Muscle Biguanides TZD production de glucose réabsorption de glucose Rein biguanides SANG glucose acides gras libres (AGL) sécrétion insuline / potentialisation Sulfamides hypoglycémiants Glinides Analogues GLP1, I- DPP4) Pancréas utilisation périphérique de glucose production AGL Absorption du glucose IAG Intestin Dapagliflozine : Inhibiteur des cotransporteurs sodium-glucose de type 2 (SGLT2) dans le rein (tubules proximaux) . Commission de transparence avril 2014 Les biguanides la metformine Metformine Une partie des effets de la metformine serait expliquée par une activation de l’AMP kinase dans le foie et dans le muscle. AMPK : ″adenosine monophosphate-activated kinase″ Véritable senseur métabolique Activée par l’augmentation du rapport AMP/ATP La metformine stimule les voies cataboliques impliquées dans la synthèse d’ATP (oxydation des acides gras, glycolyse) La metformine inhibe les voies anaboliques ou consommatrices d’ATP (synthèse protéique, du cholestérol, des acides gras). Metformine Metformine Muscle Foie Activation AMPK Activation AMPK Activité ACC Expression SREBP-1 Expression des enzymes de la lipogenèse Néoglucogenèse Glycogénolyse Captation glucose Réduction de la production hépatique de glucose*** Oxydation acides gras Synthèse VLDL Sensibilité à l’insuline Synthèse des TG et de la stéatose hépatique (AMPK : adenosine monophosphate-activated kinase; SREBP-1: sterol-regulatory-element-binding-protein-1; ACC : acetyl-CoA carboxylase) Metformine La metformine ne stimule pas la sécrétion d'insuline et, par conséquent, ne provoque pas d'hypoglycémie. La metformine est indiquée en première intention dans le traitement du DT2, si exercice physique et régime alimentaire sont insuffisants pour rétablir l’équilibre glycémique. Association possible avec d’autres classes d’antidiabétiques Les sulfamides hypoglycémiants Sulfonylurées Glibenclamide (DAONIL) Glimépiride (AMAREL) Glipizide (GLIBENESE) Gliclazide (DIAMICRON) Sulfamides hypoglycémiants Dans les années 50 à Montpellier … - découverte fortuite par le Pr Janbon - effet hypoglycémiant d’un sulfamide utilisé comme antibactérien Mécanisme d’action - décrit par le Pr Loubatière - augmentation de la sécrétion d’insuline par le pancréas Sulfamides hypoglycémiants Canal KATP Sulfamides: liaison à SUR1 des canaux KATP/ fermeture du canal Mécanisme d’action des sulfamides hypoglycémiants L’efficacité hypoglycémiante dépend de la capacité résiduelle du pancréas à sécréter de l’insuline. Durée action assez longue : !!!! Effets indésirables : hypoglycémies Sulfamides hypoglycémiants Les sulfamides hypoglycémiants sont indiqués en monothérapie dans le traitement du DT2, lorsque le régime alimentaire, l'exercice physique et la réduction pondérale seuls ne sont pas suffisants pour obtenir l'équilibre glycémique. Association possible avec d’autres classes d’antidiabétiques Les glinides Répaglinide NOVONORM® Glinides Le répaglinide (insulinosécréteur non sulfamidé) : - Se lie sur la protéine SUR des canaux KATP des cellules β (site distinct des sulfamides) fermeture canaux … (idem sulfamides) - Durée action plus courte – Hypoglycémies plus modérées - Mêmes indications que les sulfamides hypoglycémiants Médicaments agissant sur les incrétines Médicaments agissant sur les incrétines L’intestin est impliqué dans le contrôle de l’homéostasie glucidique par la sécrétion des incrétines : GLP-1 : glucagon-like peptide-1 GIP : glucose-dependent insulinotropic polypeptide « Effet incrétine »: stimulation de la sécrétion d'insuline en réponse à l'ingestion d'aliments. Insulin (pmol/L) 400 VO IV 300 Après une charge orale en glucose, la sécrétion d'insuline est nettement plus importante qu'après la même charge par voie intraveineuse. 200 100 0 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 Time (min) Médicaments agissant sur les incrétines Synthèse et sécrétion GLP-1 et du GIP Cellule K (jejunum) Cellule L (ileum+ colon) ProGIP Proglucagon GLP-1 [7-37] GLP-1 [7-36NH2] GIP [1-42] La sécrétion de GLP-1 est considérablement réduite dans le diabète de type 2 mais son action conservée. Médicaments agissant sur les incrétines Effets physiologiques du GLP-1 et du GIP Médicaments agissant sur les incrétines La demi-vie des incrétines étant très faible (1 à 2 min), deux modèles thérapeutiques sont proposés : - Inhibition de l’enzyme qui dégrade les incrétines (la dipeptidyl peptidase IV, DPPIV). les gliptines - Utilisation d’analogues non hydrolysable du GLP-1 - exénatide, liraglutide Inhibiteurs de la dipeptidyl peptidase IV Les gliptines sitagliptine vildagliptine saxagliptine Les gliptines Les gliptines - Empêchent l'hydrolyse des incrétines par la DPP-4, entrainant une augmentation des concentrations plasmatiques des formes actives du GLP-1 et du GIP, - Augmentation de la libération d'insuline et diminution des taux de glucagon d'une manière glucose-dépendante (faible risque d’hypoglycémie) - Agissent essentiellement sur la glycémie post prandiale Les gliptines La sitagliptine et la vildagliptine : monothérapie si metformine CI ou non tolérée lorsque le régime alimentaire, l'exercice physique et la réduction pondérale seuls ne sont pas suffisants pour obtenir l'équilibre glycémique Association possible avec d’autres classes d’antidiabétiques (bithérapie, trithérapie) La saxagliptine est indiquée en bithérapie ou trithérapie La demi-vie des incrétines étant très faible (1 à 2 min), deux modèles thérapeutiques sont proposés : - Inhibition de l’enzyme qui dégrade les incrétines (la dipeptidyl peptidase IV, DPPIV). les gliptines - Utilisation d’analogues non hydrolysables du GLP-1 - exénatide et liraglutide Analogues du GLP-1 Exénatide (Byetta ®) Liraglutide (Victoza®) Voie sous cutanée Analogues du GLP-1 Structure du GLP-1 et deux analogues du GLP-1 Analogues du GLP-1 - Analogues du GLP-1 qui résiste à l’inactivation par la DPP-IV - Agonistes du récepteur du GLP-1. Présente plusieurs actions hypoglycémiantes du GLP-1: - stimule de façon glucose-dépendante la sécrétion d'insuline par les cellules bêtapancréatiques. Lorsque la glycémie diminue, la sécrétion d'insuline diminue, - inhibe de façon glucose-dépendante la sécrétion de glucagon, anormalement élevée dans le diabète de type 2, - ralentit la vidange gastrique, diminuant ainsi le taux d'absorption intestinal du glucose. Analogues du GLP-1 Exénatide et liraglutide sont indiqués dans le traitement du diabète de type 2 en bithérapie ou trithérapie Les inhibiteurs des alpha-glucosidases miglitol DIASTABOL ® acarbose GLUCOR® Les inhibiteurs des alpha-glucosidases Acarbose: - inhibe de façon compétitive et réversible les alpha-glucosidases intestinales : enzymes de la bordure en brosse des entérocytes qui hydrolyse les poly-, oligo- et disaccharides en monosaccharides absorbables (glucose, fructose), - diminue la dégradation des carbohydrates en monosaccharides absorbables, - réduit l’hyperglycémie post-prandiale. Miglitol: même mécanisme d’action. Réduit l’hyperglycémie post-prandiale et la glycémie à jeun. Les inhibiteurs des alpha-glucosidases Les inhibiteurs des l’alpha-glucosidases sont indiqués dans le traitement du DT2, en complément d’un régime alimentaire, en monothérapie ou en association. Les insulines
