Output 4.1_DIVIN
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Output Composante 4.1 Création d'un Laboratoire pour l'échantillonnage, l'emballage et l’envoi du matériel génétique aux laboratoires spécialisés Cet output a été réalisé dans le cadre du projet DIVIN, “Développement des Interventions innovantes sur les cépages de Vignes autochtones pour l’INtégration italo-tunisienne”, financé avec le soutien du Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. N. d’identification du contrat : 1.1.002, CUP B14G13000060006. Le programme Italie-Tunisie s’inscrit dans le cadre de la composante de coopération transfrontalière (CBC), de l'Instrument Européen de Voisinage et de Partenariat (IEVP). Concerne cinq provinces de la Sicile (Agrigente, Caltanissetta, Raguse, Syracuse, Trapani) et six régions côtières de la Tunisie (gouvernorats de l'Ariana, Béja, Ben Arous, Bizerte, Jendouba, Nabeul). L'objectif principal est la promotion de l’intégration économique, sociale, institutionnelle et culturelle entre les régions tunisiennes et siciliennes par un processus de développement conjoint et durable, sur la base d'un centre de coopération transfrontalière. Pour plus d'informations sur le Programme de Coopération Transfrontalière ItalieTunisie 2007-2013, voir : http://www.italietunisie.eu Les informations y contenues ne reflètent pas nécessairement la position ou l'opinion de l’Autorité de Gestion du Programme ou de la Commission Européenne. Ce dossier n’engage que les partenaires du projet et ni l’Autorité de Gestion Commune ni la Commission Européenne ne sont pas responsables de l'usage qui pourrait être fait des informations qui y sont contenues. DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013 Sfide comuni, obiettivi condivisi Sommaire Contexte de création du laboratoire........................................................................................ 4 Zone noire : première zone de récolte...................................................................................... 5 Zone noire : phase d’échantillonnage...................................................................................... 6 Zone noire : envoi aux laboratoires specialisés ........................................................................ 8 Zone noire : échantillonnage des cépages réhabilités .......................................................... 9 Zone grise : culture dans les cellules climatiques et expédition des échantillons assainis…………………………………………………………………………………………………...11 Zone blanche : transfert dans la Screenhouse ...................................................................... 12 3 Contexte de création du laboratoire Au sein de la Composante 4 «Divin actions pilotes pour la définition d’une carte génétique des cultures», une correcte utilisation des espaces de laboratoire et des équipements spécifiques a été essentielle pour la gestion appropriée du matériel assaini. Cet emploi a été crucial pour assurer le bon état des échantillons jusqu'aux laboratoires spécialisés de destination, et par conséquent, pour atteindre les objectifs du projet DIVIN. Les opérations de collecte, de sélection et de préparation des échantillons ont été adaptées en fonction de l’utilisation finale des échantillons et du stade phénologique des plantes concernées. Afin de faciliter toutes les opérations, on a prévu de différents espaces, chacun pour une tâche spécifique, nécessaires aux différentes étapes de préparation du matériel collecté et assaini. Notamment dans l’action 4.1 «Création d'un Laboratoire pour l'échantillonnage, l'emballage et l’envoi du matériel génétique aux laboratoires spécialisés», les partenaires scientifiques du projet ont identifié des espaces différents où le matériel collecté dans le champ a été sélectionné et attentivement préparé pour l’envoi aux laboratoires spécialisés. D’autres espaces ont été utilisés pour garder et cultiver les plants assainies. Dans la même action 4.1, des procédures pour l’emploi adéquat des différents espaces ont été définies, en assurant la maintenance des plantes assainies et une réduction de possibilités de réinfection dans les opérations. De manière efficace, la collaboration active entre les partenaires scientifiques du projet DIVIN a permis d’uniformiser les processus de travail dans les espaces du laboratoire, en faveur des 4 lignes directrices très utiles pour la gestion future du matériel. Dans une seconde étape, l'IBBR a coordonné la validation des procédures dans les différents espaces. L’action 4.1 a été cordonnée par le Partenaire 1, IBBR, avec la collaboration des équipes des partenaires scientifiques, CBBC, INRAT et du Demandeur. Zone noire : première zone de récolte Dans une phase initiale, le matériel a été transporté du champ à une première zone de collecte, utilisée pour la sélection et la préparation des échantillons (Fig.1). Cette zone, définie « noire », comprend à son tour tous les espaces du laboratoire pour les manipulations du matériel potentiellement infecté, décrites dans les chapitres suivants. Au cours de cette phase, une attention particulière a été accordée aux outils utilisés. En Fig. 1. Sélection et préparation des échantillons particulier, afin d’éviter la transmission collectés en plein champ (zone noire). de maladies possibles (en particulier des infections fongiques) entre les plantes mères et prévenir la contamination entre matériels différents, les sécateurs et tous les outils utilisés ont été nettoyés de nouveau et traités à l'hypochlorite de sodium. 5 Zone noire : phase d’échantillonnage On a procédé à l’échantillonnage de tout le matériel potentiellement infecté dans la « zone noire » du laboratoire. En général, toutes les méthodes d'échantillonnage doivent assurer le bon état de l'échantillon jusqu'à ce qu'il arrive dans le laboratoire de destination. Des différentes procédures ont été appliquées sur la base de l’utilisation finale des échantillons. Quatre catégories des échantillons, distinctes en termes d’état sanitaire de la plante d'origine, temps de récolte, modalité et durée de stockage ont été jugés indispensables par les partenaires scientifiques du projet. Il s’agit en particulier de : 1) Échantillons provenant de plantes cultivées en plein champ pour l’assainissement par embryogenèse somatique (E1). 2) Échantillons de plantes cultivées en plein champ pour les analyses génétiques et sanitaires (E2). 3) Échantillons de plantes cultivées dans des conditions contrôlées pour les analyses génétiques et sanitaires (E3). 4) Échantillons de plantes assainies cultivées dans des conditions contrôlées pour la multiplication des génotypes d'intérêt (E4). Les échantillons utilisés pour l'embryogenèse somatique (E1) sont composés des inflorescences immatures collectées à partir de plantes adultes avant la fin de la floraison, à la fin du printemps (Avril et Mai en Méditerranée) (Fig. 2a et b). Les inflorescences ont été séparées avec soin à partir des plantes mères par l'utilisation de lames de rasoir stériles ou des cisailles qui ont été stérilisées dans le passage entre une 6 plante et la suivante. Afin de faciliter le transport à courte distance, les fleurs ont été placées dans des boîtes de Pétri fermées avec une du Parafilm, pour permettre l'échange de gaz. Dans le cas des échantillons destinés aux analyses génétiques et sanitaires (E2), il a été essentiel d’assurer la qualité du matériel de départ. Les échantillons prélevés sur le Fig. 3a et b : Echantillons de vigne récoltés au cours de la saison de croissance pour les analyses génétiques et sanitaires (zone noire). terrain ont été conservés dans des sacs en polyéthylène, clairement étiquetés et bien fermés. Chaque sac a été inspecté pour la présence des insectes vecteurs potentiels d'agents pathogènes. Les échantillons pour les analyses génétiques ont été constitués de feuilles récoltées au cours de la saison de croissance, ou du tissu sous-cortical obtenu à partir de branches ligneuses. Pour les analyses sanitaires la représentativité et la normalisation de l'échantillon constituent des facteurs critiques, indépendamment de la méthode utilisée (test sérologique ou moléculaire). En particulier, dans les espèces d'arbres, la distribution de l'agent pathogène dans la plante est erratique et souvent soumise à des variations 7 saisonnières. Par conséquent, ces échantillons ont été composés de feuilles (au moins 10) ou pétioles collectés pendant la saison de croissance, ou à partir du tissu souscortical (à partir des sarments lignifiés au moins 10-15 cm de long). Afin d'assurer l'homogénéité des échantillons, les feuilles et les sarments ont été rassemblés de différentes zones de la même plante, en prenant soin de choisir les parties présentant des symptômes liés aux maladies d'étiologie virale. Le choix de la période d'échantillonnage (et par conséquent du type d'échantillon) a varié dans le cas de maladies virales. En particulier, les maladies associées au court noué (GFLV, ArMV) ont été détectés préférentiellement au printemps, tandis que l’enroulement foliaire (GLRaVs) et le Bois strié (GVA, GVB, GVD) en automne. Zone noire : envoi aux laboratoires specialisés En général, tous les échantillons doivent être clairement étiquetés et accompagnés de la documentation appropriée. Les échantillons aussi préparés ont été transportés à deux laboratoires : l’un des cultures cellulaires et l’autre des analyses. Il s’agit de deux laboratoires séparés, où les échantillons ont été déplacés, en fonction de leur différente utilisation finale. Ainsi préparés, les échantillons destinés à l’embryogenèse somatique ont été transportés au laboratoire des cultures cellulaires. Dans ce lieu les normes de propreté et stérilité des espaces en contact avec le matériel ont été constamment garanties. Les boîtes de Pétri ont été entreposés dans des réfrigérateurs destinés uniquement au matériel végétal. Dans ce moment les inflorescences de cépages ont été stockées à 4 8 ° C, pour un maximum de 7 - 10 jours jusqu'à la mise en œuvre des protocoles pour l'embryogenèse somatique. Les échantillons pour les analyses génétiques et sanitaires ont été transportés au laboratoire d’analyse, un espace clairement distinct par rapport au laboratoire des cultures cellulaire, afin de minimiser le risque de contamination des milieux stériles. Une fois dans le laboratoire spécialisé, le matériel pour les analyses génétiques a été lavé, isolé par un scalpel jetable ou des lames de rasoir stériles, pesé avec des balances analytiques et divisé en parts de 50 mg qui sont immédiatement congelés et conservés à -20 °C. De même façon, le matériel pour les analyses sanitaires, a été lavé et séché et en fonction du type d'échantillon (feuilles ou pousses) les nervures ou le phloème sous-corticale ont été isolés au moyen d'un scalpel ou de lames de rasoir à usage unique stériles. Des échantillons de feuilles et de pousses ont été finement broyés et mélangés, et finalement divisée en aliquotes de 50 mg qui ont été immédiatement congelés et conservés à -80 C. Dans le cas où il n’a était possible le traitement immédiat des échantillons, les feuilles ont été stockées dans leurs sacs à 4 °C pendant une semaine dans un réfrigérateur destiné uniquement au matériel végétal. Dans les cas des vignes ligneuses, il a été possible de les conserver à 4 °C pendant quelques semaines. Zone noire : échantillonnage des cépages assainis L’échantillonnage des cépages assainis pour les analyses génétiques et sanitaires (catégorie d’échantillons E3) a eu lieu dans la « zone noire » du laboratoire. Les 9 protocoles adoptés pour l'échantillonnage du matériel sur le terrain ont été également utilisés pour les analyses génétiques et sanitaires à partir des cépages assainis en culture sur un milieu artificiel. Dans ce cas, la principale différence est la taille de l'échantillon en raison de moins de matériel obtenu par culture in vitro. On a utilisé des portions de feuilles expansées, pétioles et tiges non ligneuses, de plantules d'au moins 30 jours. Encore une fois pour les analyses sanitaires, une attention particulière a été accordée à l'utilisation provenant parties Fig. 4 a et b. Sélection du matériel pour les analyses génétiques et sanitaires à partir des cépages réhabilités en culture sur un milieu artificiel (zone noire, matériel n’est pas encore sélectionné). de de la de tissus différentes plante, à l'exception des racines. (Fig. 4a e b). Dans un tel cas, le matériel provenant des cultures in vitro a été lavé soigneusement pour éliminer tous résidus du milieu de culture et finement haché avec un scalpel ou des lames stériles (à usage unique), divisé en aliquotes de 50 mg avec des balances de précision, et immédiatement congelé et conservé à -80 C. 10 Zone grise : culture dans les cellules expédition des échantillons assainis climatiques et Suite à l’assainissement par embryogenèse somatique, dans la « zone grise » du laboratoire, les génotypes locaux de cépage ont été multipliés culture in des vitro par extrémités. Dans ce cas, l'échantillon de référence représenté par nombreuses produites Fig. 5a et b. Pousses de vigne cultivées dans des cellules contrôlées (zone grise). est à événement régénération les plantes partir unique d'un de (catégorie d’échantillons E4). Toutes les opérations dans cette phase ont été effectuées dans des conditions stériles garanties par des hottes stériles à flux laminaire, et par l'utilisation de verrerie et matériels plastiques stériles ou stérilisés à l’autoclave, loin de toute source possible de contamination dans un espace du laboratoire faisant partie de la «zone grise» où le matériel infecté n’arrive pas. Une fois isolées dans des conditions stériles, les pousses de vigne ont été cultivées dans des cellules contrôlées sur milieu artificiel, jusqu'à atteindre la taille appropriée pour être transférées dans un pot (Fig. 5a et b). Afin d'éviter d’éventuelles réinfections, toutes les opérations de transfert dans les pots ont été effectuées dans un environnement isolé de 11 l'extérieur, en utilisant des mélanges de substrat stérile. Cet espace aussi est inclus dans la zone grise dédiée à l’étiquetage, emballage et possible stockage à 4°C jusqu'au moment de l'expédition. Les échantillons clairement étiquetés, ont été attentivement préparés avec la documentation nécessaire. Zone blanche : transfert dans la Screenhouse Une fois acclimatées, les plantes ont été transférées dans des installations avec des filets anti-insectes (screenhouse) (Fig. 5c). Plus précisément, l'organisation Fig. 5c. Screenhouse avec des filets anti-insectes pour la conservation des cépages de vigne (zone blanche). de la screenhouse, a prévu deux différentes régions séparées par un système de portes avec réseau à double maille. L’espace dédié aux plantes réhabilitées est identifié comme « zone blanche ». Il s’agit d’une plus grande surface, dédiée à la culture de plantes en pots et à la collecte du matériel. Pour réduire le risque de transmission d'agents pathogènes toutes les pratiques agricoles (irrigation, fertilisation, taille, nettoyage des locaux de résidus végétaux) ont été réalisées avec le plus grand soin par de personnel technique hautement qualifié. Le 12 matériel nouvellement introduit a été soumis à des inspections périodiques pour vérifier l'état sanitaire des plantes et de l'identité variétale. 13
