Fascicule TD Biochimie - Exercices de Biochimie

Fascicule TD Biochimie
Biomolécules A (Université Claude-Bernard-Lyon-I)
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LICENCE SCIENCES ET TECHNOLOGIES
UE Biomolécules B - EXERCICES DE BIOCHIMIE – Semestre printemps 2021
ACIDES AMINES
Exercice 1 :
Calculer le pH d’une solution de glutamate monosodique, d’une solution de monochlorhydrate d’arginine et d’une solution
d’asparagine.
Exercice 2 :
Ecrire les différents états d’ionisation de la lysine. Tracer la courbe de titrage de 20 mL de dichlorhydrate de lysine 0,5
mol.L-1 par de la soude 1 mol.L-1.
Ecrire les différents états d’ionisation de l’acide aspartique. Tracer la courbe de titrage de 20 mL d’aspartate disodique
0,25 mol.L-1 par de l'acide chlorhydrique 4 mol.L-1.
Exercice 3 :
On réalise, dans une solution tampon de pH 6, l’électrophorèse d’un mélange d’Ala, Tyr, Glu et Lys. Sous quelles formes ioniques
se trouvent les acides aminés à pH 6, et dans quelles proportions exactement ? Quel est le sens de migration des acides aminés au
cours de l’électrophorèse ? Schématiser cette migration.
Exercice 4 :
Une solution contenant de la méthionine, de l’acide aspartique et de l’arginine en mélange est déposée dans une colonne de
chromatographie échangeuse d’anions. Quel doit être le pH de cette solution pour que les trois acides aminés soient retenus ?
L’élution des acides aminés est réalisée à différents pH : 11, 6 et 3. Donner l’ordre d’élution des acides aminés. Comment devrait-
on procéder pour séparer ces acides aminés dans une colonne échangeuse de cations ?
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PEPTIDES ET DETERMINATION DE LEUR STRUCTURE PRIMAIRE
Exercice 5 :
On hydrolyse par un excès d'acide chlorhydrique 672 mg de tripeptide Asp-Gly-Arg. Ecrire la réaction d'hydrolyse.
La séparation des acides aminés est directement effectuée par chromatographie sur résine échangeuse d'ions.
Quel type de résine faut-il choisir pour la séparation ? Comment éluer les acides aminés ?
Après neutralisation, on obtient 120 mg de Gly, 200 mg de Asp et 240 mg de Arg. Quel est le rendement de l'opération pour chaque
acide aminé ?
Exercice 6 :
On pratique une électrophorèse dans un tampon à pH 6. Ecrire la formule des dipeptides suivants et indiquer comment ils vont migrer :
Val-Met, Phe-Asp, Lys-Ser.
Exercice 7 :
Le glutathion est un tripeptide indispensable à la détoxification d’un certain nombre de composés oxydés. Le glutathion regroupe 3
acides aminés, le glutamate, la cystéine et la glycine (dans cet ordre de l’extrémité N-terminale vers l’extrémité C-Terminale). Le
groupe amine de la cystéine forme une liaison isopeptidique avec le groupe carboxylique du glutamate.
1- Quelle est la différence entre une liaison peptidique et une liaison isopeptidique ?
2- Dessinez la structure semi-développée du glutathion à pH 7.
3- Les fonctions anti-oxydantes du glutathion reposent sur la mise en place de ponts disulfure entre deux molécules de
glutathion. Ecrivez la réaction équilibrée de la mise en place de ce pont disulfure et représentez la molécule qui résulte de
cette association en dimère.
Exercice 8 :
Donnez ce que l’on obtient après l’action sur le peptide Asn-Arg-Phe-Glu-Met-Lys-Gly-Trp-Cys-Arg :
1- d’HCl 6M à 100°C
2- de la trypsine
3- de la chymotrypsine
4- du BrCN
5- de la carboxypeptidase A
6- de la carboxypeptidase B
Exercice 9 :
L'hydrolyse acide totale d'un peptide donne Arg, Val, Tyr, Glu, Lys, Ala, Gly en quantité équimolaire.
L'hydrolyse par la trypsine libère Arg, (Ala,Lys) et (Glu,Tyr,Gly,Val).
L'hydrolyse par la carboxypeptidase A donne Gly.
L'hydrolyse par la chymotrypsine donne (Glu, Gly) et (Lys, Val, Ala, Tyr, Arg).
Pouvez-vous donner la structure primaire du peptide ?
Quelle méthode peut-on employer pour lever l'incertitude finale?
Exercice 10 :
L'hydrolyse acide totale d'un peptide donne : Ala, Lys, 2 Glu, His, Ile, Phe, Pro, Val.
L’action du 2,4-dinitrofluorobenzène suivie d’une hydrolyse acide permet d’isoler un dérivé di-DNP-Lys.
Les carboxypeptidases A et B sont sans effet.
L’hydrolyse combinée par la trypsine et la chymotrypsine permet d’isoler un acide aminé libre, un tripeptide et un pentapeptide.
L’hydrolyse acide partielle du pentapeptide permet d’isoler notamment les fragments suivants : Ala-Pro, Val-Ala, Ile-Glu.
La dégradation d’Edman du tripeptide permet d’isoler le dérivé PTH d’un acide aminé acide.
Donner la (les) séquence(s) possible(s) de l’oligopeptide.
Exercice 11 :
Après hydrolyse acide totale, on trouve que la composition en acides aminés d'un oligopeptide P était : Lys 1, Arg 1, Asx 1, Ser 1,
Glx 1, Pro 1, Gly 1, Ala 1, Val 1, Met 2, Ile 1, Phe 1. La charge nette de P est de +1 à pH 6,55. Après traitement de P par le DNFB, on
obtient DNP-Ser. L'action de la trypsine sur P donne trois oligopeptides dont on détermine la composition brute en acides aminés après
hydrolyse acide :
T1 : Lys 1, Glx 1, Pro 1, Gly 1, Val 1, Met 1
T2 : Arg 1, Ser 1, Ala 1, Met 1, Phe 1
T3 : Asx 1, Ile 1.
T1 absorbe fortement à 280 nm.
L’action du réactif d’Edman sur T3 permet d’identifier l’acide aspartique.
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L'action de la chymotrypsine sur P donne 3 oligopeptides dont on détermine la composition en acides aminés après hydrolyse acide :
CT1 : Arg 1, Ala 1, Val 1, Met 1
CT2 : Lys 1, Asx 1, Glx 1, Pro 1, Gly 1, Met 1, Ile 1
CT3 : Ser 1, Phe 1
L'hydrolyse de P par le bromure de cyanogène donne 3oligopeptides dont la composition en acides aminés après hydrolyse acide est :
BC1 : Arg 1, Glx 1, Ala 1, Val 1, homosérine lactone 1
BC2 : Lys 1, Asx 1, Pro 1, Gly 1, Ile 1
BC3 : Ser 1, Phe 1, homosérine lactone 1
Traité par le chlorure de dansyle, puis hydrolysé par l'acide chlorhydrique, BC2 donne dansyl-Gly.
Quelle est la séquence de P ?
CONFORMATION, SOLUBILITE ET DOSAGE DES PROTEINES
Exercice 12 :
L’hormone de croissance humaine possède les caractéristiques suivantes :
Longueur de la séquence : 191 acides aminés
Masse moléculaire : 24847 Da
Coefficient d'extinction molaire à 280 nm (1 cm) : 18890 L.mol-1.cm-1
Point isoélectrique théorique : 4,9
Elle est synthétisée en tant que précurseur, qui génèrera la protéine mature après clivage du peptide signal (en italique).
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIP
TPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQT
YSKFDTNSHNDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
Donnez la valeur de l’absorbance lue à 280 nm lors d’un dosage spectrophotométrique d’une solution à 0,1% de l’hormone de
croissance (longueur de la cuve = 1 cm).
Quel sera le comportement de l’hormone de croissance mature dans une résine échangeuse d’anions dans un tampon de pH
7,5 ?
Combien de peptides obtient-on en théorie si l’on incube l’hormone de croissance mature avec de la trypsine ? En pratique, on
en recueille 2 de moins. Proposez une hypothèse pouvant expliquer ce résultat.
Exercice 13 :
On souhaite déterminer la concentration protéique d’une solution inconnue par la méthode du biuret. Dans cette méthode, les
liaisons peptidiques forment en milieu alcalin un complexe coloré avec les ions Cu2+. L'absorbance à 540 nm d'une solution
contenant des protéines et du réactif du biuret (sulfate de cuivre dans la soude, la concentration du sulfate de cuivre doit être en
large excès par rapport à celle de la protéine) est proportionnelle à la concentration du complexe protéine-Cu2+ formé.
Une solution étalon d'albumine de sérum bovin (BSA) à 10 g/L est utilisée pour réaliser une gamme étalon, la quantité par tube de
BSA va de 1 à 5 mg (tableau, tubes 1 à 6). Pour la solution inconnue, la mesure est réalisée en double (tubes 7 et 8) en utilisant
0.8 mL de la solution inconnue diluée deux fois dans une solution de NaCl à 9 g/L.
Dans chaque tube (gamme étalon ou échantillon à doser), on ajoute à la solution de protéines 4 mL de réactif et le volume final est
ajusté à 5 mL avec de l’eau distillée. Pour chaque tube, on lit au spectrophotomètre l'absorbance de la solution à 540 nm.
Numéro de tubes
1
2
3
4
5
6
7
8
9
solution de BSA à 10
g/L (mL)
quantité (mg)
0
1
2
3
4
5
solution inconnue (mL)
diluée
eau distillée (mL)
solution NaCl 9 g/L
(mL)
réactif (mL)
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Absorbance lue
0,002
0,054
0,11
0,159
0,212
0,276
0,129
0,132
0,003
Absorbance corrigée
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- Expliquez le principe d’un dosage grâce à une gamme étalon et complétez le tableau.
- Expliquez à quoi servent les tubes 1 et 9.
- Tracez un graphe des variations de l’absorbance à 540 nm en fonction de la masse de BSA en mg.
- En déduire la quantité de protéines dans les tubes 7 et 8.
- Quelle est la concentration protéique de la solution inconnue?
Exercice 14 :
La protéine P est composée de 133 acides aminés pour une masse moléculaire de 15 675 Da.
- Pour chacune des 4 représentations ci-dessus (A, B, C, D), indiquez le niveau de structuration correspondant.
- Dans chaque cas, précisez le type de liaisons impliquées.
- Localisez les extrémités amino- et carboxy-terminales sur la figure D3
Sachant que la 1ère hélice  à partir de l’extrémité N-terminale implique 11 acides aminés et connaissant les caractéristiques des
hélices , calculez la longueur de cette hélice .
Exercice 15 :
Une étude de solubilité de deux protéines A et B dans des concentrations croissantes de sulfate d’ammonium permet d’obtenir le
graphique ci-après. Expliquer pourquoi une concentration importante de sulfate d’ammonium entraîne la précipitation des protéines.
Comment peut-on exploiter les résultats du graphique pour séparer les deux protéines A et B ?
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