Compte Rendu TP qPCR - Génie Biologique

Département de Génie Chimique et Biologie Appliquée
Licence Génie Biologique et Biotechnologique
Compte Rendu
TP4 : La qPCR
Année scolaire : 2023-2024
Elaboré par : Groupe2
Adjaratou Dieynaba Kane
Ndèye Coumba Diop
Khadidiatou Bâ
Omar Sy
Léon Bruno Sarr
Saliou Pouye
Seynabou Seye

Encadré par :
Drs Maïmouna Cissokho et Mariama Ngom
Plan
I. Principe de la qPCR
II. Description du gène d’intérêt
III. Objectif du TP
IV. Méthode
V. Traitements
VI. Résultats attendus
VII. Déroulement du TP
VIII. Résultats obtenus
I. Principe de la qPCR
La PCR à temps réel, également connue sous le nom de qPCR (quantitative Polymerase Chain
Reaction), est une technique de biologie moléculaire qui permet l’amplification de l’ADN, et
son suivi, contrairement à la PCR traditionnelle, où les produits sont détectés à la fin de la
réaction. La qPCR quantifie les amplicons au cours du temps via l’émission de fluorescence
qui est directement proportionnelle à leur quantité. Elle détermine aussi le nombre de cycle à
partir duquel la quantité de produit PCR est détectable, c’est-à-dire est au-dessus du bruit de
fond : « Cycle threshold », Ct. Ce Ct dépend de la quantité de matrice initialement présente
dans l’échantillon et peut servir à la quantification relative de l’ADN qu’on a exploité ici.

II. Description du gène d’intérêt
La symbiose actinorhizienne est une association à bénéfice réciproque entre une bactérie du
sol nommée Frankia et des plantes dites actinorhiziennes telles que le filao (Casuarina
equisetifolia). La plante fournit à la bactérie des substrats carbones et celle-ci lui donne de
l’azote assimilable. La mise en place de cette symbiose aboutit à la formation d'un nouvel
organe racinaire appelé nodule, lieu de la fixation biologique de l’azote atmosphérique.
Lors de la mise on place de cette symbiose, l’expression de plusieurs gènes de la plante-hôte
est reprogrammée en réponse à la bactérie Frankia, indiquant ainsi leur implication dans la
formation et le fonctionnement du nodule actinorhizien. Parmi ces gènes, on peut citer CgNIN
qui est un facteur de transcription isolé de la plante Casuarina glauca et qui est exprimé
précocement dans les cellules de la plante infectée par la bactérie. Son expression est également
induite par les signaux diffusibles de Frankia.
III. Objectif du TP
Mesurer l'expression du gène CgNIN chez des plantes de C. glauca en réponse à l’inoculation
avec la souche de Frankia Ccl3 ou le facteur NINA.
IV. Méthode
Utilisation du SYBR Green comme élément fluorescent.
Méthode de quantification relative par comparaison des Ct : mesure des changements dans
l'expression d'un ou de plusieurs gènes entre une condition témoin et d'autres conditions (ex :
traitée et non traitée). On aura besoin pour cela :
Contrôle endogène : gène dont l'expression ne varie pas entre les échantillons testés.
Calibrateur : échantillon témoin auquel tous les autres sont comparés. C'est l'échantillon « non
traité » ou « temps zéro ».
Normalisation par rapport au contrôle endogène pour l’échantillon et pour le standard :
Ct gène cible (échantillon)- Ct contrôle endogène(échantillon) = ΔCt échantillon
Ct gène cible (standard)- Ct contrôle endogène(standard) = ΔCt standard
Normalisation par rapport au standard :
ΔCt échantillon - ΔCt standard = ΔΔCt
Détermination de la variation du nombre de copies du gène cible :
2ΔΔCt
V. Traitements
Les plantes de C.glauca ont été cultivées pendant environ 2 mois dans une chambre de culture.
Les racines des plantes ont été ensuite mises en contact avec le milieu BAP (condition témoin),
la souche de Frankia CcI3 et le facteur NINA. Quelques racines ont été prélevées puis broyées
dans de l’azote liquide avant de passer à l’extraction des ARNs. Si l’on a décidé d’extraire et
de quantifier les ARNs, c’est parce que l’expression d’un gène se fait par transcription donc
formation d’ARNm. Une RT-PCR a été par la suite réalisée pour obtenir des ADNc.

3 conditions étudiées : Contrôle (plantes inoculées avec le milieu BAP). Traitée 1 (plantes
inoculées avec la souche de Frankia Ccl3). Traitée 2 (plantes inoculées avec le facteur NINA).
VI. Résultats attendus
On attend une surexpression du gène CgNIN chez les plantes inoculées avec la souche de
Frankia CcI3 et celles inoculées avec le facteur NINA.
VII. Déroulement
Une plaque de 96 puits a été utilisée de la façon suivante :
UBI
CgNIN
1
2
3
4
5
6
BAP
A
--
--
--
--
--
--
CcI3
B
--
--
--
--
--
--
NINA
C
--
--
--
--
--
--
H2O
D
--
--
--
--
--
--
25
5
0
75
100
0
BAP
NIN
A3

L’expression de chaque gène est étudiée dans les 3 conditions et 3 puits seront réservés à
chaque condition.
Les puits de la ligne D serviront de contrôles négatifs et ne contiendront pas d’ADN.
Préparation des amorces
Des ADNc obtenus, UBI (contrôle endogène) et CgNIN (gène dont on étudie l’expression)
seront ceux à amplifier. On aura ainsi deux paires d’amorces, un Forward (F) et un Reverse (R)
pour chaque gène : F-UBI, R-UBI, F-CgNIN, R-CgNIN. Chaque amorce devra être diluée au
1/50.
Sur glace, nous disposons de 4 tubes Eppendorf (1.5mL) marqués respectivement F-UBI, R-
UBI, F-CgNIN, R-CgNIN dans lesquels on a mis 98µL d’eau avant d’ajouter 2µL de l’amorce
correspondante et de les mélanger au vortex.
Il a été préféré de diluer 2µL dans 98µL au lieu de 1µL dans 49µL pour faciliter le pipetage.
Préparation des ADNc
On a des ADNc provenant de 3 conditions différentes : ADNc-BAP, ADNc-CcI3, ADNc-
NINA et doivent être dilués au 1/10.
27µL d’eau ont été prélevés et mis dans 3 tubes Eppendorf marqués respectivement BAP, CcI3