TP en microbiologie dénombrement des bactéries Microbiologie TP de microbiologie Dr Ziri mohammed abderrahmane 22.04.2022 1 .0 Table des matières Objectifs 3 Introduction 4 I - Méthodologie et mode opératoire 5 1. Préparation des dilutions décimales : .............................................................................................................. 5 2. Résultats et interprétations .............................................................................................................................. 6 3. conclusion ....................................................................................................................................................... 7 3.1. conclusion .................................................................................................................................................................................... 7 Objectifs manipulation et évaluation du nombre de bactéries présentes dans un produit agroalimentaire Dénombrement de la flore mésophile aérobie totale 3 Introduction En tant que bactériologiste, puisque nous vivons dans un monde ou environ sa moitié de biomasse totale est microbiennes dont une grande majorité de cette masse floristique est bactériennes cohabite tous types d'environnement et peuvent affecter les aliments enrichis de matière organique issues des industries agroalimentaires donc les industriels doivent contrôler la qualité microbiologique et la composition des produits alimentaires, pharmaceutiques ou cosmétiques qu'ils fabriquent ils doivent vérifier la stérilité des produits, ou l'absence de bactéries pathogènes, ou encore le taux de bactéries ubiquistes . Ces contrôles microbiologiques sont ainsi réalisés tout au long de la chaîne de fabrication, de la matière première au produit fini, passant par l'environnement de production. Le dénombrement est l'une des solutions pour les industries agroalimentaires, afin de réaliser la sécurité alimentaire, le contrôle de la qualité, ainsi pour les contrôles de stérilité et de la qualité de l'eau ou de l'environnement. 4 Méthodologie et mode opératoire Méthodologie et mode opératoire I 1. Préparation des dilutions décimales : Texte légal : mode d'emploi Carte mentale résume le TP de dénombrement bactériologique On s'arrange pour que cette préparation corresponde à une dilution au 1/10ème de l'aliment. Pour cela, on broie, par exemple, 10 g d'aliment (de densité approximée à 1 g/mL : 10 mL d'aliment a une masse d'environ 10 g) dans 90 mL de diluant (eau peptonée par exemple). Peser 1g de raisin sec. - Faire un broyage dans un mixeur jusqu'à obtenir un mélange homogène : broyat. - Effectuer à partir de ce broyat nos différentes dilutions Dilutions en série ou successives 10-1 , 10-2 , 10-3 , ... Chaque dilution nécessite un tube de diluant de 9 mL et d'une pipette stérile de 1 mL. Ainsi, la réalisation d'une gamme de dilutions jusqu'à 10-5 nécessite : 5 tubes et 5 pipettes. La dilution suivante s'effectue comme la dilution décrite mais en partant du tube de la dilution précédente. Exemple : la dilution 10-5 sera effectuée en prenant 1 mL de la dilution 10-4 préalablement homogénéisée qui sera introduit dans un tube contenant 9 mL de diluant • Un tube de diluant de 9 mL (eau distillée, en général, sauf indication contraire : eau physiologique, eau peptonée, tryptone-sel,...) • Une pipette stérile en plastique de 1 mL (ou pipette automatique P1000 avec cônes stériles) • Un vortex (facultatif) 1.1.2. Réalisation • Homogénéiser la suspension microbienne à prélever (agitation par mouvements circulaires pendant 10 secondes environ ou à l'aide d'un vortex). 5 Résultats et interprétations • Ouvrir et flamber l'ouverture du tube. • Prélever 1 mL de suspension à l'aide de la pipette plastique stérile (ou pipette automatique). Ne pas introduire la pipette dans la suspension de plus de 1 cm. • Flamber et refermer le tube. Il est conseillé de replacer le tube sur le portoir à une place montrant qu'il a déjà été prélevé (en retrait par exemple). • Ouvrir le tube de 9 mL de diluant, flamber l'ouverture, y introduire le volume prélevé (sur la paroi sans toucher le liquide). Éviter tout contact entre la pipette contenant l'inoculum et le diluant stérile. • Flamber et refermer le tube, jeter la pipette souillée dans le bac à eau de Javel. Étalement des dilutions (ensemencement) : il faudrait liquéfier le milieu de culture PCA en bain marie par la suite l'écouler en boites de pétri Couler 15 ml de milieu,homogénéiser parfaitement et laisser solidifier sur une surface froide On étale les dilutions dans différentes boite de pétri contenant le milieu PCA à raison de 2 boites pour chaque dilution PCA : La gélose glucosée à l'extrait de levure appelée par les Anglo-Saxons "Plate Count Agar" est utilisée en bactériologie alimentaire pour le dénombrement des bactéries aérobies dans le lait, les viandes, les produits agroalimentaires fruits sec, les autres produits alimentaires, ainsi que pour l'analyse des produits pharmaceutiques, des produits cosmétiques et de leurs matières premières. Ensemencement en superficie (sur la surface) : - Transférer 1 ml du produit à analyser et de ses dilutions décimales successives dans des boîtes de Pétri stériles déjà écoulées préalablement par le milieu PCA. L'incubation doit se faire à l'étuve à une température de 30 C°pendant 24 heures à 72 heures on peut procéder à la lecture et le dénombrement (calcule de boites). 2. Résultats et interprétations Après la période d'incubation on commence à faire la lecture des boîtiers 6 une boite après incubation de 72 heures prête à la lecture (dénombrement) 2.1 . Selon la norme Française XPV08-102, chaque boite retenue devra contenir au plus 300 colonies et au moins 15 colonies. Le nombre de micro organismes par ml de produit est calculé à partir des boites retenues au niveau de deux dilutions successives à l'aide de la formule suivante: Ensemble de colonie/ D(n1+o.1n2)V=N N : Nombre d'UFC par gramme ou par mL de produit initial. ∑C : somme totale des colonies comptées. n1 : nombre de boites comptées dans la première dilution (la plus faible). n2 : nombre de boites comptées dans la seconde dilution (la plus forte). d : taux de dilution à partir du quel les premiers comptages ont été obtenus. v : le volume de solution déposée. 3. conclusion 3.1. conclusion conclusion Le dénombrement sur milieu PCA reste un test quantitative car il met en évidence l'existence des bactéries aérobies mais sans les identifiées ou les caractérisées. Il faudrait faire d'autres testes qualitatives plus approfondies qui nécessitent l'utilisation des milieux de cultures sélectifs pour pouvoir détecter d'autres bactéries et autres flores bactériennes. Lorsque la charge bactérienne est élevée l'aliment est contaminé il serait automatiquement déconseillé à une éventuelle consommation et il sera nécessaire de le faire passer par un traitement thermique comme la stérilisation ; l'ébullition ou la pasteurisation pour le décontaminer. 7
