Impact de l`IL-1 et du TGF- dans la régulation du
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OUSSAMA RIYAD Impact de l’IL-1 et du TGF- dans la régulation du KGF-1 par les fibroblastes : importance dans l’asthme. Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval Dans le cadre du programme de maitrise en Médecine Expérimentale pour l’obtention du grade de Maitre ès sciences (M.Sc.) DÉPARTEMENT DE MÉDECINE FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC 2012 © Oussama Riyad, 2012 Résumé Le maintien de l’intégrité et de l’homéostasie tissulaire se fait via une régulation et une interaction continue entre les cellules qui constituent le réseau tissulaire. La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ces interactions à l’état normal ou pathologique est essentielle. Dans l’asthme, la fonction des cellules épithéliales bronchique peut être régulée par les fibroblastes adjacents via des voies autocrines et paracrines. Ceci constitue l’unité trophique. Cette unité est réactivée dans l’asthme. Cette réactivation serait impliquée dans le remaniement de la structure bronchique. L’objectif de ce projet était d’étudier les mécanismes impliqués dans ces changements. Notre hypothèse était que dans l’asthme, les changements dans la fonction et le phénotype des fibroblastes maintiennent l’altération de la fonction épithéliale. Plus spécifiquement l’équilibre entre le tandem KGF1/TGF- constitue un facteur important dans le maintien de l’homéostasie épithéliale dans la bronche et la rupture de cet équilibre est un facteur déterminant dans le remodelage bronchique observé dans l’asthme. Le but de mon étude était d’évaluer la régulation du KGF1 par le couple IL1-/ TGF- dans les fibroblastes bronchique provenant de sujet asthmatique léger et de sujet contrôle sain. Oussama Riyad Candidat M. Sc. Jamila Chakir Ph.D. Directrice de recherche TABLE DES MATIERES Page Résumé……………………………………………………………………………………...II Table des matières………………………………………………………………………….III Liste des figures……………………………………………………………………………IV Liste des tableaux………………………………………………………………………….VI Liste des abréviations……………………………………………………………………..VII Chapitre 1 : Introduction 1. Généralités sur l’asthme…………………………………………………………...2 2. Asthme et inflammation allergique………………………………………………..7 3. Asthme et remodelage bronchique……………………………………………….10 4. Rôle de l’épithélium bronchique dans l’asthme………………………………….13 5. Rôle des fibroblastes bronchique dans l’asthme…………………………………15 6. Notion d’unité trophique epithelium-mesenchyme………………………………17 7. Facteurs de croissances…………………………………………………………..19 7.1. Facteur de croissance transformant (TGF-…………………………………. 19 7.2 La famille des FGF et FGFR…………………………………………………...24 7.2.1. Facteur de croissance des Kératinocytes (KGF-1) : FGF-7………………….27 7.2.1 Fonctions du KGF-1………………………………………………………….29 7.2.3. Etudes de souris KO pour le KGF-1 et le KGFR……………………………30 8. Les Cytokines…………………………………………………………………….31 8.1. L’interleukine 1 (IL1 )……………………………………………………..31 : 9. Modulation du KGF-1…………………………………………………………...35 9.1. Effet du TGF-………………………………………………………………...35 9.2. Effet des Protéines de la matrice extracellulaire……………………………….37 9.3. Rôle de l’ miRNA-155………………………………………………………....39 Chapitre 2 : Hypothèses et objectifs de l’étude……………………………………………40 Chapitre 3 : Matériels et méthodes………………………………………………………...44 1. Culture des fibroblastes bronchiques……………………………………………..45 2. Extraction et dosage des ARNs…………………………………………………..45 3. Reverse Transcriptase Polymérase Chain Réaction (RT-PCR)…………………..46 4. Polymérase Chain Réaction en temps réel (PCRtr)………………………………46 5. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Elisa)…………………………………..48 6. Analyses statistiques……………………………………………………………...48 Chapitre 4 : Résultats……………………………………………………………………….49 1- Expression de l’ARNm du KGF-1 dans les fibroblastes………………………………….50 2- Expression de la protéine du KGF-1 dans les fibroblastes………………………………..51 3-Effet de l’IL-1 sur l’expression de l’ARNm du KGF-1 dans les fibroblastes……………52 4- Expression du récepteur activateur de l’IL-1 dans les fibroblastes………………………54 5- Effet de l’IL-1 sur l’expression de la protéine du KGF-1 dans les fibroblastes…………55 6- Effet du TGF-sur l’expression de l’ARNm du KGF-1 dans les fibroblastes…………...57 7- Effet du TGF- sur l’expression de l’ARNm de l’IL1R1 dans les fibroblastes…………..59 8- Effet du TGF- sur l’expression de l’ARNm de l’IL1R1 dans les fibroblastes…………..60 9- Effet du TGF-sur l’expression de l’ARNm de l’IL-1 dans les fibroblastes……………62 Chapitre 5 : Discussion……………………………………………………………………...63 Références …………………………………………………………………………………..69 LISTE DES FIGURES Page Figure 1 : sections histologiques de muqueuses bronchiques normales et asthmatiques……..4 Figure 2 : Facteurs influençant l’équilibre entre une réponse immunitaire Type Th1 ou Th2..8 Figure 3 : Caractéristiques histopathologiques du remodelage bronchique dans l’asthme….11 Figure 4: l’interaction bidirectionnelle entre l’épithélium bronchique et les cellules du Mésenchyme……………………………………………………………………….18 Figure 5 : Effet pleotropique du TGF- Figure 6 : Voie de signalisation du TGF-…………………………………………………..22 Figure 7 : schéma représentant la structure des FGFRs……………………………………..25 Figure 8 : Epissage alternatif responsable de la création des isoforms FGFRIIIb et FGFRIIIc……………………………………………………………28 Figure 9 : voie de signalisation de l’IL1 Figure 10 : Régulation de l’activité de l’IL1 par l’IL1Ra, l’IL1R2 et par l’association de l’ILR2 et l’IL1RAcP…………………………………………………………… 34 Figure 11 : l’interaction bidirectionnelle de l’unité trophique epithelio-mesenchymale au niveau de la peau………………….. ………………………………………... 36 Figure 12 : le mode d’action de la protéine FGFBP…………………..…………………......38 Figure 13 : séquences des amorces utilisées pour les RT-PCR……………………………...47 Figure 14 : Expression du KGF-1 (ARNm) dans les fibroblastes bronchiques……………...50 Figure 15 : Expression du KGF-1 (Protéine) dans les fibroblastes bronchiques…………….51 Figure 16: Effet de l’IL-1 sur l’expression du KGF-1 (ARNm) dans les fibroblastes……..53 Figure 17: Expression de l’IL1R1 (ARNm) dans les fibroblastes bronchiques……………..54 Figure 18 : Effet de l’IL-1 sur l’expression de la protéine du KGF-1……………………..56 Figure 19: Effet du TGF- sur l’expression de l’ARNm du KGF-1 ………………………. 58 Figure 20: Effet du TGF- sur l’expression de la protéine du KGF-1 …………………….. 58 Figure 21: Effet du TGF- sur l’expression de l’IL1R1 dans les fibroblastes ……………...59 Figure 22: Expression de l’IL1RA/IL1R2 (ARNm) dans les fibroblastes ………………….61 Figure 23: Effet du TGF- sur l’expression de l’IL1RA dans les fibroblastes ……………..61 Figure 24: Effet du TGF- sur l’expression de l’IL-1 dans les fibroblastes ………………62 Liste des TABLEAUX Page Tableau 1 : Prévalence de l'asthme chez les enfants âgés de 0 à 11 ans……………………...3 LISTE DES ABBREVIATIONS ADN : Acide désoxyribonucléique ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire ARN : Acide ribonucléique ARNm : Acide ribonucléique messager AP-1 : Activateur de protéines BMP : Bone morphogenetic protein DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium dNTP : Désoxyribonucléotide triphosphate ECM : Matrice extracellulaire ECP : Eosinophil cationic protein EGF : Epidermal Growth Factor EGFR : Epidermal growth factor receptor ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent Assay EMTU : Unité trophique épithélium-mésenchyme FBS : Fetal Bovine Serum FEV1 : Forced Expiratory Volume in 1 second FGF : Fibroblasts Growth Factor FGF-BP : The Fibroblast Growth Factor-binding Protein HP : Heparin GAPDH : Glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase GM-CSF : Granulocyte macrophage-colony stimulating factor HSPG : Heparan Sulfate Proteoglycan ICAM-1 : Inter-Cellular Adhesion Molecule 1 Ig : Immunoglobuline IL-1Interleukine IL-1Ra : IL-1 Receptor Antagonist IPF : Idiopathic Pulmonary Fibrosis IRAK-I : Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 kDa : Kilodalton KGF : Keratinocyte Growth Factor KO : Knockout MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase MBP : Eosinophil granule major basic protein MCP-1 : Monocyte chemotactic protein 1 MMP : Matrice Metalloproteinase MYD88 : Myeloid differentiation primary response gene (88) NF-B : Nuclear Factor-B PAF : Platelet-activating Factor PDGF-BB : Platelet-derived Growth Factor (polypeptide B-chains) PGE2 : Prostaglandine E2 PI3K : Phosphoinositide-3 kinase PKC : Protéine Kinase C P21 : cyclin-dependent kinase inhibitor 1 RANTES : regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted RIS : RNA-Induced Silencing Complex RT-PCR : Reverse Transcriptase - polymerase Chain Reaction STAT : Signal Transducer and Activators of Transcription TAB2 : TAK1 binding protein 2 TGF- : Transforming growth factor TIMP : Tissue Inhibitor of Metalloproteinases TNF : Tumor Necrosis Factor Tollip : Toll interacting protein TRAF-6 : TNF receptor associated factor 6 TSLP : Thymic Stromal Lymphopoietin VCAM-1 : Vascular Cell Adhesion Molecule 1 VEGF : Vascular endothelial growth factor SMA : α-smooth muscle actin CHAPITRE 1 INTRODUCTION 1. Généralités sur l’asthme : L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des voix aériennes. Touchant 5 à 10 % de la population mondiale, cette maladie affecte toutes les classes sociales et tous les pays, à différents degrés (1) . Elle est l’une des maladies chroniques les plus courantes au Canada. L’asthme peut apparaître à tout âge et son évolution peut varier d’une personne à l’autre. La prévalence de l’asthme ne cesse d’augmenter au Canada, Statistique Canada estimant que 13% des enfants entre 0 à 11 ans ont été diagnostiqués asthmatiques (Tableau 1). Il est important de souligner que les garçons sont significativement plus susceptibles d’être déclarés asthmatiques que les filles (16% des garçons versus 11% des filles) (2). La physiopathologie de l’asthme est complexe et encore mal définie, ce qui rend difficile la prise en charge de cette maladie. Dans l’asthme le désordre de la fonction pulmonaire se manifeste souvent par (3): 1- L’hyperréactivité bronchique entrainant un rétrécissement du diamètre bronchique. 2- La limitation du débit pulmonaire, causée par plusieurs facteurs dont la bronchoconstriction aigüe, l’épaississement de la paroi bronchique, l’augmentation de la sécrétion du mucus bronchique et le remodelage bronchique (Figure 1). 3- L’augmentation de la toux et de l’oppression thoracique suite à une stimulation neuronale. L’intensité, la durée et la fréquence de ces symptômes donnent une idée sur le degré de sévérité de la maladie. Les études épidémiologiques montrent que la susceptibilité individuelle à l’asthme est due en grande partie à l’interaction entre les facteurs génétiques et les facteurs environnementaux (4) . D’ailleurs, il existe de nombreux facteurs qui augmentent le risque de développer cette maladie. Ces facteurs de risque peuvent être classés en trois catégories : Premièrement, les facteurs de prédisposition regroupant l’atopie, l’influence du sexe et de la race et les prédispositions génétiques. L’atopie est l’aptitude de certain patient à produire une quantité anormalement élevé d’anticorps IgE sérique en réponse à une exposition à des allergènes environnementaux ainsi qu’une réponse exagérée cutanées (5) dans les tests d’allergies . Malgré que l’atopie concerne seulement une fraction de sujets asthmatiques elle représente le facteur le plus important des facteurs prédisposant, en effet la prévalence de l’asthme augmente avec le taux d’IgE(5). Tableau 1 : Prévalence de l'asthme chez les enfants âgés de 0 à 11 ans, Canada, territoires non compris, 1994-1995 à 2000-2001. Cette étude fait état d’une hausse significative de la prévalence des diagnostics d’asthme, mais seulement pour les enfants présentant des symptômes légers. En dépit de cette augmentation de l’asthme chez les enfants, la prévalence des crises d’asthme a diminué. Figure 1 : sections histologiques de muqueuses bronchiques normales (A) et asthmatiques (B). Comparé aux sujets normaux, les sujets asthmatiques présentent un épaississement de la membrane basale, une desquamation de l’épithélium bronchique ainsi qu’une infiltration de cellules inflammatoires. (Busse WW Lemanske RF Jr. 2001. Asthma. N Engl J Med. 344 :350-62 (5)) Les prédispositions d’ordre génétique (inné) liées à l’interaction de plusieurs gènes situés sur des chromosomes différents, comme par exemple les gènes des cytokines pro inflammatoires (IL13) localisés sur le chromosome 5 et les gènes d’atopie sur le chromosome 11(6, 7). Le sexe et la race ont une influence sur l’asthme, en effet l’asthme de l’enfant est plus fréquent chez les garçons que chez les filles et la prévalence de la maladie est élevée dans certaines populations que d’autre(8). Deuxièmement, les facteurs causals dont font partie les allergènes inhalés domestiques (acariens, poils d’animaux) et d’extérieur (pollens, moisissures), la fumée de cigarette (passive ou active), les polluants atmosphériques et les infections respiratoires. Troisièmement, les facteurs déclenchant, provoquant l’asthme en induisant une inflammation bronchique (telles les infections virales) ou une hyperréactivité bronchique (tel l’air froid, les changements de température). On distingue différents Types d'asthme : l'asthme allergique, l’asthme non allergique et l’asthme professionnel. L’asthme allergique est le type d’asthme le plus fréquent. Il est associé à un déclenchement de l’inflammation bronchique suite à une réponse aux allergènes environnementaux. L’asthme non allergique et quand à lui déclenché par de nombreux stimuli comme l'effort (asthme lié à l’exercice physique), le froid ou encore des médicaments (asthme sensible à l'aspirine). L’asthme professionnel est caractérisé par une obstruction bronchique causée par des stimuli spécifiques sensibilisant (isocyanates, désinfectant, formaldéhyde), présents uniquement dans un environnement professionnel (milieu du travail). Il existe quatre classes d’asthme basées sur la sévérité des symptômes et l’intensité de l’inflammation bronchique à l’origine des crises (9). 1- L’asthme léger intermittent dont les symptômes sont observés au maximum 2 fois par semaine avec des sujets ayant un VEMS supérieur ou égale à 80%. 2- L’asthme léger persistant dont les symptômes sont observés plus que deux fois par semaine mais moins d’une fois par jour. Affectant ainsi l’activité et la qualité du sommeil des patients ou Le VEMS est entre 60 et 80%. 3- L’asthme modéré persistant dont les symptômes sont observés plus d’une fois par jour. 4- L’asthme sévère persistant dont les symptômes sont permanents avec des aggravations fréquentes. L’activité physique de ses sujets est limitée et ils ont un VEMS inferieur à 60%. 2. Asthme et inflammation allergique : L’asthme peut être décrit comme un état inflammatoire chronique des voies respiratoires caractérisé par une infiltration de cellules immunitaires au niveau de la muqueuse bronchique. Nous trouvons principalement des éosinophiles, des lymphocytes T et des mastocytes (10) . Cette inflammation est responsable en partie des dysfonctions pulmonaires observées dans l’asthme, notamment l’hyperréactivité bronchique, la limitation des voies respiratoires, ainsi que la présence d’œdème dans les voies respiratoires (11). Suite à une exposition allergique, l’allergène est capté par les cellules dendritiques qui sont des cellules présentatrices d’antigène. Ces cellules migrent vers les ganglions lymphatiques, puis présentent l’antigène aux lymphocytes T helper. Sous l’influence du microenvironnement local qui favorise le développement d’une réponse immunitaire type Th2, ces cellules s’activeront, se différencieront et sécréteront un ensemble de cytokines et chimiokines, qui participent directement à la propagation de l’inflammation observée dans l’asthme. Des études ont montré l’existence accrue de cytokines et chimiokines dans le lavage broncho alvéolaires de sujets asthmatiques (12) . Ces derniers montrent également une forte concentration de cytokines type Th2 tels que l’interleukine -4, -5, -6 et -13 par apport aux cytokines type Th1 tels l’interféron-Y et l’IL-2 (13) . Ce déséquilibre dans la balance entre les lymphocytes Th1 et Th2 aurait un rôle clé dans le développement de l’asthme (Figure 2). En effet, l’ensemble des cytokines et chimiokines libérées par les lymphocytes Th2 sont impliquées dans l’activation et le recrutement des éosinophiles, ainsi que la production des anticorps IgE par les lymphocytes B (14, 15). En effet la sécrétion de l’IL-5 stimule la libération des éosinophiles dans la circulation et prolongent leur survies. D’ailleurs il y a une corrélation directe entre la concentration d’IL-5 et le degré des éosinophiles dans les voies respiratoires en réponse à un allergène (16) . La sécrétion de chimiokines, comme RANTES (la chimiokine régulé à l'activation des cellules T normales exprimées et sécrétées) et l’éotaxins ont un rôle clé dans la délivrance des éosinophiles au niveau des voies respiratoires dans l’asthme (17). La production d’IgE dépend également de l’activation des Lymphocytes B par l’IL-4 et l’IL13(18). Les éosinophiles jouent un rôle très important dans la physiopathologie de l’asthme, car ils sont présents dans le liquide broncho alvéolaire de sujets asthmatiques. De plus, il y a une corrélation entre leur nombre et la sévérité de la maladie (19) . Les éosinophiles sont des cellules dont le cytoplasme contient des granules remplis de protéines toxiques comme par exemple la protéine basique Majeure (MBP) et la protéine cationique (ECP) (20). Les Figure 2 : Facteurs influençant l’équilibre entre une réponse immunitaire de Type Th1 ou Th2. La théorie de l’hygiène stipule qu’une faible activation du système immunitaire pendant les premières années de la vie mènerait à une déviation de la réponse immunitaire vers un profil type Th2, et au développement de l’asthme. (Busse WW Lemanske RF Jr. 2001. Asthma. N Engl J Med. 344 :350-62 (5)) éosinophiles libèrent également des enzymes et des radicaux libres ainsi que le leucotriene C4 et le facteur activant les plaquettes (PAF) (21) . Suite à leur libération, ces médiateurs sont responsables des différentes lésions de l’épithélium bronchique qui précipite la desquamation des cellules épithéliales observée dans les biopsies bronchiques de sujets asthmatiques (22) . Les produits secrétés par les éosinophiles (leucotriene C4) sont également responsables de l’activation et la contraction du muscle lisse bronchique (23). Une étude a montré que le fait d’utiliser des anticorps anti-IL5, afin de bloquer le recrutement des éosinophiles au niveau des voies aériennes, induit une diminution d’éosinophiles, de la production de protéines de la matrice extracellulaire (24). Le recrutement et l’infiltration des cellules inflammatoires, plus particulièrement les éosinophiles et les lymphocytes T, semblent jouer un rôle clé dans la pathophysiologie de l’asthme en provoquant la propagation de l’état inflammatoire ainsi que les lésions de l’épithélium bronchique observées dans l’asthme. 3. Asthme et remodelage bronchique : En plus du processus inflammatoire, l’asthme est souvent accompagné d’un ensemble de changement morphologique qu’on appelle remodelage bronchique (25, 26) . L’analyse histo- pathologique de biopsies bronchiques effectuées sur des personnes souffrant d’asthme, montre plusieurs éléments caractéristiques (Figure 3) : la desquamation de l'épithélium bronchique, l'épaississement de la membrane basale, l'hypertrophie et l'hyperplasie des cellules musculaires lisses, le dépôt de protéines de la matrice extracellulaire notamment le collagène I, III et V, la ténascine et la fibronectine au niveau de la membrane basale (accompagnée d’une fibrose sous-épithéliale), et l’hyperplasie des myo-fibroblastes et des fibroblastes (26). Ce remodelage a été considéré comme étant le produit d’un état inflammatoire persistant des voies aériennes. Cependant, il a été observé dans la morphogenèse du poumon pendant le développement fœtal et également pendant la réparation des dommages de l’épithélium bronchique causés par différents facteurs tels les virus, les allergènes à activité protéolytique, la fumée de cigarette et les produits chimiques) (27) . De plus, plusieurs équipes ont révélé la présence d’une restructuration et d’un remodelage des tissus avant même l’apparition des symptômes de l’asthme sur des biopsies bronchiques de jeunes enfants (28) . Ce qui pourrait indiquer que ce processus commence à un stade précoce du développement de la maladie et qu’il pourrait être impliqué dans l’établissement et le maintien de l’inflammation. Il a été proposé qu’un déséquilibre dans les processus qui contrôlent la survie, la prolifération et l’apoptose des cellules impliquées dans le remodelage bronchique (notamment les éosinophiles, les cellules épithéliales, les cellules musculaires lisses et les fibroblastes) puisse favoriser le maintien de cet état de remodelage dans l’asthme (29) . En effet, un excès d’apoptose, associé à un défaut de prolifération des cellules épithéliales bronchiques, pourrait favoriser un déficit de réparation épithéliale, ce qui provoquerait une absence de protection des tissus sous épithéliales, induisant par la suite des lésions tissulaires et un état inflammatoire. A l’inverse une réponse proliférative importante, associée à un défaut d’apoptose en l’occurrence des fibroblastes et des cellules musculaires lisses, pourrait être à l’origine de la fibrose sous-épithéliale et l’hyperplasie des cellules musculaires lisses(30). Figure 3 : Caractéristiques histopathologiques du remodelage bronchique dans l’asthme. En (A) biopsie effectuée sur le sujet sain, on note que l’épithélium est intact, absence d’infiltrat de cellules inflammatoires au niveau de la muqueuse bronchique, absence de fibrose sous-épithéliale. Sur les biopsies bronchiques de patients asthmatiques (B-E), on note des lésions au niveau de l’épithélium ainsi qu’un épaississement de la membrane basale. On note également une hypertrophie et hyperplasie des cellules musculaires, et une infiltration de la muqueuse bronchique par les cellules inflammatoires, les fibroblastes et les myofibroblastes source de collagène. (Laurent Benayoun et Marina Pretolani. Le remodelage bronchique dans l’asthme : mécanismes et enjeux thérapeutiques. Médecine sciences, vol. 19, n° 3, 2003, p. 319-326) Deux interventions récentes ont montré que l’utilisation des corticostéroïdes (CS) inhalés chez des enfants n’a pas d’effet ni sur l’épaississement de la membrane basale ni sur le déclin de la fonction respiratoire chez ces dernier (31, 32) . De plus l’utilisation de doses élevées de fluticasone pendant 8 semaines réduit l'inflammation bronchique, mais n’a pas d’effet sur le dépôt de collagène sous-épithélial (33). La prise de CS par voie orale n'a pas diminué le facteur de croissance transformant (TGF-) et les collagènes de types I et III dans l'asthme modéré et sévère (34). Cependant d’autres études montrent que les CS ont un effet antiprolifératifs sur le muscle lisse (ASM) (35) ainsi qu’un effet anti-apoptotique sur les cellules épithéliales issus de sujet asthmatiques (36) et suggèrent un effet sur la fibrose sous épithéliales (37) . La contradiction de ces résultats serrait probablement lié à la variation de la dose des CS utilisée ainsi qu’à la variabilité de la durée du traitement. Toute fois la dose des CS ne peut pas expliquer l’ambivalence de ces études, en effet il existe des patients asthmatiques qui sont cliniquement insensibles au traitement (38) malgré l’utilisation de forte dose de CS. Le fait de considérer le remodelage bronchique comme un processus indépendant, non secondaire à l’inflammation bronchique expliquerait les résultats des CS sur la fonction respiratoire (39) des patients asthmatiques. Suite aux faibles preuves de l’effet thérapeutiques des Corticostéroïdes sur le processus déterminant la progression de l’asthme d’un état initiale intermittent vers un état chronique, les CS sont donc utilisés comme thérapie contre l’état inflammatoire, leur utilisation prolongée supprime les symptômes liés à l’inflammation. D’ailleurs jusqu'à présent il n’y a pas de traitement ou de médication efficace afin de prévenir ou renverser le remodelage bronchique. 4. Rôle de l’épithélium bronchique dans l’asthme : Le dommage de l'épithélium bronchique constitue une des principales caractéristiques pathophysiologiques de l'asthme (40) . En effet, l’épithélium normal a une structure stratifiée, constituée d’une couche de cellules prismatiques (formée de cellules ciliées et sécrétrices) qui repose sur une couche de cellules basales. L’intégrité de cette structure est maintenue via les interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire. Cela implique l’intervention de protéines d’adhésion, des jonctions serrées, des desmosomes et des hemidesmosomes. L’épithélium assure la protection des muqueuses sous-jacentes de l’environnement externe, par sécrétion du mucus ou par interaction avec le système immunitaire adaptatif, ou en jouant un rôle de barrière dynamique, empêchant ainsi l’entrée des virus et des produits toxiques inhalés (41, 42) . L’épithélium contribue également au processus de réparation visant à la reépithélialisation des surfaces bronchiques dénudées suite à une lésion. Ceci est une étape essentielle à la restauration de l’architecture et la fonction des tissus (43) . En effet, après le détachement des cellules épithéliales, ces dernières migrent vers le point de lésion. Pour ce faire, les cellules épithéliales avoisinant la lésion, libèrent un ensemble de protéines de la matrice extracellulaire (ex : fibronectine) ainsi qu’un ensemble de facteurs chimiotactiques pour attirer les cellules épithéliales. Par la suite, les nouvelles cellules adhéreront et proliféreront grâce à la matrice extracellulaire avoisinant le site de la lésion. Il est évident que les cellules épithéliales bronchiques sont les premières cellules exposées à l’allergène inhalé. Suite à cette interaction, les cellules épithéliales seront activées et participeront à l’induction de la réponse inflammatoire allergique, en libérant un ensemble de facteurs comme l’IL-1, l’IL-8, l’IL-6, l’IL-5, l’éotaxine et la lymphopoietine stromale thymique (TSLP) et RANTES (44). Une fois libérés, ces facteurs peuvent favoriser la création d’un microenvironnement local propice à l’activation des lymphocytes T (Th2). En effet, il a été montré que l’activation prolongée des cellules épithéliales bronchiques jouait un rôle clé dans la sensibilisation et le développement d’une réponse immunitaire type Th2. De plus, ces cellules jouent un rôle dans le maintien de l’inflammation allergique (45). L’épithélium bronchique de sujets asthmatiques présente des cellules épithéliales qui se détachent en grappes, laissant la couche de cellules basales exposée au milieu externe. Cette desquamation, liée à un clivage au niveau des desmosomes, est corrélée avec le degré d’hyperréactivité bronchique (46) . Montefort et al, a montré une hyperplasie des cellules sécrétrices du mucus, ce qui contribuerait à l’état d’hypersécrétion du mucus observé dans l’asthme (47) . Cet état général des cellules épithéliales pourrait être expliqué par une fragilisation et une sensibilisation de l’épithélium bronchique asthmatique. Assurément, l’épithélium issu des sujets asthmatiques montre une perturbation des jonctions serrées et une diminution d’expression de molécules d’adhésion, expliquant le détachement des cellules et l’augmentation de perméabilité (démontrée par mesure de la résistance trans-épithéliale) (48). Une sensibilité au stress oxydatif est également observée dans l’épithélium asthmatique, dû à un défaut dans les voies anti-oxydatives comme celle de la superoxide dismutase (49, 50). Devalia et al, ont montré que les cellules épithéliales asthmatiques sont plus sensibles au stress oxydatif et plus perméables après exposition aux particules du diesel, sécrétant ainsi plus de cytokine (IL-8, GM-CSF) comparé aux cellules normales (51). Plusieurs évidences montrent que l’épithélium asthmatique présente des signes d’activation accrus dans l’asthme, liés à un état de stress, comme le facteur de transcriptions NF-kB, la voie de STAT-6 et STAT-1 qui jouent des rôles importants dans la voie pro-inflammatoire et le remodelage bronchique (52, 53) . Il y a également une augmentation de la translocation nucléaire de l’inhibiteur du cycle cellulaire le P21waf (qui est corrélé à la sévérité de la maladie) ainsi qu’une réduction du marqueur de prolifération cellulaire le Ki67 (54) . Une augmentation de l’expression de l’EGFR est également observée dans l’épithélium des sujets asthmatiques (55) et cette expression corrèle avec la sévérité de la maladie, mais elle n’est pas modifiée par le traitement aux corticostéroïdes. Cependant, cette expression de l’EGFR n’est pas liée à un niveau de prolifération des cellules épithéliales in vivo (56). Ces évidences montrent qu’il y a, dans l’asthme, une réparation aberrante de l’épithélium bronchique suite aux lésions et aux différents cycles de réparation-dommage liés à l’inflammation. Ce défaut de réparation pourrait être impliqué dans le maintien de l’inflammation bronchique ainsi que dans l’installation d’un état de remodelage observé dans l’asthme. 5. Rôle des fibroblastes bronchique dans l’asthme: Les fibroblastes bronchiques jouent un rôle important dans le poumon. En effet, ils participent à la génération d’un réseau structural, au processus inflammatoire et au remodelage bronchique. Ils assurent leurs fonctions en proliférant et en produisant des médiateurs solubles et des protéines de la matrice extracellulaire (ECM) (57) . En outre, les fibroblastes sont les cellules principales responsables de la synthèse et de la régulation de l’ECM. Une perturbation dans cette fonction provoquer une désorganisation de l’ECM. Une étude effectuée dans notre laboratoire a montré que les fibroblastes asthmatiques subissent des altérations fonctionnelles et phénotypiques qui sont conservées même après plusieurs passages en culture ex vivo. En effet les fibroblastes asthmatiques montrent une grande capacité à contracter le collagène alors qu’ils ont un faible niveau basal de prolifération comparé aux fibroblastes issus de sujets sains (58, 59). Par ailleurs, l’une des caractéristiques de l’asthme est le dépôt de collagène (I, III) interstitiel en dessous de la membrane basale (60) . Ce dépôt est probablement dû aux fibroblastes activés qui acquièrent le phénotype des myofibroblastes (61) . Notons que plusieurs études ont montré (61) une augmentation de l’activité des myofibroblatses sous la membrane basale . Ce phénotype correspond à l’expression de l’actine (SMA) et à l’acquisition du caractère contractile (propre aux cellules musculaire) par les fibroblastes activés, ce qui favoriserait l’augmentation de dépôt des protéines de l’ECM (contraction rapide et soutenue des myofibroblastes). Le traitement d’une culture de fibroblastes avec le TGF- et l’IL4 augmente le niveau d’expression de l’SMA et la synthèse du procollagène III (62) . Il a été montré que le nombre de myofibroblaste corrèle avec le degré de la fibrose sous épithéliale observée dans l’asthme, et que l’augmentation du nombre des myofibroblastes est corrélée avec l’épaississement de la membrane basale ainsi qu’à une augmentation du collagène 1 et 3 (63,64) . En plus de la synthèse protéique, les fibroblastes asthmatiques dégradent moins le collagène comparé aux fibroblastes normaux(65). Ceci est dû à la baisse de la production de la MMP-2 et à une augmentation de la production de la TIMP-2 par les fibroblastes asthmatiques. Les fibroblastes asthmatiques sont également plus sensibles aux facteurs de croissance notamment le TGF- qui provoque une augmentation de la synthèse du procollagène I chez ces derniers, par apport aux fibroblastes issus de sujets sains (66). Une étude effectuée dans un modèle d’allergie chez le rat a montré que le recrutement des fibrocytes CD34+ (expriment l’-SMA et le collagène I) de la circulation vers la membrane basale des voies respiratoires après exposition à un allergène ce qui pourrait être une explication à l’augmentation des myofibroblastes dans ces tissus (67) . De plus une étude sur des biopsies bronchiques de patients asthmatiques montre une augmentation dans le nombre de cellules CD34+/SMA+ et CD34+/procollagène I+ 24h après une stimulation par un allergène (68) . Dans l’asthme, les myofibroblastes peuvent être issus à partir des fibroblastes, grâce à l’effet de stimulation par le TGF-, mais aussi à partir des cellules épithéliales (la transition épithélium mésenchyme) ou encore à partir des cellules musculaires lisses (69). A part leurs rôles dans le dépôt de protéine de la matrice extracellulaire, les fibroblastes peuvent également jouer un rôle dans la réaction inflammatoire. En effet, suite à une stimulation par différents cytokines comme l’IL4, l’IL6 et l’IL13 (libérés par les tissus bronchiques dans l’asthme), les fibroblastes produiront des facteurs comme l’éotaxine ainsi que l’expression d’un ensemble de gènes de chimiokine (par exemple MCP-1), capables d’activer les éosinophiles et de recruter les macrophages ainsi que les basophiles (70) . Les fibroblastes sont également capables de produire une grande panoplie de cytokines comme l’IL8 et le TGF-, des chimiokines et des prostanoïdes par exemple la Prostaglandine E2 (PGE2) qui influenceront le comportement des cellules avoisinantes à la fois inflammatoires et structurales (71). Grâce à la panoplie de cytokines, protéines et facteurs de croissance libérés, les fibroblastes participent activement au maintien de l’état inflammatoire. Par conséquent, elles participent à la fois au recrutement des cellules inflammatoires qui s’infiltrent au niveau de la muqueuse bronchique, et à l’état de remodelage bronchique observé dans l’asthme. En résumé, la plupart des études citées ci-dessus montrent que la structure et la fonction des fibroblastes sont modifiées dans l'asthme. Ceci aurait un effet direct sur le remodelage bronchique et l’inflammation chronique. Nous pouvons en conclure que les fibroblastes jouent un rôle clé dans la pathophysiologie de la maladie. 6. Notion d’unité trophique epithelium-mesenchyme: L'interaction entre cellules épithéliales et fibroblastes sous-jacents joue un rôle important dans la régulation du développement, de la réparation et de l'homéostasie cellulaire. Il a été montré que l'épithélium joue un rôle clé dans la coordination de la réponse au dommage (72). En effet suite à une lésion de l’épithélium bronchique, des stimuli sous forme de molécules pro-inflammatoires, des cytokines et des facteurs de croissance seront libérés et activeront les cellules du mésenchyme sous-jacent, notamment les fibroblastes. Une fois activé les fibroblastes proliférerons et se transformerons en myofibroblastes tout en libérant un ensemble de facteurs de croissance (FGF, KGF, TGF-…) ainsi que des protéines de la matrice extracellulaire essentiels à la migration et à la prolifération des cellules épithéliales conduisant à la réparation de l'épithélium bronchique. Tous ces facteurs de croissance sont impliqués dans le processus de morphogenèse du poumon au cours de l’embryogenèse (73) , et jouent un rôle primordial dans ce processus dans ou à la fois les cellules épithéliales et les celles du mésenchyme sont activées. Cette interaction bidirectionnelle est à la base de l'unité trophique épithélio-mésenchymale (EMTU) (Figure 4). Des anomalies de l’expression et/ou de la fonction de ces facteurs et de leurs récepteurs favoriseraient la persistance des lésions épithéliales, en empêchant le déroulement du processus de réparation menant ainsi à l’apparition du remodelage bronchique. Dans l'asthme, cette interaction entre les deux types cellulaires est perturbée; probablement à cause de l’inflammation et des lésions répétitives subies par l’épithélium. Ainsi, un fonctionnement anormal de cette unité trophique a été proposé pour jouer un rôle central dans la pathophysiologie de l’asthme. On parle alors, d’une réactivation de l’EMTU. Deux hypothèses sont proposées pour expliquer cette réactivation. Soit la EMTU reste active après la naissance soit elle est réactivée chez les individus prédisposés à l’asthme (74). Figure 4: Schéma représentant l’interaction bidirectionnelle entre l’épithélium bronchique et les cellules du mésenchyme sous-jacents, notamment les fibroblastes. Les interactions qui sont à la base de l’unité trophique epithelio-mesenchymale. Adaptée de ‘Stephen T. Holgate, MD, DSc. Epithelium dysfunction in asthma. J Allergy Clin Immunol. 2007;120:1233-44’ 7. Facteurs de croissances : Dans l’asthme, les voies respiratoires montrent des caractéristiques de lésion chronique, à la suite aux dommages. Un ensemble de médiateurs solubles sera libéré par les cellules épithéliales bronchiques (en première ligne) puis par les cellules inflammatoires, dans un microenvironnement local. Ces médiateurs stimulerons les cellules mésenchymateuses, leurs permettant de participer au processus de réparation cellulaire en libérant un ensemble de facteurs de croissance (75) comme par exemple le TGF-, le KGF-1, les FGFs, l’EGF, VEGFs. Facteurs importants pour le remodelage bronchique et la vascularisation. Parmi ces facteurs, je m’intéresserais spécifiquement au TGF- et au KGF-1. 7.1. Facteur de croissance transformant ( TGF- : Le TGF- est un membre de la superfamille des TGF- incluant un large nombre de cytokines, notamment le TGF- avec ses 5 isoformes (TGF-1, 2,3 qui sont exprimés chez les mammifères). Les activines et les protéines morphogénétiques osseuses (BMPs) font également parties de cette superfamille (76). Le TGF-est un facteur de croissance pléïotropique (Figure 5), il contrôle la prolifération, la différenciation cellulaire, et d'autres fonctions dans la plupart des cellules. Il joue un rôle dans l'immunité et le cancer. Le TGF-est produit de façon ubiquitaire par de nombreux types cellulaires (les cellules épithéliales, les cellules mésenchymateuses, les plaquettes, les mononucléaires phagocytes, les mastocytes et les éosinophiles). Le TGFest synthétisées sous forme d’un précurseur qui sera clivé dans le trans Golgi avant sa sécrétion sous forme latente appelée le grand complexe latent du TGF- (LLC) (77) . Ce complexe est formé de trois composants: le TGF-β, une glycoprotéine liant le TGF- latent (LTBP) et un peptide associé à la latence (LAP). La LTBP permet l’interaction avec la matrice extracellulaire et le LAP inhibe la bio-activité du TGF- La libération et l’activation de la forme latente sont des évènements clés dans la régulation de la réponse au TGF-β et nécessite donc l’action de certains enzymes comme la plasmine, les cathepsines, les glycosidases, les métalloprotéinases matricielles (MMP-2, MMP-9) et la thrombospondine qui protéolysent la forme latente(79). Figure 5 : Effet pleïotropique du TGF-. Le TGF- est un facteur clé dans l’asthme, il induit différents effets sur plusieurs types cellulaires. Son effet le plus marquée dans l’asthme est l’induction de fibrose sous épithéliale. (Makinde T, Murphy RF, Agrawal DK. The regulatory role of TGF- in airway remodeling in asthma. Immunol Cell Biol. 2007 Jul;85(5):348-56) Pour induire ses effets, le TGF-peut se lier à trois différents récepteurs transmembranaires que l’on appelle : TGFRTGFRqui font partie de la famille des récepteurs sérine/thréonine kinase (80) En absence de ligand ces récepteurs se trouvent sous forme d’homodimères à la surface cellulaire. Le TGF-β1 se lie au TGF-βR-II permettant le recrutement du TGFRcet hétérodimérisation sera à l’origine de latransphosphorylation du TGFR par le TGF-βR-II. Le récepteur ainsi phosphorylé induira La propagation du signal jusqu’au noyau via la voie des Smads (81) (par formation de complexe avec les protéines Smad 2, Smad 3 et Smad 4). Ce complexe sera transloqué vers le noyau cellulaire, induisant la régulation d’un ensemble de gènes par liaison directe avec l’ADN, en recrutant un ensemble de co-activateurs ou corépresseurs transcriptionnels. D’autres membres de la famille des Smads, par exemple Smad 6 et Smad 7, jouent un rôle inhibiteur (I-Smad) de la voie de signalisation du TGFen se liant au récepteur activé, interférant de la sorte avec Smad2 et Smad3 (82) (Figure 6). Le TGF-régule la croissance, la différentiation cellulaire, le dépôt de protéines de la matrice extra cellulaire ainsi que la réparation des tissus (83) . En outre, le TGF- est capable de stimuler la croissance et l’activation des fibroblastes en induisant la libération de protéines de la matrice extracellulaire. Cependant, pour les cellules épithéliales, le TGF- a un effet plutôt inhibiteur sur la croissance de ces dernières en bloquant les cellules dans la phase G1 du cycle cellulaire (84, 85). Le TGF-est reconnu pour son double effet sur le système immunitaire. Assurément, le TGFest vital pour l’initiation et la résolution de la réponse inflammatoire, grâce à son rôle proinflammatoire et immunosuppresseur (86) . Le TGF- peut agir comme un ligand chimiotactique pour les monocytes, les neutrophiles, les lymphocytes T qui libérant un ensemble de médiateurs inflammatoires comme le TNF et l’IL-1 contribuant à l’amplification de la réponse inflammatoire. Figure 6 : Voie de signalisation du TGF-. Le TGF- est secrété sous forme latente complexé avec la protéine LAP. Son activation nécessite l’intervention de protéases qui va lui permettre de se lier à son récepteur et d’induire ses effets via la voie des Smad. Le TGF- peut également activer des voies indépendantes des Smad comme par exemple la voie des MAPK. (Königshoff M, Kneidinger N, Eickelberg O. TGF- signaling in COPD: deciphering genetic and cellular susceptibilities for future therapeutic regimen. Swiss Med Wkly. 2009 Oct 3;139(39-40):554-63) Le TGF- participe également au processus de congestion microvasculaire, processus associé à l’angiogénèse au niveau des tissus bronchiques. Le TGF- induit son effet en améliorant la production et la sécrétion de plusieurs facteurs pro-angiogénique y compris le facteur de croissance vasculaire endothéliale (VEGF) et d’autres facteurs de croissance antiangiogéniques (87) . D’ailleurs une étude a démontrée l’augmentation de vascularisation au niveau des voies aériennes dans des biopsies bronchiques de patients asthmatiques. L’intérêt pour le TGF-vient du fait que c’est un facteur clé dans l’asthme, jouant un rôle important dans la fibrose sous épithéliale (88) . Le TGF-induit la synthèse du procollagène 1 par les fibroblastes et provoque la transformation des fibroblastes en myofibroblastes, et la transformation des cellules épithéliales en myofibroblastes (transformation épithéliale mésenchymale) (89). Minshall et al a démontré qu’il y a une corrélation entre le niveau d’expression du TGF-la fibrose sous épithéliale et la sévérité de l’asthme (90). Aussi, il a été montré que le TGF-peut inhiber la prolifération des cellules épithéliales par différents mécanismes. Nous avons démontré que les cellules épithéliales issues de sujets asthmatiques prolifèrent moins comparées aux cellules contrôles, et que le TGF-voit son niveau de base augmenté dans le liquide broncho alvéolaire de sujet asthmatique (91, 92) . De plus, les cellules épithéliales asthmatiques produisent plus de TGF-1 actif et latent comparées aux contrôles. Nous avons démontré que le TGF-agit négativement sur la voie de l’EGFR chez ces cellules épithéliales (92) , effet qui pourrait expliquer le défaut de prolifération des cellules épithéliales asthmatiques même si elles sur expriment l’EGFR. Il est donc probable qu’un déséquilibre entre les voies prolifératives et les voies anti prolifératives, comme celles du TGF-pourrait expliquer l'incapacité de l'épithélium asthmatique à se réparer normalement. 7.2 La famille des FGF et FGFR : Les facteurs de croissance fibroblastiques (Fibroblast growth factor) sont des facteurs de croissance polypeptidiques, ayant diverses activités biologiques et divers profiles d'expressions (93). La famille des FGF se compose de 23 membres qui sont désignés de FGF-1 à FGF- 23. Ces membres sont divisés en six sous-familles. La région centrale des FGF se compose de 120-130 acides aminés qui forment 12 feuillets β antiparallèles flanqués par une extrémité amino et carboxy-terminale. La variation dans la séquence primaire de l’extrémité N-terminal et C-terminal des FGF est responsable des différences biologiques entre les ligands (94) . Tous les FGFs, sauf les FGF1, FGF2, FGF9, FGF16 et FGF20, ont un peptide signal. Les FGF9, FGF16 et FGF20 sont sécrétés par la voie de sécrétion classique (réticulum endoplasmique-Golgi), tandis que les sous familles FGF1 et FGF2 sont sécrétées de façon alternative. Les FGF sont exprimés exclusivement durant le développement embryonnaire comme les FGF- (3, 4, 8, 15, 17, 19), alors que d’autres s’expriment à la fois durant le développement embryonnaire et dans le tissu adulte comme les FGF- (1, 2, 5-7, 9-14, 16 18 et 20-23) (95). Il a été rapporté que les FGF régulent des processus biologiques complexes comme le développement embryonnaire, l'angiogénèse, la cicatrisation des plaies, la régénération des nerfs, l’inflammation chroniques et le cancer (96). Ces processus nécessitent la coordination de plusieurs réponses cellulaires comme par exemple : la prolifération, la migration, l'invasion, et la différenciation cellulaire. Toutes ces réponses sont induites par l'interaction des FGF avec leurs récepteurs tyrosine kinase (FGFR), au niveau des cellules cibles. Il existe quatre classes de FGFR (FGFR-1 à FGFR-4) qui partagent des motifs structuraux communs (Figure 7). En effet, ils se composent de trois domaines extracellulaires immunoglobuline-Type (D1-D3), un peptide signal qui permet l’adressage du FGFR à la surface cellulaire, une région acide, un domaine transmembranaire et un domaine tyrosine kinase cytoplasmique. Figure 7 : schéma générale représentant la structure des FGFRs. Incluant les quatre membres FGFR1, FGFR2, FGFR3 et FGFR4. (Galzie Z, Kinsella AR, Smith JA. Fibroblast growth factors and their receptors. Biochem Cell Biol. 1997;75(6):669-85) Les ligands FGF se lient principalement au domaine D2 et D3 des FGFR alors que le domaine D1 et la région acide ont une fonction auto-inhibitrice (97). Il existe plusieurs isoformes des FGFR, certaines générées par un saut d'exon éliminant le domaine D1 et / ou la boîte acide dans les FGFR1-FGFR3, d'autres proviennent à la suite d'épissage alternatif dans la deuxième moitié du domaine D3 des FGFR1-3, ce qui donne à la fois des isoformes : FGFR-1b, 2b et 3b, et les isoformes FGFR-1c, 2c et 3c. Les isoformes b sont localisés principalement au niveau des cellules épithéliales alors que les isoformes c sont présents au niveau des cellules mésenchymateuses (98) . Chaque FGF se lie et active soit un FGFR épithélial ou mésenchymal, à l'exception de FGF1, qui active les deux isoformes à la fois. Contrairement aux autres facteurs de croissance, les FGF ont généralement une région chargée positivement liant l'héparine permettant une forte affinité pour l’heparan-sulfate protéoglycanes (HSPG) (99) disponible dans la matrice extracellulaire (ECM) et à la surface cellulaire proche des récepteurs des FGF. La liaison des FGF et HSPG au domaine extracellulaire du ligand de FGFR induit la dimérisation du récepteur, l'activation et l’autophosphorylation de multiples résidus tyrosine kinase, dans le domaine cytoplasmique du récepteur, suivie d'une cascade de phosphorylations conduisant à l'activation de plusieurs voies de signalisation, tels que les MAPK, PI3K, et PKC (99). L'interaction des FGF avec leurs récepteurs est responsable du trafic cellulaire. En effet, la plupart des FGFs sont importés ou exportés à l’intérieur et à l’extérieur des cellules, et sont internalisés par endocytose dans le cytoplasme complexés avec leurs récepteurs. Les FGFFGFR peuvent translocer dans le noyau cellulaire. L’internalisation et la translocation nucléaire des récepteurs, semble impliquer des voies de signalisation spécifiques et différentes, en effet l’endocytose est un mécanisme dépendant des lipid/caveolin (100) , alors que la translocation implique la présence d’une séquence de localisation dans le noyau (NLS). Cette séquence peut contrecarrer le signal peptide de sécrétion et donc promouvoir une internalisation au lieu d’une sécrétion du FGF. Ce qui est intéressent c’est que la forme secrété et la forme nucléaire d’un même FGF peut avoir des effets opposé sur la prolifération cellulaire (101). La plupart des FGFs agissent sur les cellules ciblent de manière autocrine, paracrine et endocrine (102). 7.2.1. Facteur de croissance des kératinocytes (KGF-1) : FGF-7 Parmi plusieurs facteurs libérés par les fibroblastes pulmonaires, le KGF-1 ou FGF7, membre de la famille des FGF, a été identifié comme facteur mitogène pour de nombreuses cellules épithéliales d’origines diverses (103) . Le KGF-1 est exprimé par une large variété de cellules mésenchymales comme par exemple les fibroblastes dermiques, les cellules endothéliales vasculaires, les cellules musculaires lisses et les lymphocytes Tγδ activées, alors qu’il n’est pas exprimé dans les cellules épithéliales (104) . Son ARNm code pour une protéine pro-KGF qui est clivée pour former la protéine KGF-1 mature de poids moléculaire avoisinant 26-28 KDa. Le KGF-1 active spécifiquement sur son récepteur le KGFR, également désigné comme FGFR2IIIb un des variants d’épissage alternatif du FGFR2 (l’autre isoforme étant le FGFR2IIIc) (105) (Figure 8). La spécificité de la liaison du KGF-1 à son récepteur dépend uniquement de la région d’épissage qui se trouve au niveau de la deuxième moitié du domaine extracellulaire D3 (domaine semblable aux immunoglobulines) proche du domaine transmembranaire, qui est régulé de manière tissue spécifique. En effet, le FGFR2IIIb est présent uniquement au niveau des cellules d’origine épithéliale comme les cellules épithéliales, les hépatocytes, les kératinocytes, les pneumocytes de type II. Appart KGF-1, Le KGFR lie le FGF-1, FGF-3, FGF-10 (KGF2) et le FGF22 (106). Il est évident que cette distribution du KGF-1/KGFR2IIIb laisse penser à un mode d’action paracrin de ce facteur de croissance. Comparé à d’autres FGFs qui peuvent lier plusieurs FGFRs à la fois sur les cellules épithéliales et les cellules mesenchymales, le KGF-1 est un facteur unique qui a un rôle important dans la communication épithélium-mésenchyme (107) , permettant la régulation de la prolifération et la croissance des cellules épithéliales. Figure 8 : Epissage alternatif responsable de la création des isoforms FGFRIIIb et FGFRIIIc. (Eswarakumar VP, Lax I, Schlessinger J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev. 2005 Apr;16(2):139-49) 7.2.1 Fonctions du KGF-1: Le KGF-1 a plusieurs effets sur les cellules épithéliales. Effectivement, son expression durant le développement embryonnaire de la souris suggère un rôle dans la myogenèse et l’interaction épithéliale-mésenchyme (108) régulation du branchement pulmonaire . Le KGF-1/KGFR est également impliqué dans la (109) . Il induit la prolifération, la protection et la survie des cellules épithéliales mais également la prolifération des pneumocytes de type 2 (110, 111). Le KGF-1 a aussi un rôle anti-apoptotique en protégeant les cellules épithéliales pulmonaires par l’inhibition de l’apoptose médiée par le couple Fas/Fas ligand et par augmentation du niveau d’expression de Bcl-2 (qui est un médiateur anti-apoptotique) (112). L’induction significative de l’expression d’ARNm du KGF-1 a été observée suite à des expériences de lésion cutanée. Cette expression est supérieure à ceux d’autres facteurs de croissance notamment le FGF-1, FGF-2 et le FGF-5 (113) . La stimulation d’une blessure avec du KGF-1 accélère la re-épithélialisation et l’épaississement de l’épithélium (114) . L’administration du KGF-1 recombinant a un effet cyto-protecteur sur les cellules épithéliales et augmente la survie dans un modèle animal de fibrose pulmonaire (115, 116). L’expression du KGF est significativement augmentée durant l’inflammation chronique dans de nombreuses maladies (117, 118) comme celle de Crohn, le psoriasis et les maladies parodontales, ce qui suggère que le KGF1 a probablement un rôle dans le maintien d’un état hyper prolifératif des kératinocytes dans ces maladies. Il a été montré que le prétraitement des souris avec du KGF-1 réduit le recrutement des neutrophiles au niveau des muqueuses bronchiques par réduction de l’expression de ICAM-1 VCAM-1 dans les cellules épithéliales bronchiques (119) . Le KGF1 pourrait également avoir un rôle au niveau de la régulation des cytokines inflammatoires, à la fois en modifiant le ratio des cellules Th1/Th2 (120). Toutes ces expériences montrent que le KGF-1 est requis au développement normal, de plus ce dernier a un important effet au niveau des cellules épithéliales à la fois au niveau de la réparation des blessures et dans l’inflammation chronique. 7.2.3. Etudes de souris KO pour le KGF-1 et le KGFR: Les souris déficientes en KGF-1 ne montrent pas de défaut dans la réparation des lésions ni dans la croissance épidermique mais montrent une réduction au niveau de la croissance folliculaire (121) . Alors que les souris déficientes pour le KGFR2IIIb montrent un défaut dans le développement pulmonaire (122) . L’utilisation de dominant négatif du KGFR ciblant les cellules kératinocytes de la peau provoque une atrophie épidermique accompagnée d’un défaut de re-épithélialisation suite à une blessure (123). Ces résultats montrent que le KGF1 et le KGFR joue un rôle important dans la réparation des lésions. Le fait d’avoir des phénotypes différents entre les souris déficientes en KGF qui montrent peu de défaut de fonction par rapport aux souris déficientes pour le KGFR, met en évidence l’existence d’autres ligands qui compenseront l’effet du KGF-1, comme par exemple le FGF10. 8. Les cytokines : Les cytokines sont des médiateurs peptidiques impliqués dans l’inflammation. Elles sont libérées par un ensemble de cellules notamment les cellules inflammatoires, les lymphocytes, les neutrophiles, les éosinophiles mais également les cellules épithéliales (124). Leurs actions se font par l’intermédiaire de leurs récepteurs présent sur les cellules cibles en induisant l’activation des différents facteurs de transcription tels le NF- κB, la voie des STAT et AP1. Les cytokines ont un mode d’action qui peut être paracrine, endocrine, juxtacrine, ou autocrine. Elles ont un large spectre d’activité et peuvent avoir une certaine redondance entre elles. Il est probable que les cytokines jouent un rôle dans la physiopathologie de l’asthme en régulant l’inflammation chronique des voies aériennes (125) . Dans mon projet, je m’intéresse plus spécifiquement à l’interleukine-1 (IL-1 8.1. L’interleukine 1 : (IL-1 L’IL-1 est une cytokine pro-inflammatoire produite par plusieurs types cellulaires (monocytes, macrophages, lymphocytes B, cellules épithéliales, cellules dendritiques). Sa sécrétion représente une des premières réactions de l'organisme suite à une agression. Cette cytokine est produite aux sites inflammatoires et permet la stimulation, la synthèse et la sécrétion de chimiokines et d'autres cytokines (IL-2, IL-4 et IL-6) par les cellules environnantes (126). L’IL-1 permet l'activation du système immunitaire et la prolifération des Kératinocytes et des fibroblastes, et induis ces effets en se liant à son récepteur activateur l’IL-1R1 (127) (Figure 9). L’IL-1 est synthétisé sous forme de protéine mature à partir de son précurseur le pro-IL1 composé 269 acides aminés et de poids moléculaire 31 KDa (128) . En effet, le précurseur de l’IL-1 et clivé par une cystéine protéase menant à un fragment de 153 acides aminés qui correspond à l’IL-1, ce dernier sera exporté dans le milieu extracellulaire (128). Figure 9 : voie de signalisation de l’IL1. (Martin MU, Wesche H. Summary and comparison of the signaling mechanisms of the Toll/interleukin-1 receptor family. Biochim Biophys Acta. 2002 Nov 11;1592(3):265-80). L’IL-1se lie à son récepteur activateur l’IL- 1R1 et forme un complexe de signalisation hétérodimèrique avec l’IL-1RAcP. MyD88 et Tollip viennent s’associer au complexe formé, recrutant par la suite IRAK-1 qui sera autophosphorylé. IRAK-1 lie une protéine adaptatrice TAB2 et se dissocie du complexe récepteur. IRAK-1, probablement sous forme de dimère, induit la dimérisation de TRAF6. Ceci active TRAF6 qui devient ubiquitinylée. Dans cette forme active, TAK1se lie à TAB2 et est activée par la forme polyubiquitinylé de TRAF6 .Cette autophosphorylation active TAK1, qui phosphoryle par la suite les kinases en aval de différentes voies de signalisation. Il existe un antagoniste naturel de l’IL-1 qui s’appelle l’IL-1Ra (129), c’est une protéine de 23 KDa qui est secrétée par la voie classique du réticulum-Golgi. L’IL-1Ra possède 26% d'homologie avec l’IL-1 et il est secrété par plusieurs types cellulaires comme : les monocytes, les Kératinocytes, les cellules épithéliales, et les fibroblastes (130, 131) . L’IL-1Ra agit en liant le récepteur activateur de l’IL-1, et puisqu’il ne possède pas d’activité signalétique, il bloque ainsi la transmission du message à la cellule (Figure 10). L’IL-1 peut se lier à deux types de récepteurs de la famille des immunoglobulines, le récepteur activateur l’IL-1R1 et le récepteur non fonctionnel l’IL-1R2 (récepteur leurre), ainsi qu’avec une protéine accessoire IL-1RAcP (132, 133) . L’IL-1R1 a un poids moléculaire de 80 KDa est exprimé par les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les cellules épithéliales, les fibroblastes, les kératinocytes ainsi que les lymphocytes T. L'IL-1R2 est une glycoprotéine transmembranaire de 68 kDa qui possède un domaine intracellulaire très court comparé à l'IL-lRl, du coup il ne peut pas transmettre de signal intracellulaire (134, 135) . L’IL- 1R2 agit comme un régulateur négatif de la réponse à l'IL-l. L’IL-1R2 est exprimé par les lymphocytes B, les lymphocytes T, les cellules hématopoïétiques, les Kératinocytes, les cellules endothéliales (136). L’IL-1 induit également l’expression d’une panoplie de gènes impliqués dans l’inflammation, ce qui participe au maintien et à l’amplification de l’état inflammatoire. Il induit aussi l’expression de facteurs de croissance comme par exemple le KGF-1, forte expression d’ARN messager et de la protéine du KGF-1 dans des fibroblastes de différentes origines (137, 138) Plusieurs évidences montrent que l’IL-1 contribue directement à la pathologie de l’asthme, notamment l’augmentation du niveau de base d’IL-1 dans le liquide broncho alvéolaire (BAL) de sujets asthmatiques (139, 140, 141). Figure 10 : Régulation de l’activité de l’IL1 par l’IL1Ra, l’IL1R2 et par l’association de l’ILR2 et l’IL1RAcP. (Sims JE, Smith DE. Regulation of interleukin-1 activity is enhanced by cooperation between the interleukin-1 receptor type II and interleukin-1 receptor accessory protein. Eur Cytokine Netw. 2003 Apr-Jun;14(2):77-81) A. IL-1Ra se lie au récepteur activateur et bloque son activation par IL-1 ou IL-1. B. Le récepteur membranaire non activateur IL-1RII lie IL-1 à forte affinité et neutralise son activité. C. Le complexe IL1RII-IL1 peut également lier l’AcP et la rendre moins disponible pour le récepteur activateur. D. La forme sécrété d’IL-1RII (sIL-1RII) lie IL-1 à forte affinité et neutralise son activité. E. sIL-1RII peut former un complexe avec IL-1 et la forme soluble d’AcP (sAcP) et la rendre moins disponible pour le récepteur activateur. F. sIL-1RII et sAcP peuvent également lier IL-1 à forte affinité. 9. Modulation du KGF-1 : Le KGF-1 est modulé positivement par l’IL-1, d’ailleurs une étude a révélé l’existence d’un défaut de production du KGF-1 au niveau des fibroblastes issus des sujets atteins de la fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) (142) . En effet ce défaut de production a été corrélé à un problème dans la voie de signalisation d’IL-1, causé par un déséquilibre dans les facteurs cJun et JunB, facteurs jouant un rôle important dans la régulation du KGF-1 (143) (Figure 11). Ce déséquilibre et dû à un défaut d’expression et d’activation de c-Jun, alors que le niveau de JunB est normal. Sachant que JunB a un rôle inhibiteur de l’expression du KGF-1 alors que c-Jun a un rôle activateur, un équilibre entre ces deux facteurs est essentiel à une bonne régulation du KGF-1. Même si l’IL-1 est un puissant inducteur du KGF-1, il n’est pas le seul régulateur de ce dernier. En effet, l’inhibition de l’IL-1 ne supprime pas entièrement l’expression du KGF-1 au niveau des fibroblastes. De plus, d’autres facteurs ont la capacité d’induire l’expression du KGF-1 comme l’hormone parathroid (PTHrP) ainsi que d’autres cytokines (IL-1, PDGFBB, IL-6) (144,145) . Des études ont également montré que les glucocorticoïdes peuvent aussi réguler négativement l’expression du KGF-1 au cours d’expériences de blessures et de cicatrisation (146) en diminuant le taux de transcription et en déstabilisant l’ARNm du KGF-1. Il a été montré que les récepteurs aux corticoïdes peuvent inhiber la synthèse des facteurs de transcription appartenant à la famille AP-1 notamment c-Jun leurs effets sur l’expression du KGF-1. (147) , ce qui pourrait expliquer 9.1. Effet du TGF- : Le KGF-1 est également modulé par le TGF-. Il a été montré que le TGF- peut inhiber la prolifération des cellules épithéliales en interférant avec la voie de signalisation de l’EGFR (92 ,148) et qu’il peut inhiber l'effet prolifératif du KGF-1 sur des cellules alvéolaires de type 2 (149) . Le TGF- a aussi un effet inhibiteur direct sur l’expression du KGF-1 et ceci requiert la phosphorylation des Smad (facteurs impliqués dans la voie de signalisation du TGF-) et l’activation de la Tyrosine kinase c-Abl (une protéine qui agit dans le noyau pour stimuler l'apoptose cellulaire) (150). Une autre étude a montré que le traitement des cellules musculaires avec du TGF-augmente de 20 fois l’expression de JunB (151) comparé à c-Jun (2,5 fois) donc on pourrait supposer qu’il a un effet similaire sur les fibroblastes bronchiques. Figure 11 : l’interaction bidirectionnelle de l’unité trophique epithelio-mésenchymale au niveau de la peau. Cette interaction implique la sécrétion d’IL1 qui va induire la production du KGF et du GM-CSF par les fibroblastes. (Werner S, Smola H. Paracrine regulation of keratinocyte proliferation and differentiation. Trends Cell Biol. 2001 Apr;11(4):143-6. (116)) 9.2. Effet des Protéines de la matrice extracellulaire : Le KGF-1 peut être régulé par des molécules comme l’héparine (HP) et les HSPGs (Heparan Sulfate Proteoglycans) (152) . Cependant, les études dans ce domaine montrent des résultats contradictoires. Certains résultats montrent que l’HP / HSPGs ne sont pas impliqués dans l’interaction et la formation du complexe KGF-1 / KGFR. Il est donc probable que leur présence pourrait avoir un effet inhibiteur sur la formation du complexe KGF-1 / KGFR par blocage du site de liaison au niveau du récepteur (153) . Alors que d’autres, mentionnent l’implication d’HP HSPGs dans la formation du complexe récepteur, surtout à une faible dose, ce qui augmente l’affinité du KGFR alors qu’à forte dose elle inhibe cette interaction (154) . Une étude intéressante a montrée l’existence d’une corrélation entre l’hyper réactivité bronchique et la production des proteoglycans par les fibroblastes bronchiques issus de sujet sain et asthmatique (155). Le KGF-1 peut également être régulé comme plusieurs membres de la famille des FGF par des protéines extra cellulaires qui ont pour rôle de mobiliser ce dernier à partir de la matriceextracellulaire (156, 157, 158). Pour que le KGF soit accessible pour les cellules épithéliales, deux molécules doivent intervenir : la première c’est l’héparinase qui coupe la liaison du KGF-1 avec les HSPGs et la deuxième est la protéine FGF-BP (the fibroblast growth factor-binding protein) qui sert comme protéine porteuse pour le KGF-1 (Figure 11). Cette dernière est fortement exprimée suite aux dommages des cellules épithéliales et peut lier le KGF-1. A faible dose, le FGF-BP augmente l’affinité du KGFR pour son ligand. FGF-BP peut être régulée positivement par l’EGF et la catenine. Cependant, elle peut être régulée négativement par l’acide rétinoïque (159) . Une étude a montrée que TGF- est également capable d’inhiber cette protéine (160). Figure 12 : schéma montrant le mode d’action de la protéine FGFBP. (Abuharbeid S, Czubayko F, Aigner A. The fibroblast growth factor-binding protein FGF-BP. Int J Biochem Cell Biol. 2006;38(9):1463-8). Dans ce schéma l’FGF-BP (fibroblast growth factor-binding protein) est sécrété par une cellule tumorale, et se lie au FGFs immobilisés au niveau de la matrice extracellulaire de la même cellule ou des cellules voisines. L’FGF-2 est par la suite libéré (sous forme soluble et active) de sa liaison à l’heparan sulfate proteoglycane. Sous sa forme active le FGF-2 peut induire ses effets en se liant à son récepteur membranaire au niveau des cellules cibles (stimulation de la prolifération des cellules tumorale et activation de l’angiogénèse). 9.3. Rôle du miRNA-155 Une étude effectuée sur des fibroblastes pulmonaires a montré que l’IL-1 et le TNF- sont capables d’activer l’expression d’un miR-155 en même temps que l’activation du KGF-1 (161). Les miRNA sont des ARN non codant de 22 nucléotides qui ont comme fonction la régulation négative de l’expression génique (162) . L’miRNA-155 induit ces fonctions en formant un complexe avec RIS (RNA-induced silencing complex) et en guidant ce complexe vers une région de complémentarité 3’UTR d’un ARNm cible. Selon le degré de complémentarité entre l’miRNA et l’ARNm cible, nous pouvons assister à la dégradation ou à l’inhibition de la translation de ce dernier (161) . L’miR-155 est détecté dans différents types cellulaires comme les macrophages, les cellules dendritiques, les fibroblastes synoviaux et les fibroblastes pulmonaires (162) . Parmi plusieurs cibles de ce miRNA-155, il y a le KGF-1 qui est une cible intéressante pouvant faire du miRNA-155 un régulateur crucial du KGF durant la communication épithélium-mésenchyme (161). Dans l’asthme ainsi que dans d’autres maladies où il y a un défaut de prolifération, des cellules épithéliales comme dans la fibrose idiopathique pulmonaire, nous pourrions supposer qu’une dérégulation ou une surexpression de ce miRNA-155 induirait un défaut de production de KGF-1, ce qui pourrait rompre l’équilibre et l’homéostasie des cellules épithéliales. CHAPITRE 2 Hypothèses et objectifs de l’étude Mon projet de recherche tire son origine de plusieurs observations. La première c’est que dans l’asthme notre équipe de recherche a montré que les fibroblastes subissent de nombreuses altérations qui sont maintenus même après plusieurs cycles de culture cellulaire (65) . Par conséquent ces altérations peuvent jouer un rôle clé dans la manifestation de l’asthme. La deuxième observation vient d’une expérience de co-culture de fibroblaste avec des cellules épithéliales. Dans cette expérience où on a mesuré la prolifération des cellules épithéliales, on a remarqué que le fait de mettre des fibroblastes sains dans le système de co-culture favorise le développement et la prolifération des cellules épithéliales normales, alors que le fait de mettre des fibroblastes provenant de sujets asthmatiques réduit la prolifération des cellules épithéliales. Le résultat de cette expérience suggère que les fibroblastes sains sont capable de délivrer un signal qui favorise la prolifération de cellules épithéliales, alors qu’une altération ou absence de ce signale pourrait expliquer le défaut de prolifération des cellules épithéliales. Parmi plusieurs facteurs libérés par les fibroblastes bronchiques en réponse à une stimulation provenant de l’épithélium, le KGF-1 ou FGF7, membre de la famille des FGF, est un acteur unique qui a un rôle important dans la communication épithélium-mésenchyme, permettant la régulation de la prolifération et la croissance des cellules épithéliales. La dernière observation vient du fait que le KGF-1 est plus exprimé dans de nombreuses maladies inflammatoires chroniques idiopathique (IPF) (142) (117, 118) . Cependant, dans la fibrose pulmonaire ou l’altération de la production et de la régulation du KGF-1 laisse penser que probablement ce dernier est impliquée dans le défaut de prolifération des cellules épithéliales observé dans cette maladie. Etant donné l’importance du KGF-1 dans la communication épithélium-mésenchyme et son rôle primordial dans la régulation de la prolifération et la croissance des cellules épithéliales. Nous poserons l’hypothèse selon laquelle une altération ou une dérégulation de ce facteur de croissance serait impliquée dans la rupture de la communication épithélium-fibroblaste et serrais donc impliquée dans le défaut de prolifération des cellules épithéliales (comme c’est le cas des patients IPF). Comme la desquamation des cellules épithéliales est une caractéristique patho-physiologique majeure dans l’asthme, on supposera que le défaut de prolifération et de réparation de l’épithélium bronchique serrait liée à une altération ou à l’absence d’un signal positif libéré par les fibroblastes sous-jacents. Comme le rôle du KGF-1 n’a jamais était évalué dans l’asthme, ça serait intéressant de voir si une dérégulation de ce facteur au niveau des fibroblastes bronchiques issu de sujets asthmatiques serrais impliquée dans le défaut de prolifération de l’épithélium bronchique. Notre équipe a également montré que le TGF- joue un rôle central dans la pathophysiologie de l’asthme. Les fibroblastes d’origine asthmatiques secrètent plus de TGF- actif, et elles expriment plus de récepteur du TGF- que les fibroblastes contrôles. D’autres études ont révélées l’effet inhibiteur du TGF- à la fois sur la production et l’expression du KGF-1 au niveau des fibroblastes. De plus notre équipe a également montré que le TGF- avait un effet inhibiteur sur la prolifération des cellules épithéliale en inhibant la voie de l’EGFR (92) . Donc à partir de ces études on supposera que le TGF- pourrait participer à l’altération et à la dérégulation du KGF-1 dans les fibroblastes asthmatiques ou bien il pourrait agir directement au niveau de la voie de signalisation du KGF-1 dans les cellules épithéliales. Nous émettons l’hypothèse selon laquelle, un dysfonctionnement dans la boucle de régulation de l’unité trophique, plus distinctement au niveau de la fonction des fibroblastes bronchiques, pourrait être à l’origine d’un défaut de prolifération et de réparation de l’épithélium bronchique observé dans l’asthme. Une dérégulation de l’expression et/ou la production du KGF-1, impliquant le couple IL-1/TGF- -1, causerait une expression anormale du KGF par les fibroblastes bronchiques, ce qui pourrait expliquer l’état de l’épithélium bronchique dans l’asthme. Les objectifs de ce projet était de: Déterminer les niveaux de base d'expression du KGF-1 au niveau d’ARN messager et de protéine chez les fibroblastes issus de sujets asthmatiques et de sujets sains. Évaluer l’effet de l’IL-1sur l’expression du KGF-1 au niveau d’ARN messager et de protéine chez fibroblastes issus de sujets asthmatiques et de sujets sains. Évaluer l’expression des récepteurs de l’IL-1au niveaudes fibroblastes issus de sujets asthmatiques et de sujets sains. Étudier l’effet du TGF- sur l’expression du KGF-1 au niveau d’ARN messager et de protéine chez les fibroblastes issus de sujets asthmatiques et de sujets sains. Étudier l’effet du TGF- sur la régulation de l’expression de l’IL-1R1, IL-1Ra, IL- 1R2 chez les fibroblastes issus de sujets asthmatiques et de sujets sains. Étudier l’effet du TGF-sur la régulation de l’expression d’IL-1 au niveau d’ARN messager chez les fibroblastes issus de sujets asthmatiques et de sujets sains CHAPITRE 3 Matériels et méthodes 1. Culture des fibroblastes bronchiques Les fibroblastes primaires sont disponible d ans notre banque cellulaire et ont été isolés à partir de biopsie bronchique de sujets asthmatiques légers et de sujets sains (58) . Les sujets asthmatiques qui remplissent parfaitement les critères de la société thoracique Américaine (163) . (Par exemple: méthacholine PC20 = 8 mg/ml), ont été recrutés à partir de la clinique d’asthme de l’hôpital Laval (Québec, Qc, Canada). Les sujets asthmatiques n’utilisent pas de corticostéroïdes inhalés ou systémiques, ils utilisent seulement des agoniste 2 sur demande, ils ont en moyenne un FEV1 = 85 ± 3.1% et une PC20 = 4.0 ± 2.2 mg/ml. Tous les patients asthmatiques sont atopiques, non fumeurs. Les sujets sains sont non atopiques, non-fumeurs sans antécédent d’asthme ou de maladie systémique (ils ont en moyenne un FEV1 = 98.2 ± 5.1% et une PC20 = 99.46 ± 1.2 mg/ml. L'étude a été approuvée par le Comité d'éthique à l'Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec. Les fibroblastes ont été caractérisés par immunofluorescence et cytométrie de flux par des anticorps spécifiques aux fibroblastes (l’anticorps de souris anti-vimentine, et l’anticorps de souris anti-Ab1 (antigène de fibroblaste Humain)) (Calbiochem, San Diego, CA, USA) (58). Les fibroblastes sont par la suite cultivés dans du milieu DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) supplémenté avec 20 U/ml de pénicillinestreptomycine (Invitrogen), 12,5µg/ml de fungizone (invitrogen) et 10% de sérum de veau fœtal inactivé (FBS, Hyclone, Logan, UT, USA) à 37°C et 5% de CO2 et utilisés à des passages 4 ou 5. Une fois la confluence atteinte, les cellules sont détachées avec de la trypsine à 0,025% pendant 3 minutes à 37°C. Ensuite, les fibroblastes sont transférés dans des plaques de six / douze puits (Corning, Whitby, ON, Canada) à raison de 3x105 / 2,5x105 cellules par puits respectivement et incubées pendant 24 heures pour leur permettre d’adhérer. Les cellules sont par la suite stimulées dans du milieu DMEM 1% sérum, soit avec du TGFperpotechµg/ml à 5 ng/ml, ou avec de l’IL-1perpotech, 1mg/ml à différentes doses (0,01. 0,1. 1. 10. 100 ng/ml) pendant 6h (ARN) ou 24h (surnagent) 2. Extraction et dosage des ARNs L’acide ribonucléique (ARN) cellulaire total est obtenu pas la méthode suivante : les fibroblastes bronchiques ont été lysés au moyen d’un tampon de lyse (RA1) puis, l’extraction d’ARN a été effectuée au moyen de la trousse ‘RNeasy mini Kit’ (Qiagen, Mississauga, ON, Canada) suivant les directives du manufacturier. Les concentrations des ARNs ont été déterminées par fluorescence en utilisant le réactif Ribogreen (Invitrogen, Ontario, Canada) dilué 1/200. 3. Reverse Transcriptase Polymérase Chain Réaction (RT-PCR) L’ADN complémentaire (ADNc) a été obtenue en préparant un mélange réactionnel contenant 500ng d’ARN, 200 U de l’enzyme MMLV-RT (Moloney Murine Leukemia Virus-Reverse Transcriptase, Invitrogen), un tampon de réaction (Fs buffer Invvitrogen) à 1X, des hexameres aléatoires (PDN6 GE) à 0,25µg/µl et des deoxynucleotides triphosphate (dNTPs dEPc GE) à 0,5 mM. Les échantillons ont été préalablement incubés à 65°C pendant 10 minutes avant l’ajout du mélange réactionnel ceci pour linéariser les brins d’ARN. L’ADN complémentaire a été amplifié à 37°C pendant 60 minutes, puis à 65°C pendant 10 minutes pour dénaturer l’enzyme. 4. Polymérase Chain Réaction en temps réel (PCRtr) Les ADNc obtenus ont été amplifiés par PCR en temps réel (PCRtr). Cette dernière a été effectuée sur l’appareil PCR Thermal Cycler, MyCycler C1000 (BioRad Laboratories) dans un volume final de 25µl, contenant les amorces spécifiques soit pour le KGF-1, l’IL1R1, IL1R2, IL1Ra, IL-1 et le GAPDH (Figure 13). Ces amorces sont utilisées à une concentration finale de 400 µM final. Pour les réactions de PCRtr, 25 ng d’ADNc ont été utilisées suivant les conditions suivantes : une dénaturation initiale à 95°C pendant 5 minutes suivie de 40 cycles de 95°C pendant 30 secondes, 56°C et 60°C pendant 30 secondes respectivement pour GAPDH et les autres amorces Utilisées. Puis 72°C durant 60 secondes. Un cycle final d’élongation a été réalisé à 72°C pendant 2 minutes. Quelques produits correspondant aux amplifications du gène du KGF-1 et du GAPDH ont été soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose 1% contenant 1µg/ml de bromure d’ethidium afin de vérifier la correspondance entre la longueur des amplicons et les gènes amplifiés. gènes KGF-1 Séquences R : 5’-TTGTGGCAATCAAAGGGGTG-3’ F : 5’-CCTCCGTTGTGTGTCCATTTAGC-3’ IL-1R1 R : 5’-CTGGCCGGTGACATTACAGAT-3’ F : 5’-AGAGGAAAACAAACCCACAAGG-3’ IL-1Ra R : 5’-CCTTCGTCAGGCATATTGGT-3’ F : 5’-AACAGAAAGCAGGACAAGCG-3’ IL-1R2 R : 5’-TTGCGGGTATGAGATGAACG-3’ F : 5’-TGGCACCTACGTCTGCACTACT-3’ IL-1 R : 5’-CAGAGGTCCAGGTCCTGGAA-3’ F : 5’-GCAATGAGGATGACTTGTTCTTTG-3’ GAPDH R : 5’-CTGAGGGCTGAGATGCCG-3’ F : 5’-ATGCAACGGATTTGGTCGTAT-3’ Figure 13 : séquences des amorces utilisées pour les RT-PCR. Les séquences d’amorces ont été désignées en suivant les étapes suivantes : 1. Recherche de la séquence des gènes à amplifier sur GENBANK. 2. Recherche d’amorces non optimisées et vérification de leurs qualités avec Netprimer. 3. On peut également rechercher des amorces optimisées avec Primer3et PerlPrimer. 4. Analyse de l’alignement des primers choisies avec Blast. 5. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Elisa) Les concentrations du KGF-1 dans les surnagent des fibroblastes stimulés ou pas, avec les différentes concentrations de l’IL1- et du TGF-ont été déterminées à l’aide d’une trousse commerciale Elisa (R&D systems Inc. Minneapolis, MN, USA) suivant les instructions du manufacturier. Les échantillons ont été lus avec le spectrophotomètre (Molecular Devices corp. CA, USA) à une longueur d’ondes de 450 nm avec une correction de 550 nm. 6. Analyses statistiques Les résultats sont présents sous forme de moyenne +- ‘Standard Error of the Mean (SEM)’. Des analyses de variance ‘ANOVA’ à un seuil de significativité de 0,05 ont été effectuées pour comparer les résultats. CHAPITRE 4 Résultats 1- Expression de l’ARNm du KGF-1 dans les fibroblastes Le premier objectif de mon étude était de déterminer le niveau de base d’expression du KGF1 au niveau de l’ARNm dans les fibroblastes normaux versus les fibroblastes asthmatiques. Le niveau de KGF-1 a été évalué par PCR en temps réel. Les fibroblastes provenant de sujets sains et asthmatiques expriment tous les deux l’ARNm du KGF-1. Cependant l’expression de ce dernier est nettement plus importante au niveau des fibroblastes asthmatiques (Figure 14). Il y a donc une surexpression de l’ARNm du KGF-1 au niveau des fibroblastes asthmatiques. Figure 14 : Expression de base du gène du KGF-1. La RT-PCR pour KGF-1 a été réalisée sur des fibroblastes issus de sujets sains (n=5) et de sujets asthmatiques (n=5). La PCR a été analysée et normalisée au GAPDH. *P = 0,0066. 2- Expression de la protéine du KGF-1 dans les fibroblastes D’après les résultats qui découlent de l’analyse par PCR en temps réel, et qui suggèrent clairement une surexpression de l’ARNm du KGF-1 au niveau des fibroblastes issus de sujets asthmatiques, nous nous sommes intéressés à l’évaluation de l’expression au niveau de base de la protéine du KGF-1 à partir de surnagent de cellules en culture. Cette expression a été évaluée par Elisa. Les fibroblastes issus de sujets sains et les fibroblastes issus de sujets asthmatiques, produisent la protéine du KGF-1 au niveau du surnagent cellulaire. Cependant, les fibroblastes normaux produisent de façon significative plus de protéine de KGF-1 que les fibroblastes asthmatiques (Figure 15). Figure 15 : Expression de base de la production de la protéine KGF-1. La production de KGF-1 a été mesurée sur 24h (par Elisa) à partir de surnageant de culture de fibroblastes issus de sujets sains (n=5) et de sujets asthmatiques (n=5). *P = 0,05 3-Effet de l’IL-1 sur l’expression de l’ARNm du KGF-1 dans les fibroblastes Le deuxième objectif de mon étude était d’évaluer la régulation du KGF-1 au niveau de l’ARNm par l’IL-1exogène. L’IL-1 qui est connu comme étant un puissant inducteur de l’expression du KGF-1, au niveau des fibroblastes de différentes origines. Les fibroblastes issus de sujets asthmatiques et sains ont été stimulés durant 6 heures avec différentes doses d’IL-1 de 0,01 à 100 ng/ml. La durée de la stimulation a été déterminée en établissant une cinétique (expression de l’ARNm du KGF-1 en fonction du temps (2 h, 6 h, 8 h, 12 h) au niveau des fibroblastes stimulés avec une dose de 10 ng/ml d’IL-1 (la dose la plus utilisée dans la littérature, qui est également considérée comme une dose physiologique). Le niveau de KGF-1 a été évalué par la suite par PCR en temps réel. Les fibroblastes provenant de sujets sains et asthmatiques répondent parfaitement aux différentes doses d’IL-1 en induisant une augmentation dans l’expression d’ARNm du KGF1, par apport au niveau de base des fibroblastes non stimulés. Néanmoins, ce qui est intéressant c’est que les fibroblastes asthmatiques semblent avoir une meilleure réponse aux différentes doses d’IL-1comparé aux fibroblastes normaux (Figure 16). Figure 16: Expression du gène du KGF-1 sous l’effet d’IL-1. La RT-PCR pour KGF-1 a été réalisée sur des fibroblastes issus de sujets sains (n=6) et de sujets asthmatiques (n=5) et stimulé avec différentes doses d’IL-1 (0,01 à 100 ng/ml). La PCR a été analysée et normalisée au GAPDH et au control non stimulé. *P asthmatiques ≤ 0,005*P normaux ≤ 0,005 4- Expression du récepteur activateur de l’IL-1 dans les fibroblastes D’après nos derniers résultats, nous nous sommes intéressés à l’évaluation de l’expression du récepteur activateur de l’IL-1(IL1R1), pour essayer d’expliquer la différence de réponse qu’on observe entre les fibroblastes issus des sujets asthmatiques et les fibroblastes issus de sujets sains, suite à la stimulation avec l’IL-1. Pour ce faire, le niveau de base d’expression de ce récepteur a été évalué par PCR en temps réel. Les fibroblastes provenant de sujets sains et asthmatiques expriment tout les deux l’ARNm de l’IL1R1. Pourtant, l’expression de ce dernier est nettement plus importante au niveau des fibroblastes asthmatiques (Figure 17). La surexpression de l’ARNm de l’IL1R1 par les fibroblastes asthmatiques suggère donc, une surexpression de ce récepteur au niveau de la surface cellulaire, ce qui pourrait expliquer le niveau de réponse des fibroblastes issus de sujets asthmatiques à l’IL-1 (même à petite dose) par apport aux fibroblastes issus de sujets sains. Figure 17: Expression de base du gène d’IL-1R1. La RT-PCR pour IL-1R1 a été réalisée sur des fibroblastes issus de sujets sains (n=8) et de sujets asthmatiques (n=7). La PCR a été analysée et normalisée au GAPDH. *P = 0,03 5- Effet de l’IL-1 sur l’expression de la protéine du KGF-1 dans les fibroblastes Puisque l’IL-1 a un effet positif sur l’expression de l’ARNm du KGF-1, notamment au niveau des fibroblastes issus des sujets asthmatiques, nous avons évalué l’effet de ce dernier sur la production de la protéine du KGF-1 par les fibroblastes. Cette expression a été évaluée par Elisa. Tout comme ce que nous avons pu constater pour l’ARNm du KGF-1, l’IL-1 a un effet sur l‘augmentation de la sécrétion et la production de la protéine du KGF-1 à la fois au niveau des fibroblastes issus de sujets asthmatiques et les fibroblastes issus de sujets sains. Les fibroblastes issus de sujets sains produisent plus de KGF-1 de base que les fibroblastes issus de sujets asthmatiques. Malgré la différence de réponse à l’IL-1 au niveau de l’ARNm du KGF-1, les fibroblastes asthmatiques ne semblent pas produire plus de KGF-1 que les fibroblastes sains suite à une stimulation avec de l’IL-1 (10 ng/ml). En effet, il n’y a pas de différence significative dans la production du KGF-1 entre les deux phénotypes de fibroblastes (Figure 18). Figure 18 : Expression de la production de la protéine KGF-1 sous l’effet d’IL-1. La production de KGF-1 a été mesurée sur 24h (par Elisa) à partir de surnageant de culture de fibroblastes issus de sujets sains (n=4) et de sujets asthmatiques (n=4) stimulées ou pas avec de l’IL-1 (10ng/ml). *P = 0,03 (asthmatique stimulé Vs non stimulé), *P = 0,01 (normal stimulé Vs non stimulé), *P = 0,04 (asthmatique non stimulé Vs normal non stimulé) 6- Effet du TGF- sur l’expression de l’ARNm du KGF-1 dans les fibroblastes Le troisième objectif de mon projet était d’évaluer la régulation du KGF-1 par le TGF- exogène. Puisque le TGF- joue un rôle clé dans l’asthme, et puisqu’il a plusieurs effets sur les fibroblastes bronchiques, nous avons voulu déterminer s’il avait un effet sur la régulation du KGF-1. L’expression de l’ARNm du KGF-1 a été évaluée par PCR en temps réel, et le niveau de la protéine a été évalué par Elisa. Le TGF- a été utilisé à une dose de 5 ng/ml durant un temps de stimulation de 6 heures (la durée de la stimulation a été déterminée en établissant une cinétique d’expression de l’ARNm du KGF-1 en fonction du temps (2 h, 6 h, 8 h, 12 h) au niveau des fibroblastes stimulés avec une dose de 5 ng/ml de TGF- (la dose la plus utilisée dans la littérature, et également utilisée dans notre laboratoire). TGF- a le même effet inhibiteur sur l’expression de l’ARNm du KGF-1 à la fois au niveau des fibroblastes issus de sujets normaux et au niveau des fibroblastes issus de sujets asthmatiques. Cette inhibition est également observée au niveau de la sécrétion de la protéine du KGF-1 (Figure 19, 20). Figure 19: Expression du gène du KGF-1 sous l’effet de TGF-. La RT-PCR pour KGF-1 a été réalisée sur des fibroblastes issus de sujets sains (n=7) et de sujets asthmatiques (n=5) et stimulé avec une doses de TGF- (5ng/ml). La PCR a été analysée et normalisée au GAPDH et au control non stimulé. *P = 0,0006 (asthmatique stimulé Vs non stimulé), *P = 0,004 (normal stimulé Vs non stimulé), *P = 0,04 (asthmatique non stimulé Vs normal non stimulé) Figure 20: Expression de la production de la protéine KGF-1 sous l’effet TGF- La production de KGF-1 a été mesurée sur 24h (par Elisa) à partir de surnageant de culture de fibroblastes issus de sujets sains (n=4) et de sujets asthmatiques (n=4) stimulées ou pas avec TGF- (10ng/ml). *P = 0,03 (asthmatique stimulé Vs non stimulé), *P = 0,04 (normal stimulé Vs non stimulé), *P = 0,04 (asthmatique non stimulé Vs normal non stimulé) 7- Effet du TGF- sur l’expression de l’ARNm de l’IL-1R1 dans les fibroblastes D’après les résultats qui découlent de l’analyse par PCR en temps réel et par Elisa et qui suggèrent que le TGF- a un effet inhibiteur à la fois sur l’expression de l’ARNm du KGF-1 et sur la production de la protéine. Nous nous sommes intéressés à l’évaluation de l’effet du TGF- sur l’expression du récepteur activateur de l’IL-1pour voir si cela pouvait expliquer les résultats obtenus avec le traitement des fibroblastes avec le TGF-. Ce récepteur qui est surexprimé au niveau des fibroblastes issus de sujets asthmatiques par apport aux fibroblastes issus de sujets sains. Le TGF- n’a pas d’effet sur l’expression du récepteur activateur de l’IL-1. En effet, suite au traitement des fibroblastes avec le TGF- 5 ng/ml, il n’y a pas eu de changement significatif dans l’expression de l’IL1R1 (comparé au niveau de base d’expression en absence de stimulation) (Figure 21). Figure 21: Expression du gène d’IL-1R1 sous l’effet de TGF-. La RT-PCR pour IL-1R1 a été réalisée sur des fibroblastes issus de sujets sains (n=7) et de sujets asthmatiques (n=6) et stimulé avec une doses de TGF- (5ng/ml). La PCR a été analysée et normalisée au GAPDH et au control non stimulé. *P = 0,04 (asthmatique non stimulé Vs normal non stimulé) 8- Effet du TGF- sur l’expression de l’ARNm de l’IL-1RA/IL-1R2 dans les fibroblastes Suite aux derniers résultats qui montrent que le TGF- n’a pas d’effet sur l’expression du récepteur activateur de l’IL-1. Nous nous sommes intéressés à l’effet de ce dernier sur l’expression des récepteurs antagonistes de l’IL-1. Puisque l’IL-1 peut être régulé négativement par d’autres récepteurs comme l’IL-1RA (le récepteur antagoniste) et l’IL-1R2 (le récepteur leurre). Cela serrait peut être un moyen pour l’inhibition de l’expression et la production du KGF-1 par les fibroblastes bronchiques. Pour ce faire nous avons évalué le niveau de base de ces récepteurs au niveau des fibroblastes (Figure 22) puis nous avons évalué l’effet du TGF- sur l’IL-1RA (Figure 23) par PCR en temps réel. Les résultats montrent que les fibroblastes asthmatiques sur-expriment l’ARNm du récepteur antagoniste IL-1RA et de l’IL-1R2 par rapport aux fibroblastes issus de sujets sains. Les résultats montrent également que le TGF- n’a pas d’effet sur l’expression de l’IL-1RA. Figure 22: Expression de base du gène d’IL-1RA/IL-1R2. La RT-PCR pour l’IL-1Ra/IL-1R2 a été réalisée sur des fibroblastes issus de sujets sains (n=7) et de sujets asthmatiques (n=8). La PCR a été analysée et normalisée au GAPDH. *P = 0,01 (IL-1RA : asthmatique non stimulé Vs normal non stimulé) *P = 0,01 (IL-1R2 : asthmatique non stimulé Vs normal non stimulé). Figure 23: Expression du gène d’IL-1RA sous l’effet du TGF-. La RT-PCR pour IL-1RA a été réalisée sur des fibroblastes issus de sujets sains (n=6) et de sujets asthmatiques (n=6) et stimulé avec une doses de TGF- (5ng/ml). La PCR a été analysée et normalisée au GAPDH et au control non stimulé. *P = 0,04 (asthmatique non stimulé Vs normal non stimulé) 9- Effet du TGF- sur l’expression de l’ARNm de l’IL-1 dans les fibroblastes Comme mes résultats montrent que le TGF- n’avait pas d’effet sur l’expression des récepteurs antagonistes de l’IL-1, nous nous sommes intéressés à voir si le TGF- n’avait pas un effet directement sur la production de l’IL-1 par les fibroblastes bronchiques. Mes résultats montrent que le TGF- n’a pas d’effet sur l’expression de l’IL-1 par les fibroblastes bronchiques (Figure 24). Ce qui laisse à penser que probablement le TGF- pouvait agir par d’autres voies de signalisation et pas celle de l’IL-1. Figure 24: Expression du gène d’IL-1 sous l’effet du TGF-. La RT-PCR pour IL-1 a été réalisée sur des fibroblastes issus de sujets sains (n=3) et de sujets asthmatiques (n=3) et stimulé avec une doses de TGF- (5ng/ml). La PCR a été analysée et normalisée au GAPDH et au control non stimulé. CHAPITRE 5 Discussion Etant donné l’importance du KGF-1 dans la communication épithélium-mésenchyme et son rôle primordial dans la régulation de la prolifération et la croissance des cellules épithéliales. Nous nous sommes intéressés à l’étude de ce dernier dans le cadre de l’asthme léger ou la desquamation de l’épithélium constitue une caractéristique patho-physiologique majeure. En posant l’hypothèse qu’un défaut de régulation de ce facteur au niveau des fibroblastes bronchiques (issus de sujets asthmatiques) serrait impliqué dans la rupture de la communication épithélium-fibroblaste observée dans l’asthme, ainsi que dans le défaut de prolifération et de réparation de l’épithélium bronchique. La première étape pour savoir s’il y a un défaut dans la régulation du KGF-1, est de déterminer le niveau de base d’expression du KGF-1 dans les fibroblastes (Figure 14). Le résultat montre que les fibroblastes asthmatiques sur-expriment de façon significative l’ARNm du KGF-1 par rapport aux fibroblastes normaux (résultat qui ne soutient pas notre hypothèse initiale, puisque un défaut de régulation serrais accompagner d’un problème d’expression au niveau de l’ARNm et de la protéine). Suite à ce résultat nous avons décidé d’évaluer par Elisa, le niveau de base de production de la protéine KGF-1 dans les fibroblastes (Figure 15). Comme les fibroblastes asthmatiques sur-expriment l’ARNm du KGF-1 nous nous attendions à ce que le niveau de protéine soit comparable, c'est-à-dire plus élevé chez les fibroblastes asthmatiques versus normaux. Cependant, nous avons obtenu un résultat très intéressant qui montre que les fibroblastes normaux produisent de façon significative plus de protéines KGF-1 que les fibroblastes asthmatiques. Ces résultats suggèrent la présence de mécanismes de régulation post-traductionnels différentiels entre les fibroblastes normaux et asthmatiques. En effet, nous pourrions poser l’hypothèse qu’il y aurait un défaut de production du KGF-1 (baisse de production) au niveau de base, suite à des mécanismes affectant la maturation et de la sécrétion ou bien la disponibilité de la protéine KGF-1. Une implication d’une molécule exprimée ou surexprimée dans les fibroblastes asthmatiques par rapport aux fibroblastes normaux dans ces mécanismes serait fort probable comme par exemple le TGF- qui est connu par ces multitudes d’actions sur les fibroblastes dans l’asthme. Le deuxième objectif était d’évaluer la régulation du KGF-1 (Figure 16) par l’IL- exogène. L’IL-1 est connu comme étant un puissant inducteur du KGF-1, au niveau des fibroblastes de différentes origines. Les résultats de la Figure 16 montrent que les fibroblastes asthmatiques et normaux répondent parfaitement aux différentes doses de l’IL-1 en induisant l’expression de l’ARNm du KGF-1. Voilà pourquoi le résultat montre clairement que la voie de signalisation de l’IL-1 n’est pas impliquée dans le défaut de production du KGF-1 par les fibroblastes asthmatiques. Malgré l’obtention d’une même réponse à l’IL-1 les fibroblastes asthmatiques semblent avoir une meilleure réponse aux différentes doses d’IL-1 par rapport aux fibroblastes normaux. Pour essayer de comprendre cette différence de réponse à l’IL-1 nous avons évalué l’expression du récepteur activateur de l’IL-1 (IL-1R1) au niveau des fibroblastes (Figure 17). Mes résultats montrent que les fibroblastes asthmatiques sur-expriment l’IL-1R1 de façon très significative, ce qui explique leurs capacités à mieux répondre aux différentes doses d’IL1 Suite à ces résultats nous avons décidé d’évaluer par Elisa l’effet de l’IL-1 sur la production du KGF-1 (Figure 18). Nous pouvons en déduire que les fibroblastes asthmatiques semblent avoir une meilleure réponse vis à vis de l’IL-1Nous nous attendions à ce que ces cellules produisent plus de protéine de KGF-1. Toutefois, mes résultats montrent que l’IL-1 a un effet positif sur la sécrétion de KGF-1, à la fois au niveau des fibroblastes normaux et asthmatiques avec une tendance à ce que les fibroblastes asthmatiques produisent moins de KGF-1 que les fibroblastes normaux. Nous pourrions supposer que la production du KGF-1 par les fibroblastes n’est pas à l’origine du défaut de réparation de prolifération des cellules épithéliales. Ceci pourrait être lié à un défaut de régulation, de production de FGF-BP ou de l’Heparinase voir d’autres protéines de la matrice extracellulaire, jouant un rôle dans l’activation ou la séquestration du KGF-1 du milieu, et ainsi jouer sur son accessibilité aux cellules épithéliales. Le troisième objectif de mon projet était de voir si la stimulation des fibroblastes avec du TGF- exogène avait un effet sur l’expression du KGF-1 (Figure 19, 20). Mes résultats montrent que le TGF- a un effet inhibiteur sur l’expression du KGF-1 au niveau de l’ARNm, ce qui est en accord avec les précédentes études concernant l’effet inhibiteur du TGF- sur l’expression du KGF-1. Cette inhibition est également observée au niveau de la sécrétion de la protéine du KGF-1 (Figure 20). Ce résultat est intéressant puisqu’il montre l’effet du TGF- exogène sur l’expression du KGF-1, alors qu’en réalité dans l’asthme, il est bien connu que le TGF- endogène total est actif et fortement exprimé par de nombreux types cellulaires comme les cellules épithéliales et que son récepteur est fortement exprimé au niveau des fibroblastes asthmatiques comparé aux normaux. Il est fort probable que chez les patients asthmatiques, le TGF- inhiberait l’expression et la production du KGF-1. Ceci pourrait participer au défaut de réparation et de prolifération des cellules épithéliales (sans oublier l’effet direct du TGF- sur les cellules épithéliales en inhibant la voie de l’EGF comme cela a déjà été montré dans le laboratoire). Comme nous l’avons précédemment vu dans la figure 17 ; le récepteur activateur de l’IL-1 est surexprimé dans les fibroblastes asthmatiques. Nous avons voulu voir si l’effet inhibiteur du TGF- sur le KGF-1 pourrait éventuellement passer par la régulation négative de ce récepteur (Figure 21), en empêchant ainsi l’action de l’IL-1 sur son récepteur. Mes résultats montrent que le TGF- n’a pas eu d’effet sur l’expression de l’IL-1R1. Il serait probable que le TGF- pourrait agir dans une ou d’autre partie de la voie d’induction, de maturation ou production du KGF-1. L’IL-1 peut se lier à un récepteur antagoniste l’IL-1R2 et il peut être antagonisé par l’IL1RA. Nous pourrions alors voir si l’effet inhibiteur du TGF- passerait par la régulation positive des antagonistes de l’IL-1 : l’IL-1RA/ IL-1R2. Nous avons comparé le niveau d’expression de base des récepteurs entre les fibroblastes asthmatiques et les normaux (Figure 22), nous avons aussi étudié l’effet du TGF- sur ces récepteurs (Figure 23). Les résultats montrent que les fibroblastes asthmatiques sur-expriment l’ARNm du récepteur antagoniste IL-1RA et de l’IL-1R2. Cependant, les niveaux d’expression de ces récepteurs sont assez faibles. Il est probable qu’ils n’aient pas vraiment d’effet sur l’inhibition de l’IL-1 puisque de toute façon les fibroblastes asthmatiques répondent bien aux différentes stimulations de l’IL-1. Cette surexpression de base de l’IL-1R1/RA/R2 peut être interprétée par le fait que l’IL-1 est capable de réguler son propre récepteur activateur ainsi que ses récepteurs antagonistes, comme il a déjà été montré dans une étude sur des cellules endometriales. Dans l’asthme, il y a une production importante de l’IL-1 par de nombreux types cellulaires tels que les cellules immunitaires et épithéliales. Cette différence du niveau d’IL-1 entre sujets asthmatiques et contrôles pourrait expliquer la différence d’expression des récepteurs. Mes résultats montrent également que le TGF- n’a pas d’effet sur l’expression des récepteurs de l’IL-1 ni sur l’expression de l’IL-1 par les fibroblastes (Figure 24). Mes résultats montrent clairement que le TGF- n’est pas impliqué dans le défaut observé de la production du KGF-1, en effet les fibroblastes asthmatiques sur expriment l’ARNm du KGF-1 par apport à la normale, donc si le TGF- était impliquer on aurait dû trouver le résultat inverse. De même que le TGF- n’a pas d’effet sur l’expression des différents récepteurs et antagonistes d’IL-1. Malgré la forte expression de ces derniers par les fibroblastes asthmatiques ils n’ont pas d’effet sur la voie de signalisation d’IL-1, puisque les fibroblastes asthmatiques répondent aux différentes stimulations d’IL-1même les plus faibles. Donc l’IL-1RA et l’IL-1R2 n’ont pas d’effet dans ce défaut de production du KGF-1. Ce qui est intriguant c’est que les fibroblastes asthmatiques sur expriment le récepteur activateur IL-1R1 ce qui laisse penser qu’elles sont prédisposées à réagir à l’IL-1, mais malgré la forte réponse au doses d’IL-1 on n’a pas une forte production du KGF-1, au contraire on a une faible production comparé à la normale. Puisque la voie de signalisation d’IL-1 ne semble pas être impliquée dans le défaut de production du KGF-1, on supposera que : 1) il existerait des facteurs (en dehors du TGF-) qui agiraient sur la stabilité de la protéine du KGF-1 ou bien sur les mécanismes de la production cette dernière ces facteurs induiraient une baisse de la production du KGF-1 malgré la présence de forte stimulation d’IL-1 ou d’autre cytokines (peut être un mécanisme de régulation interne de la cellule du fait de la forte réponse à l’IL-1ou bien un facteur externe lié au condition de l'asthme). 2) il existerait un défaut de régulation de protéines de la matrice extracellulaire capable de séquestrer le KGF-1 et de le rendre inaccessible aux cellules épithéliales, des molécules comme l’FGF-BP, ou bien de l’Heparinase voir d’autres protéines de la matrice extracellulaire qui sont augmentés dans l’asthme. En conclusion, mes résultats montrent qu’il y a une baisse significative de la production du KGF-1, défaut qui ne serait pas lié à la voie de signalisation d’IL-1 et qui n’implique pas l’action du TGF-. Il serait important de comprendre les mécanismes post-traductionnels qui peuvent expliquer le niveau de la protéine dans les fibroblastes asthmatiques. Puisqu’aux files du temps une faible baisse de la production du KGF-1 pourrait avoir des répercussions dans la réparation des cellules épithéliales chez les sujets asthmatiques. L’évaluation de l’expression des protéines activant ou séquestreront le KGF-1 dans la matrice extracellulaire serrait également très intéressante. Par la suite on pourrait évaluer l’effet du KGF-1 sur la prolifération des cellules épithéliales (asthmatiques versus sains), et étudier l’effet du TGF- sur cette prolifération pour essayer de déterminer si premièrement cette voie est impliquée dans la prolifération et la réparation des cellules épithéliales bronchiques, et deuxièmement voir si le TGF- n’aurait pas un effet inhibiteur sur cette voie proliférative comme ça était démontré pour la voie de l’EGFR. Dans l’asthme, il n’y a pas eu d’études montrant l’effet du KGF-1 sur la réparation des cellules épithéliales bronchiques ni son rôle dans la communication des cellules épithéliales et des fibroblastes bronchiques. L’éventualité d’un défaut de réponse des cellules épithéliales bronchique au KGF-1 sous l’influence du TGF-ou autre facteur (ou lié à un problème intrinsèque), ajouté au défaut de production (observé dans mon étude) pourrais nous aider à mieux comprendre la difficulté de l’épithélium bronchique à se réparer et à proliférer correctement et ainsi ouvrir des opportunités dans le domaine thérapeutique lié l’asthme. Références 1. Annesi-Maesano I, Mourad C, Daures JP, Kalaboka S, Godard P. Time trends in prevalence and severity of childhood asthma and allergies from 1995 to 2002 in France. Allergy. 2009 May;64(5):798-800. 2. Rochelle Garner et Dafna Kohen. Changements dans la prévalence de l’asthme chez les enfants au Canada. Rapports sur la santé au catalogue de Statistique Canada .Juin 2008. 3. Stephen T Holgate and Jo Douglass. Fast Facts: Asthma (second edition). 2006. 4. Boulet Lp, l’asthme, Notions de base, Education, intervention. 5. Busse WW Lemanske RF Jr. 2001. Asthma. 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