Les enzymes Table des matières 1. LA PROTEINE ENZYMATIQUE 1.1 Site actif 1.2.1 Configuration du site actif 1.2.2 Composition du site actif 1.2.2.1 - Acides aminés principaux ou dits de "contact" 1.2.2.2 - Acides aminés auxiliaires ou "collaborateurs" 1.2.2.3 - Acides aminés accessoires 1.2.3 L'ajustement induit 1.2 Constitution chimique des enzymes 1.1.1 Partie protéique des enzymes 1.1.2 Partie non protéique des enzymes 1.1.2.1 - Cofacteurs vitaminiques 1.1.2.2- Cofacteurs ioniques 1.1.2.3 - Cofacteurs héminiques 1.1.2.4 - Cofacteurs nucléotidiques 2- LA CATALYSE ENZYMATIQUE 2.1 Caractères généraux 2.1.1 Définition de la catalyse 2.1.2 Effets de la catalyse 2.1.2.1 - Accroissement des vitesses de réaction 2.1.2.1.1 – Notion de thermodynamique 2.1.2.1.2 - Energie d'activation 2.1.2.1.3 - Notions générales de vitesse Réaction irréversible d'ordre 1 ou monomoléculaire Réaction irréversible d'ordre 2 ou bimoléculaire Réaction d'ordre 0 : 2.1.2.1.4 - Cas particulier de la vitesse initiale 2.1.2.2- Respect des conditions thermodynamiques de la réaction 2.1.2.2.1 - Réversibilité des réactions biochimiques 2.1.2.2.2 - Réactions biochimiques irréversibles 2.2 Cinétique enzymatique 2.2.1 Equation de Michaëlis 2.2.2 Paramètres moléculaires 2.2.2.1 - Constante de Michaelis 2.2.2.2 - Vitesse maximale 2.2.2.3 - Activité Enzymatique Moléculaire (AEM) 2.2.2.4 - Efficacité enzymatique 2.2.3 Effets des agents physiques ou chimiques sur la cinétique enzymatique 2.2.3.1 – Substrat 2.2.3.1.1 - Spécificité enzymatique 2.2.3.1.2 - Concentration en substrat 2.2.3.2- Température 2.2.3.3 - pH 2.2.3.4 - Inhibiteurs de l'activité enzymatique 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 8 8 9 9 9 10 10 11 12 12 14 14 14 15 15 16 16 16 16 16 17 17 1 2.2.3.4.1 - Les inhibiteurs REVERSIBLES Compétitifs Non compétitifs Incompétitifs 2.2.3.4.2 - Les inhibiteurs IRREVERSIBLES Agents dénaturants Poisons 2.2.4 Le dosage enzymatique 2.2.4.1 – Vmax et dosages enzymatiques Principe Les Conditions optimales 2.2.4.2 - Dosage massique 3- REGULATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE 3-1 Allostérie 3.1.1 Cinétique des enzymes allostériques 3.1.2 Nature de la transition allostérique 3.1.2.1 - Modèle concerté (Monod, Jacob et Changeux - 1960) 3.1.2.2 - Modèle séquentiel (Koshland) 17 17 17 17 17 17 17 18 18 18 18 18 18 18 19 20 20 20 3.2 - Allostérie covalente 21 3.3 - Le clivage protéolytique 21 3.4 - Isoenzymes 22 4 - LES ENZYMES DANS L'ORGANISME 22 4.1 Classification des enzymes 22 4.2 Enzymologie clinique 23 4.2.1 Cytolyse 4.2.2 Induction enzymatique 4.2.3 Enzymopathies congénitales 4.3 Organisation intracellulaire des enzymes 4.3.1 Complexes multienzymatiques 4.3.2 Enzymes multifonctionnels 4.3.3 Enzymes immobilisées 4.3.4 Métabolons 23 23 23 23 24 24 24 24 A RETENIR 25 A RETENIR (suite) 26 A RETENIR (suite bis) 27 A RETENIR (suite ter) 28 A RETENIR (suite et fin) 29 QCMs: 30 CORRECTION QCMs: 31 2 Nous allons étudier plus précisément dans le cadre de la liaison protéine-ligand l’interaction entre l’enzyme, qui est une protéine liante, et son ligand que l’on nomme substrat. Dans ce cadre tous les caractères que nous avons vus précédemment s’applique à ce modèle soit : - Spécificité - Saturation - Inhibition spécifique - Régulation - Anomalies congénitales La liaison enzyme-substrat permet de transformer le substrat en produit qui conduira à un effet biologique. Les enzymes sont des constituants majeurs de l’organisme. En effet, elles dirigent les réactions métaboliques (exemple: la glycolyse) qui ont lieu dans tous les organismes et participent à leur structuration. De fait de leur importance majeure dans l’organisme, le moindre dérèglement des enzymes peut causer de nombreuses pathologies. C’est pourquoi l’enzymologie clinique est un élément important des investigations paracliniques en pathologie. 1. LA PROTEINE ENZYMATIQUE 1.1 Site actif Le site actif de l'enzyme est la région fonctionnelle de la molécule qui "accueille" le substrat permettant ainsi sa transformation. Il occupe une part relativement réduite du volume total d'une enzyme, et se trouve généralement en profondeur et constitue une cavité sorte de microenvironnement dont le caractère polaire augmente les forces de liaison au substrat. Le substrat est lié aux enzymes par des forces relativement faibles. Il s'agit le plus souvent de liaisons hydrogènes qui permettent d'orienter le substrat et jouent un rôle essentiel dans les degrés de spécificité entre l'enzyme et son substrat. Caractère polaire: différence de polarité entre les atomes d’une molécule Liaison hydrogène: liaison non covalente entre un atome d’hydrogène et un atome électronégatif (δ-) 1.2.1 Configuration du site actif Le site actif réunit des acides aminés distants les uns des autres sur la séquence primaire, comme l'indique la disparition de l'activité catalytique par dénaturation. Il se situe à l'intérieur d'une fissure de la structure tridimensionnelle de l’enzyme et est entourée d’une poche hydrophobe au fond de la fissure. Là, l'action chaotropique de l'eau est exclue, la polarité des acides aminés de contact se trouve exacerbée par contraste, et les transferts électroniques peuvent s'effectuer. En effet l'eau est un solvant bipolaire qui se comporte comme un corps diélectrique qui diminue le champ électrique dans lequel il se trouve. La présence d'eau dans ce site diminuerait les forces entre atomes constitutifs des molécules d'enzymes et de substrat, en contractant des liaisons hydrogènes avec ces deux partenaires. Il se produirait alors une compétition entre le substrat et l'eau pour occuper le site actif de l'enzyme d’où une fragilité du complexe et une perte d'efficacité enzymatique. 3 Séquence primaire: séquence d’acides aminés d’une protéine avant tout repliement Hydrophobe: caractère d’une molécule qui repousse l’eau Chaotropique: molécule qui détruit la structure tertiaire (structure repliée) des macromolécules comme les protéines Exemple de la ribonucléase 1.2.2 Composition du site actif Le site actif présente généralement un site de positionnement qui permet de maintenir et d'orienter le substrat et un site catalytique qui réalise la catalyse. On distingue trois catégories d'acides aminés selon leur rôle dans l'activité. 1.2.2.1 - Acides aminés principaux ou dits de "contact" Ils assurent la liaison temporaire du substrat au site actif par des liaisons de faible énergie (ioniques faibles, hydrogène, Van der Waals). Par leur réactivité, ils participent aux transferts électroniques de la réaction et certains de leurs atomes peuvent s'échanger individuellement avec ceux des substrats. Ce sont des acides aminés polaires SER, GLU, ASP, LYS, ARG, HIS, CYS, TYR. Quand s'y ajoutent un ou plusieurs coenzymes (exemples: ions, coenzymes nucléotidiques et vitaminiques), on parle de centre catalytique. 1.2.2.2 - Acides aminés auxiliaires ou "collaborateurs" Ils créent un environnement favorable à l'action catalytique. Les uns, par une zone polaire de signe approprié, orientent les substrats, les autres participent à la zone hydrophobe centrale. 1.2.2.3 - Acides aminés accessoires Ils assurent le maintien de la structure tertiaire stabilisant le site actif et n'interviennent pas directement dans l'activité. On a pu se demander d'ailleurs "pourquoi les enzymes sont si grosses"? Il faut se dire que, non seulement la structure tertiaire résulte de contraintes thermodynamiques imposées par la structure primaire, mais que l'enzyme agit dans un contexte biologique nécessitant de nombreuses interactions macromoléculaires, dont la nature est probablement du même ordre que celle des liaisons protéine-ligand. 4 1.2.3 L'ajustement induit Koshland avait noté que la fixation du substrat amenait une modification de la conformation du site actif, qu'il comparait à l'adaptation d'un gant à sa main et qu'il appela "induced fit". Cette notion implique une plasticité de l'enzyme qui laisse entrevoir la transconformation de la protéine contemporaine de l'action catalytique. 1.2 Constitution chimique des enzymes Les enzymes sont majoritairement des protéines. Cependant, des substances autres que les protéines enzymatiques peuvent présenter des activités enzymatiques comme les abzymes et les ribozymes. On distingue les homoenzymes constituées uniquement d'acide-aminés et les hétéroenzymes constituées d'une partie protéique nommée apoenzyme associée à une partie non protéique nommée cofacteur, groupement prosthétique, coenzyme… Abzyme: anticorps ayant une fonction enzymatique Ribozyme: ARN ayant une fonction enzymatique 1.1.1 Partie protéique des enzymes Les enzymes sont majoritairement des protéines. Une enzyme est purifiée, caractérisée, hydrolysée, dénaturée et cristallisée comme une protéine. On connaît pour de très nombreuses enzymes le détail des diverses structures protéiques et les gènes ont été identifiés et séquencés. 1.1.2 Partie non protéique des enzymes Les hétéroenzymes possèdent une partie non protéique appelée de façon générale coenzyme ou cofacteur qui peuvent être séparés en deux catégories: les groupements prosthétiques et les cosubstrats. Le caractère indispensable de ces coenzymes a pu faire penser que là résidait le rôle catalytique de l'enzyme. Mais l'existence d'enzymes de nature purement protéique, où le site actif est constitué uniquement d'acides aminés, a démontré que c'est bien dans la structure protéique seule qu'il faut chercher le caractère enzymatique. Les coenzymes sont des métabolites de faibles poids moléculaire en comparaison aux enzymes et peuvent être sous forme libre ou liée à l’enzyme. Ces cofacteurs ont des fonctions d'accepteurs et de transporteurs de radicaux libérés au cours de la catalyse, ils agissent à faible concentration et doivent, comme les enzymes, être régénérés à la fin d’une réaction ou d’une séquence de réaction. Certains traitements chimiques peuvent éliminer une partie de certaines enzymes que l’on nomme au sens large cofacteur. Ils sont majoritairement de nature non protéique. L’apoenzyme n'a alors plus d'activité catalytique, mais cette activité peut être restaurée lorsqu'on reconstitue l'hétéroenzyme. Cofacteur: élément non protéique d’une enzyme nécessaire à son activité Coenzyme: lorsque le cofacteur est un ion métallique ou une petite molécule organique Groupement prosthétique: cofacteur lié de façon covalente à l’enzyme Cosubstrat: cofacteur lié de façon non covalente à l’enzyme, se comportant comme un substrat 1.1.2.1 - Cofacteurs vitaminiques De nombreuses vitamines justifient ainsi leur impact en biologie, mais doivent être au préalable transformées en coenzymes (exemples: vitamine B, C, K). 5 1.1.2.2- Cofacteurs ioniques Il peut s'agir des ions banaux de l'organisme (exemples: Ca++, Mg++, Cl-, K+), de cations métalliques moins abondants (exemple: Fe++, Cu++, Zn++) ou des oligo-éléments qui justifient ainsi leur importance biologique (exemples: Se, Mn++, Mo++). 1.1.2.3 - Cofacteurs héminiques Les hémoenzymes portent un groupement prosthétique ferro-porphyrinique (exemple: catalase). 1.1.2.4 - Cofacteurs nucléotidiques Essentiellement l'ATP, mais aussi les autres nucléosides triphosphates, des activateurs de substrats (exemple: UDP glucose, CDP choline), et des coenzymes vitaminiques, dans la molécule desquels les nucléotides entrent pour partie (exemples: NAD+, NADP+, FAD, Coenzyme A). 2- LA CATALYSE ENZYMATIQUE Les réactions essentielles pour le fonctionnement d'un être vivant sont lentes voire impossibles sans la présence des catalyseurs biologiques que sont les enzymes. Ces macromolécules accélèrent les réactions voir assurent un couplage physique entre deux réactions pour permettre de maintenir les systèmes biologiques compatibles avec son fonctionnement. L'étude de la cinétique enzymatique vise à comprendre les mécanismes réactionnels mais aussi à établir de manière quantitative comment une enzyme est capable d'accélérer spécifiquement une réaction chimique. 2.1 Caractères généraux La catalyse n'est pas spécifique au monde du vivant. C'est une notion plus vaste utilisée largement dans le monde industriel et qui fait appel à des catalyseurs. 2.1.1 Définition de la catalyse La catalyse est l'action d'un catalyseur sur une transformation chimique. Ce catalyseur présente 4 caractéristiques: - Il augmente les vitesses de réaction. - Il respecte les conditions thermodynamiques de la réaction. - Il se retrouve intact en fin de réaction - Il agit à l'état de trace (en principe, car il est des cas où la quantité de protéines enzymatiques est loin d'être négligeable). 2.1.2 Effets de la catalyse Seuls les 2 premiers effets de sa définition vont être développés ici, soit accroissement de la vitesse de réaction et respect des conditions thermodynamiques. 2.1.2.1 - Accroissement des vitesses de réaction 2.1.2.1.1 – Notion de thermodynamique On appelle système la région de l'univers (cellules, mitochondrie…) dans laquelle s'effectuent les 6 transformations que l'on étudie. La transformation dans le système tel que le système biologique, peut s'accompagner d'un échange d'énergie et/ ou de matière avec le milieu extérieur. Tout système possède une enthalpie H qui est l'énergie totale dont seule une partie sera susceptible d'être cédée au milieu extérieur sous forme de travail ou de chaleur. Cette quantité d'énergie utile constitue l'enthalpie libre ou énergie libre G du système. Le premier principe de thermodynamique stipule que l'énergie de l'univers (système + milieu extérieur) est constante. Donc les échanges d'énergie au cours d'une transformation sont égaux à la variation d'enthalpie du système. ∆G: Variation d'énergie libre du système ∆H: Variation d'énergie totale du système ou enthalpie. Le système peut échanger sous forme de chaleur ou de "travail" ∆S: Variation d'entropie. Elle correspond à la mesure du désordre du système. T ∆S: énergie non transférable au milieu extérieur Si l'on se reporte au système biologique et à la catalyse enzymatique. Chaque entité ici l'enzyme et son substrat a une enthalpie propre. Si ces deux entités entrent en collision elles devraient toute réagir de la même façon. Or seul une faible fraction de ces molécules est capable de réagir à un moment donné. De nombreuses collisions entre l’enzyme et son substrat donnent des chocs élastiques c’est-à-dire que les entités se percutent, rebondissent et se séparent inchangées. Certaines collisions sont plus violentes, les entités (enzyme et substrat) entrant en contact ont une plus grande énergie ce qui entraîne au moment du choc des modifications électroniques comme des déplacements d'électron(s) entrainant la rupture ou la formation de liaison(s). Dans ce cas, le choc est efficace car il modifie les entités. On admet que parmi les milliards de molécules qui constituent une solution, seule un petit nombre ont une énergie interne suffisante pour réagir. On dit qu'elles sont activées. Les molécules non activées peuvent passer à l'état activé par la température qui augmente l'agitation moléculaire, des radiations lumineuses… 2.1.2.1.2 - Energie d'activation Un mélange réactif peut rester en équilibre métastable. La réaction enzymatique ne se produit que lorsque les molécules ont atteint un état activé différent de l'état de base. Cet état est atteint par l’acquisition d’une quantité d'énergie appelée énergie d'activation EA. Elle est d'autant plus élevée que la réaction a du mal à se produire spontanément. Le rôle du catalyseur est d'abaisser la valeur de cette énergie d'activation. L’énergie libre ΔG de la réaction n’est pas modifiée par la présence d’un catalyseur. La molécule activée est un état transitoire et non un composé intermédiaire car il n'est pas isolable. Equilibre métastable: équilibre apparemment stable qui peut rapidement être déstabilisé par une perturbation 7 Exemple: La décomposition de l'eau oxygénée est facilitée par la catalase : H2O2 → H2O + O2↑ EA Spontanément 18 Kcal Mole-1 EA avec Mousse de Pt 11,7 Kcal Mole-1 EA avec Catalase < 2 Kcal Mole-1 Les enzymes augmentent la vitesse de réaction en diminuant l'énergie libre d'activation. Une décroissance de ΔGA de 1,5 Kcal mole-1 multiplie environ par 10 la vitesse de réaction. 2.1.2.1.3 - Notions générales de vitesse Réaction irréversible d'ordre 1 ou monomoléculaire Considérons le cas simple d'une réaction transformant le substrat S en produit P: La vitesse de la réaction est directement proportionnelle à la concentration du substrat qui varie au cours du temps (t) selon la vitesse : k = constante de vitesse (S) = concentration en substrat (P) = concentration en produit t = temps n = ordre de la réaction. Remarque: Si les concentrations sont exprimées en mol/l (M), le temps en secondes (s), la vitesse aura pour unité M/s et la constante de vitesse k sera exprimée en s-1 Le temps de demi-réaction ou demi-vie de la réaction est le temps nécessaire pour que la moitié du substrat soit transformé en produit, il est 8 constant et indépendant de la concentration initiale en substrat pour une réaction d'ordre 1. Réaction irréversible d'ordre 2 ou bimoléculaire Dans ce cas il y a deux réactifs identiques ou non, nécessaire à la formation du produit: La réaction est dite du second ordre car la vitesse de réaction est fonction de la concentration des deux réactifs A et B. V= k [A]n1 [B]n2 n1 est l'ordre de la réaction partielle par rapport au réactif A n2 est l'ordre de la réaction partielle par rapport au réactif B n = n1+n2 est l'ordre global de la réaction Remarque: Dans ce cas si les concentrations sont exprimées en mol/l (M), le temps en secondes (s), la vitesse aura pour unité M/s et la constante de vitesse k sera exprimée en M-1s-1. Le temps de demi-réaction ou demi-vie de la réaction est dépendant de la concentration initiale en substrat pour une réaction d'ordre 2. Réaction d'ordre 0 : La vitesse est indépendante de la concentration des réactifs. Elle est donc constante. Exemple: lorsque l'on mélange l'enzyme à un large excès de substrat, la formation du complexe enzyme substrat est maximale et stable et la vitesse d'apparition du produit est indépendante de la concentration en substrat initiale. 2.1.2.1.4 - Cas particulier de la vitesse initiale La mesure de vitesse est basée sur l'apparition des molécules de produit au cours du temps. Nous venons de voir que la vitesse est un paramètre variable en fonction des conditions. Pour faire une mesure valable il faut donc se mettre dans des conditions reproductibles que l'on appelle conditions initiales et on parle alors de vitesse initiale. Dans ce cas : - l'enzyme est à l'état natif - la concentration en substrat [S] est parfaitement définie moins de 10% du substrat a été consommé - la concentration en produit formé [P] est quasi nulle et ne modifie pas la réaction Pour mesurer une vitesse de réaction il faut être dans les conditions initiales même pour mesurer une vitesse maximale. 2.1.2.2- Respect des conditions thermodynamiques de la réaction Nous avons vu que seul une partie de l'énergie d'un système est susceptible d'être cédée au milieu extérieur, c'est l'énergie libre. Lors de la catalyse enzymatique cette énergie libre peut: - augmenter, la réaction est endergonique (∆G>0), il faut fournir de l'énergie au système pour qu'elle puisse se réaliser. Elle est 9 thermodynamiquement possible seulement avec un apport d'énergie extérieur. - diminuer, la réaction est exergonique (∆G<0), de l'énergie est donnée au milieu extérieur. Elle est thermodynamiquement possible spontanément. Par convention toute énergie reçue par le système est considérée comme positive, elle est négative lorsqu'elle est perdue. A l'équilibre la variation d'enthalpie libre est nulle. 2.1.2.2.1 - Réversibilité des réactions biochimiques La grande majorité des réactions biochimiques de l'organisme se déroulent à l'équilibre. Soit la réaction : La variation d'enthalpie libre de cette réaction (∆G') est exprimée par : ∆G' Variations d'énergie ou enthalpie libre standard à pH=7 ∆G0' variation d'enthalpie libre standard obtenue pour une concentration des espèces chimiques à 1 mol/l, pH=7, Pression 0.1Mpa R Constante des gaz parfaits T Température absolue [A]i; [B]i concentration de A et B initialement A l'équilibre, on a une variation d'énergie libre standard ΔG' = 0 Exemple de la réaction catalysée par la phosphohexoisomérase: qui catalyse l’isomérisation du glucose 6 phosphate en fructose 6 phosphate. Que l'on parte de l’un ou de l’autre réactant, l'équilibre n'est pas changé par l'enzyme et dépend du seul ΔG0 de la réaction. Il est atteint plus rapidement en présence de l'enzyme, qui accélère aussi bien la réaction directe que la réaction inverse. A l'équilibre on a 65.8% de G6P et 34.2% de F6P et NON 50% de chaque réactif K = 0,52 ΔG0' = 0,4 Kcal Mole-1 10 2.1.2.2.2 - Réactions biochimiques irréversibles Certaines réactions ne sont pas réversibles. Une chaîne métabolique peut être irrémédiablement dirigée dans un seul sens lorsqu'une étape irréversible est franchie. Cela dépend : - du déséquilibre substrat-produit (B)/(A) - de l'obstacle thermodynamique (ΔG0) - des caractéristiques moléculaires de l'enzyme (KM) Pour renverser le courant, il faut : - soit déséquilibrer le rapport substrat-produit - soit coupler la réaction endergonique avec l'hydrolyse exergonique de l'ATP par exemple. En général, il faut pour cela une enzyme différente. Nombreuses sont les voies métaboliques où, dans une majorité de réactions à l'équilibre, il y a quelques étapes décisives. Un couple d'enzyme dirige, selon la régulation, le métabolisme vers la synthèse ou la dégradation, avec un certain recyclage des substrats. Les enzymes respectent les conditions thermodynamiques des réactions biochimiques. Elles ne modifient pas les conditions d'un équilibre et ne permettent pas le renversement de réactions irréversibles. De même une réaction endergonique ne pourra se réaliser spontanément même en présence d'une enzyme, elle devra être associée à une réaction exergonique. Un catalyseur ne permet pas de rendre une réaction thermodynamiquement impossible possible. 2.2 Cinétique enzymatique La cinétique enzymatique étudie la vitesse des réactions enzymatiques. Lorsqu'on étudie la variation de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique en fonction de la concentration initiale en substrat, on la voit évoluer de façon hyperbolique vers une vitesse maximale (VMAX) qui représente la saturation de l’enzyme par son substrat. Cette courbe de saturation est l’expression graphique de l'équation de Michaelis-Menten qui permet de caractériser les paramètres moléculaires d'un couple enzyme - substrat. 11 2.2.1 Equation de Michaëlis Nous commencerons par l'étude d'un cas simple d'une enzyme facilite la transformation irréversible d'un seul substrat en un seul produit : On peut décomposer cette réaction en 2 étapes : -1: il y a formation d'un complexe entre l’enzyme et le substrat (ES) dont la constitution et la destruction sont rapides. -2: la transformation du substrat en produit est lente et impose sa vitesse à la réaction enzymatique. Donc la vitesse de la réaction est proche de V3. Les conditions requises sont une concentration du complexe (ES) constante tout au long de la réaction («steady state» ou état stationnaire = équilibre). On utilise par commodité son inverse, la constante de Michaëlis : Taux d'occupation des sites: On voit que KM a la dimension d'une concentration. C'est la 1/2 saturation, concentration de substrat (S) pour laquelle la moitié des sites actifs est sous forme de complexe (ES). Vitesse maximale (VMAX): D'après l'équation 2, et puisque nous avons vu que la vitesse de la réaction est proche de la vitesse de transformation du substrat en produit (vi = v3), on déduit : Lorsque l’enzyme est saturé par le substrat, tous les sites enzymatiques sont sous forme de complexes enzyme-substrat. La concentration du complexe enzyme-substrat est donc égale à la concentration en enzyme mis initialement dans notre réaction soit : (ES) = (ET). De plus si 12 tous les sites enzymatiques sont saturés, on atteint la vitesse maximale (VMAX) on peut donc écrire que : Pour les valeurs extrêmes de concentration du substrat : (S) → ∞ et KM est négligeable devant (S) soit (S)>50KM, alors la Vi tend vers la VMAX. Le substrat sature les sites catalytiques de l'enzyme nous obtenons une vitesse qui est indépendante de la concentration en substrat, la réaction est d'ordre 0. (S) → 0 et (S) est négligeable devant KM alors La vitesse est dépendante de la concentration en substrat, réaction est d'ordre 1. Expression graphique de l'équation de Michaëlis La représentation graphique de l'équation de Michaëlis ne permet pas une mesure précise de VMAX, (asymptote) ni de KM car il faudrait de nombreuses mesures cinétiques pour l'établir. On préfère des transformations linéaires permettant une mesure avec seulement 5 cinétiques. Cas général: Avec plusieurs substrats et produits, et avec des réactions réversibles, les expressions se compliquent. Cependant, en maintenant tous les réactants (substrats et produits) en saturation sauf celui que l’on teste, on peut exprimer une KM de l’enzyme pour ce paramètre seul. Une enzyme avec 2 substrats et 2 produits sera ainsi caractérisée par 4 KM et 4 Vmax. 13 2.2.2 Paramètres moléculaires 2.2.2.1 - Constante de Michaelis C'est donc un reflet de l'affinité, d'autant plus forte que KM est plus basse (de 10-4 à 109). Cependant, si l'on veut comprendre la signification intuitive de la KM, il faut se référer à la concentration physiologique des substrats au lieu de la réaction cellulaire : -Si (S) >>>> KM, l'enzyme est saturée et ne peut répondre par un accroissement de la vitesse de réaction à un surplus de substrat. Elle n'a pas de rôle régulateur. -Si (S) > KM ou (S) < KM, l'enzyme n'étant pas saturée, elle réagit à une concentration accrue de substrat par un regain d'activité. Elle a un certain rôle régulateur. 2.2.2.2 - Vitesse maximale En présence de concentrations croissantes d'enzyme, l'étude de la cinétique d'une réaction enzymatique montre qu'il y a d'autant plus de produit formé que la concentration en enzyme augmente. Selon l'équation 3, (VMAX = k3 (ET)), la VMAX est directement proportionnelle à 2 facteurs: - La concentration en enzyme ET. En présence de concentrations croissantes d'enzyme, l'étude de la cinétique d'une réaction enzymatique montre qu'il y a d'autant plus de produit formé que la concentration en enzyme augmente. - k3 qui chiffre le nombre de molécules de substrat transformées en produit par unité de temps et par molécule d'enzyme dans les conditions de saturation de l'enzyme par son substrat dans des conditions non physiologiques. C'est l’activité enzymatique moléculaire: AEM. VMAX reflète la capacité de l'enzyme (ET) et sa concentration en termes de substrat transformé. Elle permet de ce fait le dosage enzymatique. Trois représentations graphiques de l'influence de la quantité d'enzyme (E1, E2, E3 ou ET) sur la quantité de produit formé en fonction du temps (fig. A), la Vi en fonction de la concentration en substrat (fig. B) et la Vmax (fig. C). 14 2.2.2.3 - Activité Enzymatique Moléculaire (AEM) L’AEM ou k3 est le nombre de molécules de substrat transformées par molécule d’enzyme : On utilise souvent kcat au lieu de k3. C'est en fait le condensé de plusieurs constantes exprimant la vitesse de formation de complexes intermédiaires plus ou moins activés. 2.2.2.4 - Efficacité enzymatique On évalue la perfection enzymatique par la valeur du rapport kcat /KM qui au maximum tend vers k1. La vitesse d’action d’une enzyme dépend en effet de la disponibilité de son substrat. L’efficacité enzymatique est souvent du même ordre de grandeur que la constante de diffusion du substrat (10-9 cm/s-1). C'est surtout vrai lorsqu’une union supramoléculaire d'enzymes, un métabolon, réalise une tunnelisation des substrats (channeling) par transmission directe de sites à sites. 2.2.3 Effets des agents physiques ou chimiques sur la cinétique enzymatique 2.2.3.1 – Substrat Le substrat par sa structure et sa concentration va modifier la cinétique enzymatique. 2.2.3.1.1 - Spécificité enzymatique La liaison entre l’enzyme et son substrat nécessite une concordance structurale. On distingue: - La spécificité de substrat de l'enzyme, large, étroite ou même telle qu'elle puisse distinguer 2 énantiomères. Cela fait du dosage enzymatique de substrat une méthode plus spécifique que le dosage chimique. - La spécificité d'action, un même substrat pouvant subir des réactions différentes catalysées par des enzymes distinctes (carrefour métabolique). 2.2.3.1.2 - Concentration en substrat Pour que l'ordre de la réaction soit de 0, la réaction doit être réalisée à l’équilibre soit en véritable excès de substrat. Si l'on se base sur l'équation 2 et que l'on mesure (S) en KM, on s’aperçoit que l'on atteint difficilement la saturation. On admet qu'en moyenne, une concentration en substrat de 50 fois la KM est satisfaisante sauf en cas inhibition par excès de substrat, de substrat peu soluble ou très onéreux. 15 2.2.3.2- Température Augmentant les mouvements moléculaires, la température accroît la probabilité de chocs efficaces, et accélère les réactions chimiques. En général un doublement de la vitesse de réaction s'observe lorsque la température s'élève d'environ 10 degrés C (on dit que le Q10 # 2). Il existe une relation empirique appelée équation d'Arrhenius qui relie la constante de vitesse k et la température : Evidemment, la dénaturation thermique limite cette activation. La température accélère les réactions enzymatiques selon une loi logarithmique, comme la dénaturation thermique obéit aussi à une loi logarithmique, la résultante est une courbe présentant un maximum, la température optimale, variable de 10 à 100° C selon les enzymes (en général 25 à 55° C). La mesure des activités enzymatique ne se fait en général pas à la température optimale, trop variable, mais est fixée de façon conventionnelle, afin que les résultats puissent être comparés. 2.2.3.3 - pH L'activité enzymatique varie en fonction du pH avec un pH optimal encadré de deux pH d'arrêt, qui permet de séparer des enzymes à pH optimal d'action acide, neutre ou alcalin. Les pH d'arrêt renseignent sur la nature des acides aminés de site actif. 2.2.3.4 - Inhibiteurs de l'activité enzymatique On distingue les inhibiteurs réversibles, souvent utilisés en thérapeutique et les poisons irréversibles. 2.2.3.4.1 - Les inhibiteurs REVERSIBLES Compétitifs Analogues structuraux, ils entrent en compétition avec le substrat naturel pour le site actif avec lequel ils ont une affinité (KI), mais n'entraînent pas d'effet catalytique (antagonistes) : c'est une action spécifique qui semble élever la KM, mais ne touche pas VMAX, car leur action est 16 levée par un excès de substrat. Leur nature renseigne sur la structure du site actif et la transconformation enzymatique. Exemple: AZT ou ddl sont deux traitements anti-HIV qui sont des analogues de la desoxythimidine utilisée par la transcriptase inverse du virus. Non compétitifs Ils ne se lient pas au site actif, et leur action n'est pas supprimée par un excès de substrat. Il y a une baisse de la VMAX mais le KM est intact. Ainsi sont les chélateurs métalliques, et les bloqueurs de groupements SH. Incompétitifs Ils gênent aussi bien la fixation sur le site actif que la transconformation éventuellement par effet stérique mais que nous n'étudierons pas ici. 2.2.3.4.2 - Les inhibiteurs IRREVERSIBLES Ils entraînent une perte des propriétés catalytiques de l'enzyme, soit par modification de sa conformation par des agents dénaturants soit par blocage du site actif de l'enzyme par des poisons. Agents dénaturants Les enzymes sont particulièrement sensibles à la dénaturation, surtout thermique, et sont protégées par la fixation des substrats. Poisons Il s'agit de réactifs qui interagissent avec les résidus d'acides aminés du site actif. On peut citer l'aspirine pour la sérine du site actif des cyclooxygénases, le diisopropyl fluorophosphate (DFP) pour les sérines estérases, le cyanure pour la cytochrome oxydase. 2.2.4 Le dosage enzymatique L'importance pratique de la cinétique enzymatique est la possibilité de doser les enzymes c'est-à-dire de mesurer leur concentration dans les liquides biologiques. L'augmentation de certaines enzymes peut en effet être le signe de la libération du contenu enzymatique d'une cellule suite à une destruction cellulaire. Exemple: augmentation du taux plasmatique de l'enzyme CKMB au cours de l'infarctus du myocarde. On distingue l'évaluation de la concentration d’une enzyme par la mesure de la VMAX et le dosage massique. 2.2.4.1 – Vmax et dosages enzymatiques Principe Il est basé sur la mesure de la VMAX : VMAX = kcat (ET) (eq. 3) Cependant, il faut bien voir que la VMAX n'est pas une mesure directe de (ET), mais une activité biologique dépendante de kcat, c'est à dire de l'AEM. Nous avons vu que de nombreux paramètres peuvent faire varier la cinétique enzymatique: température, pH, substrat… Pour faire ces dosages, les conditions expérimentales doivent être rendues optimales et reproductible pour que l'on ait une mesure juste. 17 Les Conditions optimales Elles sont conseillées sur le plan national par les recommandations de la Société Française de Biologie Clinique (SFBC), avec un consensus international. Elles concernent les paramètres de la réaction enzymatique, c'est à dire la concentration et la nature des substrats ou des agonistes, la température, le pH et la nature et concentration des effecteurs éventuels. L'unité de mesure de la VMAX souvent utilisée est l'Unité internationale: une UI d'activité enzymatique transforme 1 mole de substrat en 1 minute dans les conditions optimales (de substrat, de température, de pH et d'effecteurs), et ce par unité d'échantillon biologique (L de plasma, ou g de tissu). Le Katal (système MKS), n'est pas d'usage courant. Dans le dosage d'une activité enzymatique, la mesure de VMAX n'est qu'un reflet de (ET). Elle représente la concentration d'enzyme à la seule condition que les conditions optimales de la mesure soient respectées. 2.2.4.2 - Dosage massique On peut avoir besoin d'évaluer la concentration réelle d'une protéine enzymatique, en s'affranchissant des aléas expérimentaux d'une mesure d'activité. C'est le dosage massique de l'enzyme réalisé en général par immunoanalyse. Exemple: Si l’on suspecte une pathologie cardiaque on mesurera la quantité d'isoenzyme MB de la créatine kinase (CKMB) par immunodosage , plus qu’une mesure enzymatique de toutes les isoformes de créatine kinase qui peut refléter une autre pathologie (myolyse…). De même dans les hypertensions on dose la rénine vraie, de préférence à l'activité rénine plasmatique. 3- REGULATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE 3-1 Allostérie Le terme allostérie signifie un changement de conformation intervenu dans une protéine à la suite de l'attachement d'un composé nommé effecteur allostérique, en dehors du site catalytique. Ces effecteurs allostériques qui peuvent être activateurs ou inhibiteurs ont pour caractères essentiels d'être spécifiques et fixés sur un site différent du site actif, le site allostérique. Dans le cadre des enzymes allostériques, la fixation de l'effecteur allostérique entraîne un changement de conformation de l’enzyme appelé transition allostérique et augmente ou diminue l’activité catalytique de cette enzyme. La transition allostérique amène une modification de la KM apparente pour les enzymes de type K ou de la VMAX, c'est à dire de l'AEM pour les enzymes de type V. Nous n’étudierons par la suite que les enzymes de type K. Ces enzymes allostériques jouent un rôle fondamental dans la régulation des voies métaboliques chez tous les êtres vivants et sont appelées enzymes régulatrices. Elles sont le plus souvent situées au début des voies métaboliques et peuvent être inhibées par le produit terminal lorsqu'il est en excès, on parle de rétro-inhibition par le produit terminal. D'autres facteurs peuvent au contraire activer cette voie. Les enzymes allostériques sont, dans leur immense majorité, des oligomères. Elles présentent une structure quaternaire faite de protomères, semblables ou différents, en général en nombre pair. 3.1.1 Cinétique des enzymes allostériques Nous n’envisagerons que les enzymes de type K, et uniquement les effets homotropiques ou coopératif du substrat. Lorsque l'on établit la courbe vi = f (S) pour la thréonine désaminase, on n'observe pas une courbe "michaelienne" classique, mais une courbe sigmoïde. Une enzyme dite Michaelienne possède une courbe de 18 saturation de type hyperbolique alors qu’une enzyme allostérique possède une courbe de saturation dite sigmoïde. Avec une enzyme allostérique, la vitesse de la réaction augmente d'abord lentement avec l'accroissement de la concentration en substrat, puis de plus en plus rapidement, et devient michaelienne après un seuil. On interprète ce phénomène comme une fixation malaisée du substrat à faible concentration, puis de plus en plus facilement au fur et à mesure que sa concentration augmente: c'est l'effet coopératif du substrat ou homotropique. Il ne s'agit pas à proprement parler de KM, mais d'une KM apparente, plus élevée. L'addition d'effecteurs modifie le comportement cinétique de l'enzyme. L'effecteur inhibiteur aggrave le caractère sigmoïde de la courbe, et élève la KM apparente. L'effecteur activateur en excès rétablit le comportement michaelien normal (les effecteurs sont supposés être à saturation pour éviter leurs propres effets homotropiques). Une dénaturation légère (exemples: urée diluée, chaleur douce) incapable de faire disparaître l'activité de l'enzyme, peut néanmoins supprimer la modulation d'activité de l'enzyme et ses caractères allostériques expérimentaux. On peut pourtant, malgré cette désensibilisation, montrer la persistance de la liaison des effecteurs sur les sites allostériques. La transition allostérique est donc liée à l'intégrité de la structure quaternaire des enzymes allostériques. Structure quaternaire: structure complétement repliée d’une protéine 3.1.2 Nature de la transition allostérique Coopérativité, oligomérie et désensibilisation semblent indiquer que la transition allostérique représente une forme particulière de transconformation. Elle implique le plus souvent des cas la structure quaternaire des enzymes régulatrices. Pourtant on connaît des enzymes allostériques monomères (exemples: glucokinase, protéine p21ras). Deux modèles s'opposent pour tenter d'expliquer ces effets de la liaison des effecteurs sur leurs sites spécifiques. 3.1.2.1 - Modèle concerté (Monod, Jacob et Changeux - 1960) Etant donné la symétrie des structures oligomériques, ce modèle postule l'existence de deux conformations de l'enzyme dont l’interconversion est sujette à un équilibre, l'une tendue (T) et l'autre relâchée (R). Une des formes a plus d'affinité pour le substrat (par exemple R) et l'autre moins. - L'équilibre préexiste à toute introduction du substrat ou des effecteurs - La transition est concertée, selon la loi du tout ou rien - En présence du substrat à faible concentration, les molécules se fixent sur la forme R pour y être transformées, et la diminution des formes R libres déplace l'équilibre. Plus la concentration en substrat augmente, plus la proportion de forme affine R s'accroît, jusqu'au seuil où tout l'enzyme est sous cette forme. Le comportement devient alors michaelien. - L'activateur se fixe sur la forme la plus affine, et l'inhibiteur sur la forme la moins affine, et déplacent en conséquence l'équilibre - Le phénomène est donc en quelque sorte passif, indirect. 19 Ce modèle rend parfaitement compte du comportement de nombreux enzymes de type K (exemple: thréonine désaminase). Structure oligomérique: protéine comportant plusieurs chaines polypeptidiques associées de façon répétitive et souvent symétrique 3.1.2.2 - Modèle séquentiel (Koshland) C'est l'extension de la notion d'ajustement induit. La fixation du substrat ou d'effecteur sur une sous-unité retentit sur les protomères voisins. Les principales caractéristiques de ce modèle semblent s'opposer point par point à celles du modèle précédent. - Un seul état de l'enzyme préexiste à l'introduction des substrats ou effecteurs - La transition allostérique est séquentielle, chaque protomère étant activé tour à tour - L'activateur se fixe sur les protomères inactifs, les inhibiteurs sur les protomères actifs - Il s'agit d'un effet direct, actif, chaque protomère ayant fixé le substrat ou l'effecteur influe la transconformation de ses voisins. Ce modèle implique de nombreux équilibres entre différentes formes, et semble être de portée plus générale que le modèle concerté qui n'en serait qu'un cas limite. 3.2 - Allostérie covalente Les modifications covalentes réversibles sont des modifications post traductionnelles. Une telle régulation est basée sur le principe du "tout ou rien" ce qui signifie que l'on passe d'une forme inactive à une forme active de l'enzyme ou l'inverse. La plus importante dans la cellule est la phosphorylation. Il s'agit d'une réaction covalente consistant en une estérification de résidus sérine, thréonine voire tyrosine de l'enzyme régulée sous l'effet d'une kinase. La réaction inverse est réalisée par une phosphatase qui permet la déphosphorylation de l'enzyme. En dehors de la phosphorylation d'autres groupements chimiques peuvent permettre de modifier de façon covalente et réversible les enzymes conduisant à des changements d'activités: méthylation, adénylation… Ces réactions sont rapides et contrôlées par l'action extemporanée de messagers chimiques générés dans la cellule sous l'effet d'hormones. Malgré une quantité faible du message hormonal, le messager chimique produit active "en cascade" une série d'enzyme successifs. Ainsi un grand nombre de molécules terminales sont activées et assurent l'effet hormonal. 20 L'enzyme régulatrice peut être l'objet d'une double régulation, allostérique classique d'action fine, immédiate et locale, et par phosphorylation / déphosphorylation provoquée par un signal hormonal qui constitue une réponse cellulaire intégrée à l'échelle de l'organisme. Méthylation: ajout d’un groupement méthyle CH3 par une méthyle transférase Adénylation: ajout d’adénosine par une polymérase 3.3 - Le clivage protéolytique Certaines enzymes sont sécrétées sous forme de précurseurs inactifs, les proenzymes. Ils révèlent leur activité lorsqu'un peptide en est clivé par une protéase spécifique, qui agit généralement sur une paire d'acides aminés basiques. La nouvelle conformation qui en résulte révèle le site actif. C'est un phénomène irréversible qui se déroule une fois au cours de vie de l'enzyme. Ce phénomène a été décrit initialement à propos des enzymes digestifs (exemples: trypsinogène et entérokinase), dont l'activation prématurée pourrait se révéler catastrophique pour les organes sécréteurs tel le pancréas. Il est en fait beaucoup plus général, et représente une des nombreuses modifications post-traductionnelles que peuvent subir les protéines au cours de leur «maturation». Ce processus irréversible est volontiers réalisé en cascade d’activités protéolytiques successives, modulée par de nombreux facteurs facilitateurs et inhibiteurs. De nombreuses fonctions physiologiques élaborées sont ainsi déclenchées. - Polymérisation des fibres de collagène - Coagulation sanguine - Système du complément - Adressage intracellulaire de protéines (coupure de peptides signaux) - Maturation d’isoformes tissu-spécifiques - Maturation de ligands, prohormones (exemples: ACTH, angiotensine), facteurs régulateurs du développement (exemple: EGF) Protéase: enzyme qui clive des peptides spécifiques 3.4 - Isoenzymes Ce sont des protéines ayant une spécificité et des actions enzymatiques identiques ou très voisines tout en ayant des structures primaires différentes. Les isoenzymes sont codées par des gènes différents et leur distribution est tissu-spécifique, inductible au développement. Exemple: la lacticodeshydrogénase (LDH). Il s’agit d’un hétérotétramère composé de 2 chaînes différentes (H pour cardiaque, et M pour musculaire squelettique) dépendant de deux gènes distincts. Les diverses combinaisons font apparaître 5 isoenzymes, identifiables à l'électrophorèse du sérum sanguin sous forme de 5 bandes H4, H3M, H2M2, HM3, M4. Si les enzymes intracellulaires sont identifiées dans le sérum on suspecte une lésion de la cellule (cytolyse) et l'équipement enzymatique spécifique de chaque organe peut aider au diagnostic topographique de la lésion. Exemple: la kinase transformant le glucose en glucose 6-phosphate 2 Isoformes de cette kinase: - Glucokinase (foie) qui permet la mise en réserve du glucose sous forme de glycogène. - Hexokinase (ubiquitaire) qui permet l’approvisionnement énergétique en glucose des cellules. 21 On imagine sans peine la complexité de la réalité cellulaire, avec une concentration éminemment variable des substrats, produits analogues métaboliques compétiteurs et effecteurs allostériques, activateurs ou inhibiteurs. Il faut en outre compter avec une activité modulée par allostérie covalente et l’existence d’isoenzymes compétiteurs. Aucun modèle théorique prenant en compte tous ces paramètres in vivo, n’a pu être réalisé à ce jour. 4 - LES ENZYMES DANS L'ORGANISME 4.1 Classification des enzymes 6 classes ont été définies: 1 - Oxydoréductases (exemples: déshydrogénases, hydroxylases…) 2 - Transférases (exemples: ATP-phosphoryl transférases ou kinases…) 3 - Hydrolases (exemples: osidases, lipases, protéases, nucléases…) 4 - Lyases (exemples: décarboxylases, deshydratases…) 5 - Isomérases (exemples: phosphohexo isomérase, UDP-galactose 4 épimérase…) 6 - Ligases (exemples: carboxylases, peptidyl synthétase, acyl Coenzyme A synthétases…) La nomenclature internationale affecte une série de 4 nombres à chaque enzyme. Par exemple lactate déshydrogénase est notée EC 1. 1. 1. 27 pour la 27ème enzyme dans la série des oxydoréductases, déshydrogénases, à NAD+. 4.2 Enzymologie clinique Les dosages enzymatiques sont un appoint précieux pour le diagnostic et le suivi de nombreuses pathologies. 4.2.1 Cytolyse Qu'il s'agisse de simple souffrance cellulaire, avec perméabilité membranaire excessive aux enzymes cytosoliques ou de destruction complète des cellules par apoptose, avec solubilisation des enzymes des organelles, la cytolyse entraîne une augmentation de leur taux dans le sang. C'est l'indication majeure du dosage enzymatique en biologie clinique (exemple: dosage des transaminases comme marqueur de cytolyse hépatique). 22 4.2.2 Induction enzymatique L'atteinte de certains organes comme le foie peut exagérer la biosynthèse de certaines enzymes (exemple: les phosphatases alcalines dans les rétentions biliaires), et leur taux excessif dans le sang peut donner des indications étiologiques précieuses. 4.2.3 Enzymopathies congénitales On peut évaluer certaines enzymes tissulaires pour étudier les enzymopathies congénitales (exemples: fibroblastes cultivés à partir de cellules amniotiques, globules rouges). 4.3 Organisation intracellulaire des enzymes Les enzymes ne sont pas libres dans la cellule, mais soumises à des relations étroites avec d'autres enzymes ou protéines voisines. Elles voient alors leurs propriétés catalytiques ou allostériques modifiées (allotopie). On observe divers degrés d'organisation selon la solidité et la permanence des relations. 4.3.1 Complexes multienzymatiques Ce sont des assemblages supramoléculaires solides d'enzymes concourant à une même séquence de réactions. Plusieurs exemplaires des divers composants, dont le nombre n’est pas obligatoirement identique, s'associent en édifices d’un poids moléculaire de plusieurs millions, de géométrie semi cristalline, et visibles au microscope électronique. Des groupements prosthétiques jouent volontiers le rôle de bras transporteurs de substrats (exemple: pyruvate déshydrogénase). 4.3.2 Enzymes multifonctionnels Une seule protéine, monomère ou oligomère, présente plusieurs activités enzymatiques, et donc plusieurs sites actifs (de 2 à 7). Là encore, un bras transporteur limite la diffusion des substrats. Les activités enzymatiques, portées par des protéines distinctes chez les organismes inférieurs, ont pu, par exemple par délétions et recombinaisons génétiques, voir les différentes activités réunies en une seule entité protéique au cours de l'évolution (exemples: acide gras synthétase, pyruvate carboxylase). 23 4.3.3 Enzymes immobilisées Certaines enzymes sont attachées aux structures cellulaires (exemples: membranes plasmiques, organelles), de façon permanente ou dépendant de cycles d'activation/inactivation. 4.3.4 Métabolons Srere a nommé ainsi des assemblages d'enzymes agissant séquentiellement dans une chaîne métabolique. Contrairement aux complexes multi-enzymatiques, ils sont fragiles et très difficiles à mettre en évidence du fait de la brutalité des processus d'extraction. Ils ont été de ce fait longtemps ignorés. Ils peuvent être permanents (exemples: cycle de l'urée, cycle de Krebs, β oxydation), temporaires (exemple: glycolyse), impliquer une fixation membranaire et comprendre des enzymes de voies différentes constituant des carrefours. Les substrats subissent le phénomène de tunnelisation (channelling), cheminement préférentiel des substrats de site actif à site actif sans libération dans le milieu intracellulaire. Cette notion nous fait entrevoir la complexité de la matière vivante, où protéines, enzymes et substrats, loin d'être libres et solubles, font partie d'une entité cellulaire unique. Les lois moléculaires que nous apprend la chimie, et établies in vitro, ne sauraient rendre compte de la situation in vivo. 24 A RETENIR ● Liaison enzyme-substrat: spécificité, saturation, inhibition spécifique, anomalies congénitales, régulation ● Liaison enzyme-substrat transforme le substrat en produit qui possède une action biologique ● Protéine enzymatique o Site actif ▪ Lieu de l’enzyme où se fixe le substrat ▪ Part réduite de l’enzyme ▪ Contact entre des acides aminés éloignés sur la séquence primaire grâce à la tertiaire o ▪ Perte de l’activité si dénaturation ▪ Ajustement induit à la suite de la fixation du substrat qui conduira à la transconformation de la protéine Composition du site actif ▪ Acides aminés principaux ou de contact ● ▪ Acides aminés auxiliaires ou collaborateurs ● ▪ Assurent la liaison temporaire du substrat au site actif par des liaisons de faible énergie Créent un environnement favorable à l'action catalytique Acides aminés accessoires ● o o Maintiennent la structure tertiaire pour stabiliser le site actif et n'interviennent pas directement dans l'activité Les enzymes sont majoritairement des protéines mais il existe aussi des formes différentes Homoenzymes ▪ o Constituées uniquement d’acides aminés Hétéroenzymes ▪ Une partie protéiques: apoenzymes ▪ Une partie non protéique: groupements prosthétiques et cosubstrats ● ● ● ● ● Métabolites de faible poids moléculaire Majoritairement non protéique Nécessaire à l’activité enzymatique mais ce n’est pas cette partie qui possède le pouvoir catalytique Groupement prosthétique: cofacteur lié de façon covalente à l’enzyme Cosubstrat: cofacteur lié de façon non covalente à l’enzyme, se comportant comme un substrat 25 ● Catalyse enzymatique o Sans les enzymes qui sont des catalyseurs les réactions biologiques seraient lentes voire impossible o La catalyse est l'action d'un catalyseur sur une transformation chimique o Catalyseur ▪ Augmente les vitesses de réaction ● ● ● ● ● ● ● ● ● ▪ Seuls les chocs efficaces avec un niveau énergétique élevé conduisent à la formation d’un complexe enzyme-ligand Faible proportion des molécules d’une solution possédant une énergie suffisante pour conduire à un choc efficace Une réaction enzymatique ne peut se réaliser que s’il y a acquisition d’une énergie d'activation. L’énergie d’activation est d'autant plus élevée que la réaction a du mal à se produire spontanément Le rôle du catalyseur est d'abaisser la valeur de cette énergie d'activation L’énergie libre ΔG de la réaction n’est pas modifiée par la présence d’un catalyseur Réaction d’ordre 1 o La vitesse de la réaction est directement proportionnelle à la concentration du substrat o La constante de vitesse k sera exprimée en s-1 o Le temps de demi-réaction est constant et indépendant de la concentration initiale en substrat Réaction d’ordre 2 o Vitesse de réaction est fonction de la concentration des deux réactifs o La constante de vitesse k sera exprimée en M-1s-1 o Le temps de demi-réaction est dépendant de la concentration initiale en substrat Pour mesurer une vitesse de réaction il faut être dans les conditions initiales Respecte les conditions thermodynamiques de la réaction ● ● ● ● ● Une réaction endergonique est thermodynamiquement possible seulement avec un apport d'énergie extérieur Une réaction exergonique est thermodynamiquement possible spontanément Une réaction endergonique reste impossible sans apport énergétique malgré l’ajout d’un catalyseur Une majorité de réactions se déroulent à l'équilibre et on a une variation d'énergie libre standard ΔG' = 0 Certaines réactions sont irréversibles si une étape irréversible est franchie. Une enzyme différente est alors nécessaire pour remonter la réaction ▪ Est retrouvé intact en fin de réaction ▪ Agit à l'état de trace 26 ● Cinétique enzymatique o La variation de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique en fonction de la concentration initiale en substrat évolue de façon hyperbolique vers une vitesse maximale o La VMAX représente la saturation de l’enzyme par son substrat o La courbe de saturation est l’expression graphique de l'équation de Michaelis-Menten o Constante de Michaëlis: o KM a la dimension d'une concentration: c'est la 1/2 saturation o La transformation du substrat en produit est lente et impose sa vitesse à la réaction enzymatique o La représentation graphique de l'équation de Michaëlis ne permet pas une mesure précise de VMAX ni de KM o Si tous les sites enzymatiques sont saturés on atteint la vitesse maximale o Si (S) → ∞ et KM est négligeable devant (S) soit (S)>50KM, alors la Vi tend vers la VMAX. La réaction est d'ordre 0. o Si (S) → 0 et (S) est négligeable devant KM alors La réaction est d'ordre 1. o Paramètres moléculaires ▪ L'affinité du substrat pour l’enzyme est d'autant plus forte que la KM est plus basse. ▪ Si (S) >>>> KM, l'enzyme est saturée. ▪ Si (S) > KM ou (S) < KM, l'enzyme n’est pas saturée. ▪ Il y a d'autant plus de produit formé que la concentration en enzyme augmente. o ▪ La vitesse d’action d’une enzyme dépend de la disponibilité de son substrat. ▪ VMAX est une vitesse initiale ▪ L’AEM (Activité Enzymatique Moléculaire) correspond au nombre de molécules de substrat transformées en produit par unité de temps et par molécule d'enzyme dans les conditions de saturation de l'enzyme par son substrat dans des conditions non physiologiques. Dosage enzymatique ▪ L'augmentation de certaines enzymes peut en effet être le signe de la libération du contenu enzymatique d'une cellule à la suite d’une destruction cellulaire. ▪ Les conditions expérimentales doivent être rendues optimales et reproductible. ▪ La mesure de VMAX n'est qu'un reflet de (ET). Elle représente la concentration d'enzyme à la seule condition que les conditions optimales de la mesure soient respectées. ▪ On utilise le dosage massique afin d'évaluer la concentration réelle d'une protéine enzymatique, en s'affranchissant des aléas expérimentaux d'une mesure d'activité. 27 o Effets des agents physiques ou chimiques ▪ La liaison entre l’enzyme et son substrat nécessite une concordance structurale. ● Spécificité de substrat de l'enzyme. ● Spécificité d'action. ▪ Pour que l'ordre de la réaction soit de 0, la réaction doit être réalisée à l’équilibre. ● Une concentration en substrat de 50 fois la KM est satisfaisante. ▪ Température ● ● ● ▪ pH ● ▪ Elle accroît la probabilité de chocs efficaces et accélère les réactions chimiques. Dénaturation thermique limite cette accélération. Courbe présentant un maximum, la température optimale, variable de 10 à 100° C selon les enzymes. L'activité enzymatique varie en fonction du pH avec un pH optimal encadré de deux pH d'arrêt. Inhibiteurs ● Réversibles o Compétitifs ▪ En compétition avec le substrat naturel pour le site actif. o ● ▪ Action est levée par un excès de substrat. ▪ Action spécifique qui semble élever la KM, mais ne touche pas VMAX. Non compétitifs ▪ Ne se lient pas au site actif. ▪ Action pas supprimée par un excès de substrat. ▪ Baisse de la VMAX mais le KM est intact. Irréversibles o Perte des propriétés catalytiques de l'enzyme définitive. 28 ● Régulation o Allostérie ▪ Changement de conformation intervenu dans une protéine à la suite de la fixation d’un effecteur allostérique en dehors du site catalytique: le site allostérique ▪ Effecteurs allostériques activateurs ou inhibiteurs ▪ Transition allostérique qui augmente ou diminue l’activité catalytique de l’enzyme ▪ Modification de la KM apparente pour les enzymes de type K ▪ Rôle fondamental dans la régulation des voies métaboliques ▪ Une enzyme dite Michaelienne possède une courbe de saturation de type hyperbolique ▪ Une enzyme allostérique possède une courbe de saturation dite sigmoïde ▪ L'effecteur inhibiteur aggrave le caractère sigmoïde de la courbe, et élève la KM apparente ▪ o o o L'effecteur activateur en excès rétablit le comportement michaelien normal Allostérie covalente ▪ Modifications covalentes post-traduction ▪ Principe du tout ou rien ▪ Phosphorylation / déphosphorylation réversibles ▪ Réaction rapide, contrôlée et en cascade Clivage protéolytique ▪ Nécessité de cliver un peptide pour activer l’enzyme ▪ Révélation du site actif. ▪ Phénomène irréversible ▪ Modification post-traductionnelle Isoenzymes ▪ Protéines ayant une spécificité et des actions enzymatiques identiques ou très voisines tout en ayant des structures primaires différentes ▪ Codées par des gènes différents ▪ Distribution est tissu-spécifique $$ 29 ● Dans l’organisme o Enzymologie clinique ▪ Cytolyse entraine une libération des enzymes ▪ Certaines atteintes entrainent une biosynthèse excessive de certaines enzymes ▪ o Enzymopathies congénitales Organisation intracellulaire ▪ Complexe multienzymatiques ● ▪ Enzyme multifonctionnelle ● ▪ Une protéine présente plusieurs activités enzymatiques et donc plusieurs sites actifs Enzyme immobilisée ● ▪ Assemblage supramoléculaire solide d'enzymes concourant à une même séquence de réactions Certaines enzymes sont attachées aux structures cellulaires Métabolon ● Assemblage fragile d'enzymes agissant séquentiellement dans une chaîne métabolique 30 QCMs: QCM 1: Parmi les propositions suivantes laquelle ou lesquelles est/sont exacte(s) ? A) En ajoutant un inhibiteur réversible non compétitif, la KM s’élève mais pas la VMAX B) La VMAX n’est pas une vitesse initiale C) Seules les protéines ont une activité enzymatiques D) Les cofacteurs des hétéroenzymes sont de haut poids moléculaires E) Aucune des propositions ci-dessus n’est exacte QCM 2: Parmi les propositions suivantes laquelle ou lesquelles est/sont exacte(s) ? A) Pour une réaction d’ordre 2, la constante de vitesse k sera exprimée en s-1 B) La KM a une unité de concentration C) Un catalyseur modifie l’énergie libre ΔG de la réaction D) Un catalyseur possède 4 caractéristiques: il accélère la réaction, respecte les conditions thermodynamiques de la réaction, est retrouvé intact en fin de réaction et agit à l’état de trace. E) Aucune des propositions ci-dessus n’est exacte QCM 3: Parmi les propositions suivantes laquelle ou lesquelles est/sont exacte(s) ? A) Un effecteur allostérique se fixe sur un site différent du site actif de la protéine B) Enzymes mickaëliennes et allostériques possèdent une courbe de saturation de type hyperbolique C) Les acides aminés accessoires constituants le site actif de la protéine assurent la liaison temporaire du substrat au site actif par des liaisons de faible énergie D) pH et température influent sur la vitesse de réaction E) Aucune des propositions ci-dessus n’est exacte 31 CORRECTION QCMs: QCM 1: Parmi les propositions suivantes laquelle ou lesquelles est/sont exacte(s) ? A) FAUX. En ajoutant un inhibiteur réversible non compétitif, la VMAX est diminuée mais le KM est intacte. Mais si on ajoute un inhibiteur réversible compétitif la KM s’élève mais la VMAX reste intacte. B) FAUX. La VMAX est une vitesse initiale C) FAUX. Certains ARNs et anticorps peuvent avoir une activité enzymatique. D) FAUX. Les cofacteurs sont des métabolites de faibles poids moléculaires contrairement aux protéines. E) VRAI. Réponses : E QCM 2: Parmi les propositions suivantes laquelle ou lesquelles est/sont exacte(s) ? A) FAUX. La constante de vitesse d’une réaction d’ordre 1 s’exprime en s-1 alors que celle d’une réaction d’ordre 2 s’exprime en M-1s-1. B) VRAI. La KM s’exprime en g/L. C) FAUX. Un catalyseur ne modifie pas l’énergie libre ΔG mais abaisse l’énergie d’activation nécessaire à la réalisation de la réaction. D) VRAI. Un catalyseur accélère la réaction en abaissant l’énergie d’activation, une réaction thermodynamiquement impossible le restera malgré le catalyseur, il est retrouvé intact en fin de réaction et agit à l’état de trace. E) FAUX. Réponses : B et D QCM 3: Parmi les propositions suivantes laquelle ou lesquelles est/sont exacte(s) ? A) VRAI. Un effecteur allostérique se fixe sur un récepteur allostérique. B) FAUX. Une enzyme mickaëlienne possède une courbe de saturation de type hyperbolique alors qu’une enzyme allostériques possède une courbe de saturation de type sigmoïde. C) FAUX. Les acides aminés principaux assurent la liaison temporaire du substrat au site actif par des liaisons de faible énergie. Les acides aminés auxiliaires créent un environnement favorable à l'action catalytique. Les acides aminés accessoires assurent le maintien de la structure tertiaire stabilisant le site actif et n'interviennent pas directement dans l'activité. D) VRAI. Il existe une température et un pH optimums pour lesquels la réaction enzymatique est la plus rapide. E) FAUX. Réponses : A et D 32
