Dernier exemple de fermentation : une fermentation qui n’emprunte pas la voie de la Glycolyse : La fermentation hétérolactique : La glycolyse n’est pas la seule voie utilisée pour la fermentation, il existe aussi la voie des pentoses phosphate (voie de Dichens et Horecker). Certaines entérobactéries, des leuconostoc et quelques Lactobacillus peuvent effectuer cette fermentation qui conduit à la formation de l’acide lactique, d’éthanol, d’acétate et de CO2. Cette fermentation est mise en jeu dans la fabrication du kéfir (boisson à base de lait fermenté, légèrement alcoolisée, produite au Moyen-Orient). Mais plus souvent elle conduit à l’altération du vin, de la bière, des jus de fruits… Elle possède en commun avec le shunt des hexoses phosphates, les réactions transformant le glucose en pentose : ribose 5 phosphate et xylulose 5 phosphate. Le xylulose 5 P est ensuite métabolisé différemment, il est scindé en : - 1 composé en C3 : le 3 phosphoglycéraldéhyde qui est transformé en lactate - 1 composé en C2 : l’acétylphosphate qui est transformé en éthanol La fermentation hétérolactique produit du gaz (CO2), elle est moins acidifiante que la fermentation homolactique. Pour ce dernier exemple , il faut connaître le bilan de cette fermentation hétérolactique 2.4 Le catabolisme des autres glucides : Les monosaccharides : Certains peuvent intégrer directement l’une des voies du catabolisme du glucose que l’on vient de voir , après avoir été phosphorylés. C’est le cas du fructose (glycolyse) , du ribose et du xylulose( voie des pentoses phosphate) D’autres seront isomérisés en glucose grâce à l’action d’isomérase. Exemple du galactose : (voie simplifiée) UTP Galactose + ATP Galactose-1-P UDP – galactose ------x Glucose 6 P Les disaccharides : Les enzymes hydrolysant ces diosides sont presque toujours des enzymes inductibles .C’est à dire que leur fabrication ne sera initiée par la bactérie (si elle en posséde bien sur le gène) que si le substrat est présent dans le milieu de culture . - La β fructosidase (saccharase ou invertine) hydrolyse le saccharose : Saccharose - La β galactosidase hydrolyse le lactose : Lactose - Glucose + Fructose Glucose + Galactose La maltase est une α1-4 glucosidase spécifique qui hydrolyse le maltose en 2 molécules de glucose. Les polyosides : La plupart des micromycètes et quelques bactéries sont capables de dégrader les polyosides en secrétant des enzymes hydrolytiques dans le milieu extérieur. Ces produits de dégradation pourront ensuite entrer dans la bactérie et intégrer les différentes voies métaboliques. - L’amidon est dégradé par différentes amylases principalement en glucose et maltose. La cellulose est dégradé par des cellulases en glucose. Hétérosides et dérivés d’oses : Des polyols comme le mannitol ou le sorbitol peuvent être métabolisés dans le métabolisme glucidique. Des hétérosides (comme l’acide hyaluronique présent dans les tissus conjonctifs) peuvent être hydrolysés par des bactéries pathogènes responsables de gangrènes (Clostridium) ou de suppurations (Staphylococcus aureus , Streptococcus pyogenes …). 2.5 Techniques d’étude au laboratoire : L’identification des bactéries repose en grande partie sur l’étude des caractères biochimiques . Ces caractères sont la traduction du métabolisme bactérien (notamment le métabolisme glucidique) d’où l’importance de son étude. Etude de la voie d’attaque du glucose : On utilise les milieux Hugh et Leifson ou MEVAG ( en tube)pour déterminer si la bactérie fermente ou respire les sucres. Le principe général de leur utilisation repose sur la production d’acides à partir des sucres ( en haut du tube car présence d’oxygène pour la respiration , dans tout le tube en cas de fermentation). Ces acides seront décelés par le changement de couleur d’un indicateur coloré de pH ( rouge de phénol , bleu de bromothymol). NB : La galerie API est également un outil utilisé pour déterminer cette voie d’attaque des sucres , etude des fermentations (zymogramme sur API 20 E) , étude de l’assimilation des sucres ( API 20 C AUX). Milieu gélosé en boite permettant de visualiser la fermentation des sucres : Gélose lactosée au BCP , Gélose DRIGALSKY , Gélose de CHAPMAN …. Etudes particulières : Utilisation de milieu complexe contenant plusieurs sucres (gélose kligler en tube contenant du lactose et du glucose). Recherche de l’utilisation du citrate sur gélose de citrate de Simmons ou galerie API (présence du cycle de l’acide citrique = cycle de Krebs chez la bactérie). Etude de la fermentation des acides mixtes et de la production de butane diol ( test RM et VP). Recherche de la Bgalactosidase par le test ONPG. Comme ce test est particulièrement important , nous allons revoir le principe : Une bactérie est capable d’assimiler lelactose (lactose+) si elle est capable de le faire entrer (présence d’une B galactoside perméase) et si elle est capable de l’hydrolyser en glucose et galactose (qui seront métabolisés selon les voies vues précédemment). Le test ONPG a pour objectif de détecter la présence de l’enzyme Bgalactosidase chez les bactéries lactose – ( puisque l’on vient de voir que les lactose + fabriquaient cette enzyme). L’ONPG (OrthoNitroPhénolBGalactoside) est un analogue du lactose qui sera hydrolysé par la Bgalactosidase en Galactoside et Orthonitrophénol de couleur jaune. Les enzymes impliquées dans l’utilisation du lactose sont des enzymes inductibles , ce qui signifie, qu’elles ne seront fabriquées par la bactérie qu’en présence de leur substrat c'est-àdire le lactose. Rechercher la présence de B galactosidase chez une bactérie qui ne s’est pas développée en présence de lactose est donc voué à un résultat négatif. Le lactose est qualifié d’inducteur (il permet la fabrication de ces enzymes , cf opéron lactose) et de Substrat (c’est la molécule subissant l’action de ces enzymes) . L’ONPG n’est que le substrat de la Bgalactosidase , il ne permet pas d’en induire la fabrication d’où la nécessité de faire cultiver la bactérie sur un milieu lactosé avant de réaliser le test. Technique Le test se pratique uniquement chez les bactéries lactose - en 24 h sur milieu solide. A partir : de Kligler ou milieu lactosé BCP ou CLED... réaliser une suspension épaisse des bactéries testées en eau distillée. ajouter avec une pince flambée mais refroidie un disque imprégné d’ONPG. incuber 30 min à 37°C. lire Test ONPG - Test ONPG + Cupule de la galerie API 20 E ONPG -thio-galactoside - Ensemencer avec la suspension d'une colonie en eau distillée (en général) - Lecture identique à la technique classique NB : Il n’est pas nécessaire de prélever une bactérie sur un milieu lactosé car on trouve dans cette cupule e, en plus de l’ONPG , de l’IPTG qui est un inducteur de la B galactosidase. Résumé : Le métabolisme glucidique : La dégradation d’un glucide s’accompagne d’une production d’acide visible par acidification du milieu. Les différentes voies de ce métabolisme sont : - La respiration : Le glucose est oxydé en CO2. - La fermentation : Le glucose est oxydé en acides ou alcools. Les différentes voies de dégradation : De nombreux glucides peuvent être utilisés comme substrat. La plupart sont transformés en glucose qui est dégradé, ensuite, en pyruvate, par la chaîne de la glycolyse. Si le pyruvate est oxydé, il y a utilisation du cycle de Krebs : Pyruvate Acétyl CoA 2 CO2 et énergie Si le pyruvate est réduit, il y a fermentation en anaérobiose : Homolactique : Glucose 2 Pyruvates Lactate Alcoolique : Glucose 2 Pyruvates 2 éthanol + 2 CO2 Hétérolactique : Glucose-6-phosphates ribulose-5-phosphates éthanol et lactate Acide mixte : Glucose 2 Pyruvates succinate, éthanol, etc.… Schéma général du métabolisme énergétique (chimioorganotrophie) ATP (phosphorylation au niveau du substrat) S SH2 Substrat organique oxydé Substrat organique réduit 2 H+ , 2 e(NADH,..) ATP (phosphorylation oxydative) Composés organiques (endogènes) Chaîne de transporteurs d ’électrons RESPIRATION 2 H+ , 2 eAccepteur final: O2 Accepteur final: NO3(SO42-, fumarate) Composés organiques réduits FERMENTATION H2 O RESPIRATION aérobie NO2- + H2O RESPIRATION anaérobie III – Le métabolisme protidique 1 – Hydrolyse des protéines : Les protéines , qui sont des grosses molécules , ne peuvent traverser la paroi des bactéries. Elles devront être hydrolysées par des exoenzymes = protéases secrétées dans le milieu extérieur. L’hydrolyse de ces protéines conduit à la libération de peptides et d’acides aminés qui pourront pénétrer dans la cellule. Ces peptides seront ensuite hydrolysés par des peptidases en acides aminés qui à leur tour seront utilisés , pour la fabrication de nouvelles protéines indispensables à la vie cellulaire ou par exemple en pyruvate qui sera dégradé dans le cycle de Krebs. Ces acides aminés peuvent également être dégradés selon des voies métaboliques particulières (Cf 2) NB : Les bactéries ayant une forte activité protéolytique sont responsables de la putréfaction de la matière organique ( Clostridium , Proteus …). 2 – La dégradation des acides aminés : Elle se fait généralement par décarboxylation ou désamination. Le choix de cette voie de dégradation est lié bien sur à la présence ou non de certaines enzymes mais aussi des conditions environnementales (pH , composition du mileu , présence d’O2 ….). La dégradation de ces acides aminés ne conduit généralement pas à la libération d’énergie , Exception faite de l’arginine dihydrolase. 2.1 – Les décarboxylations : Les décarboxylases sont synthétisées en milieu acide , elles sont inductibles et spécifiques de leur substrat. Certaines de ces enzymes sont recherchées au laboratoire dans le cadre d’une identification bactérienne car le produit de la décarboxylation est une amine qui produira une alcalinisation du milieu . L’utilisation d’un indicateur coloré de pH permettra l’observation de cette augmentation du pH. Exemple : recherche des LysineDC , Ornithine DC et ArginineDC sur milieu de Falkow en tube ou en galerie API20E. NB : Les amines produites seront respectivement : la cadavérine , la putrescine et l’agmatine 2.2 - Les désaminations : Elles correspondent à l’hydrolyse de la fonction amine et la libération d’ammoniac NH3 . L’équation présentée ci-dessous illustre une désamination oxydative qui ne pourra se réalisée qu’en présence d’oxygène (d’où la nécessité de bien dévisser le bouchon quand le test est réalisé en tube). Les désaminases sont des enzymes peu spécifiques de leur substrat. Les LDA , TDA , PDA recherchées au laboratoire sont en fait la même enzyme . Le nom change en fonction du substrat utilisé. NB : Certaines désaminations peuvent se faire sans oxygène , la désamination est alors dite réductrice (ex Clostridium). Elle donne naissance à un acide gras R-CH2-CO2H et de l’ammoniac. 2.3- Deux autres réactions utilisées au laboratoire : Recherche de l’uréase Milieu rouge : bactérie uréase + Mise en évidence de la production d’indole : Apparition d’un anneau rouge après addition du réactif de Kowacs si la bactérie produit de l’indole.
