الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية République Algérienne Démocratique et Populaire وزارة التعليم العالي و البحث العلمي Ministère de l’enseignement Supérieur et de la Recherche scientifique Université Mohamed Khider Biskra Faculté des Sciences Exact et des ScienceS de la Nature et de La Vie Département Des Science De La Vie Et De La Nature Filière : Biotechnologie ET Valorisation Des Plantes « Master 1 » Module: Toxicologie Présenté par : Dirigé par : HAMZAOUI Elhassen DEHIMAT Abdelouahab Année universitaire : 2019 / 2020 I- Introduction La morphine est extraite de l’opium, obtenu à partir des fleurs de pavot. Elle est l’un des médicaments les plus utilisés et les mieux connus pour le traitement de la douleur. Elle fait partie de la liste des médicaments reconnus comme essentiels par l’Organisation mondiale de la santé (OMS). On l’emploie pour soulager des douleurs d’origines diverses: douleurs osseuses chroniques, cancer, ou encore après une opération chirurgicale. Le but du traitement est d’obtenir un soulagement adéquat de la douleur. Ceci est possible dans la majorité des situations. La connaissance du mécanisme d'action et l'étude des relations structure-activité ont abouti à la découverte de nombreux analogues ou morphiniques de synthèse qui présentent encore certains inconvénients de la morphine elle-même, notamment l'accoutumance et la dépendance . donc la morphine et ces analougues sont stupéfiants (tableau B des substances vénéneuses) provoquants des toxicomanies. II- L’INSULINE SYNTHESE ET MODE D’ACTION : II-1- MODE D’ACTION L'insuline comporte plusieurs actions générales, notamment: - A l’Effet de l’insuline, les cellules du foie, des muscles et des tissus adipeux absorbent le glucose sanguin et le convertissent en glycogène pouvant être stocké dans le foie et les muscles. -L'insuline empêche également l'utilisation des graisses comme source d'énergie. En l'absence d'insuline ou dans des conditions où l'insuline est en faible quantitè, les cellules de l'organisme n’absorbent pas le glucose, et le corps commence à utiliser les graisses comme source d'énergie -L'insuline contrôle également d'autres systèmes de l'organisme et régule l'absorption des acides aminés par les cellules de l'organisme. 1 -Il a également plusieurs autres effets anabolisants dans tout le corps. L'insuline est synthétisée en quantités significatives uniquement dans les cellules bêta du pancréas. Il est sécrété principalement en réponse à des concentrations élevées de glucose dans le sang. L'insuline peut donc réguler la glycémie et le corps détecte et répond à l'augmentation de la glycémie en sécrétant de l'insuline. d'autres stimulants tels que la vue et le goût des aliments, la stimulation nerveuse et l'augmentation des concentrations sanguines, les acides aminés et les acides gras, favorisent également la sécrétion d'insuline. Comme l'insuline contrôle les processus métaboliques centraux, l'échec de la production d'insuline est responsable à un trouble appelé diabète sucré. Il existe deux principaux types de diabète - le type 1 et le type 2. Le diabète de type 1 survient lorsque la production d'insuline par les cellules bêta du pancréas est nulle ou très faible. Les patients atteints de diabète sucré de type 1 dépendent de l'insuline externe (injectée le plus souvent par voie sous-cutanée) pour leur survie. Dans le diabète sucré de type 2, les besoins en insuline ne sont pas satisfaits par la quantité produite par les cellules bêta du pancréas. On parle de résistance à l'insuline ou de déficit d'insuline «relatif». Ces patients peuvent être traités avec des médicaments pour réduire leur glycémie ou éventuellement avoir besoin d'insuline fournie par l'extérieur si les autres médicaments ne permettent pas de contrôler la glycémie de manière adéquate. Le diabète est une maladie de longue durée qui entraîne une glycémie élevée. En 2013, on estimait à plus de 382 millions le nombre de personnes atteintes de diabète dans le monde. Diabète de type 1 - le corps ne produit pas d'insuline. Environ 10% de tous les cas de diabète sont de type 1. Diabète de type 2 le corps ne produit pas assez d'insuline pour fonctionner correctement. Environ 90% de tous les cas de diabète dans le monde sont de ce type2. Diabète gestationnel - ce type affecte les femmes pendant la grossesse. 2 II-2 - SYNTHESE DE L'INSULINE NATURELLE L'insuline est synthétisée en quantités significatives uniquement dans les cellules bêta du pancréas. Puisqu'il s'agit d'une structure protéique ou polypeptidique, il est synthétisé comme la plupart des autres protéines via la transcription et la traduction de l'ADN en chaînes d'ARNm et d'acides aminés ou en chaînes polypeptidiques. La protéine subit ensuite des modifications structurelles pour atteindre sa forme finale. Les ètapes de la synthèse d'insuline L'ARNm de l'insuline se traduit par un précurseur à chaîne unique appelé préproinsuline. Ensuite, l’élimination de son peptide signal lors de l’insertion dans le réticulum endoplasmique génère de la proinsuline. La proinsuline comprend trois domaines: • une chaîne B amino-terminale • une chaîne carboxy-terminale A • un peptide de liaison au milieu appelé peptide C Dans le réticulum endoplasmique, la proinsuline est exposée à plusieurs endopeptidases spécifiques qui excisent le peptide C. Cela forme la forme mature del'insuline. L'insuline et le peptide C libre sont emballés dans le corps de Golgi en granules de sécrétion qui s'accumulent dans le cytoplasme L'insuline est constituée de deux chaînes polypeptidiques, les chaînes A et B, liées ensemble par des liaisons disulfure. Cependant, il est d'abord synthétisé sous la forme d'un polypeptide unique appelé préproinsuline dans les cellules β du pancréas. La préproinsuline contient un peptide signal de 24 résidus qui dirige la chaîne polypeptidique naissante vers le réticulum endoplasmique rugueux (RER). Le peptide signal est clivé lors de la translocation du polypeptide dans la lumière du RER, formant de la proinsuline. Dans le RER, la proinsuline se replie dans la conformation correcte et 3 liaisons disulfure sont formées. Environ 5 à 10 minutes après son assemblage dans le réticulum endoplasmique, la proinsuline est transportée vers le réseau trans-Golgi (TGN) où se forment des granules immatures. Le transport vers le TGN peut prendre environ 30 minutes. 3 La proinsuline subit une maturation en insuline active par l'action des endopeptidases cellulaires connues sous le nom de prohormonesconvertases (PC1 et PC2), ainsi que de l'exoprotéase carboxypeptidase E. Les endopeptidases se clivent en 2 positions, libérant un fragment appelé C-peptide et en laissant 2 chaînes peptidiques. , les chaînes B et A, liées par 2 liaisons disulfure. Les sites de clivage sont situés chacun après une paire de résidus basiques (lysine 64 et arginine 65, et arginine 31 et 32). Après clivage du peptide C, ces 2 paires de résidus basiques sont éliminées par la carboxypeptidase. Le peptide C est la partie centrale de la proinsuline et la séquence primaire de la proinsuline va dans l'ordre "B-C-A" (les chaînes B et A ont été identifiées sur la base de la masse et le peptide C a été découvert plus tard). L'insuline mature résultante est conditionnée dans des granules matures dans l'attente des signaux métaboliques (tels que la leucine, l'arginine, le glucose et le mannose) et de la stimulation du nerf vagal pour être exocytés de la cellule dans la circulation. La production endogène d'insuline est régulée en plusieurs étapes tout au long de la voie de synthèse: • à la transcription du gène de l'insuline • en stabilité de l'ARNm • À la traduction de l'ARNm • Dans les modifications post-traductionnelle. 4 III- INSULINE HUMAINE SYNTHÉTIQUE L’insuline humaine synthétique a été la première molécule en or de l’industrie de la biotechnologie et le résultat direct de la technologie de l’ADN recombinant. Actuellement, des millions de diabétiques à travers le monde utilisent de l'insuline synthétique pour réguler leur glycémie. L'insuline synthétique est produite à la fois par des bactéries et par des levures. Insuline humaine est le nom qui décrit l'insuline synthétique qui est développée en laboratoire pour imiter l'insuline chez l'homme. L’insuline humaine a été mise au point dans les années 1960 et 1970 et approuvée pour l’utilisation pharmaceutique en 1982.Avant le développement de l'insuline humaine, une insuline d'origine animale, généralement une forme purifiée d'insuline porcine (de porc), était utilisée. L'insuline humaine est un laboratoire créé en faisant croître des protéines d'insuline dans la bactérie E-coli (Escherichia coli). IV- METHODE La principale méthode utilisée dans la production d’insuline humaine en laboratoire est le génie génétique et l’utilisation de la technique de l’ADN RECOMBINANT. Dans les années 1980, les chercheurs ont utilisé le génie génétique pour fabriquer l’insuline humaine. En 1982, la Eli Lilly Corporation a produit de l’insuline humaine qui est devenue le premier produit pharmaceutique génétiquement modifié approuvé. Bien que l’insuline bovine et porcine soit semblable à l’insuline humaine, sa composition est légèrement différente. Par conséquent, le système immunitaire d’un certain nombre de patients produit des anticorps contre elle, neutralisant ses actions et entraînant des réponses inflammatoires aux sites d’injection. À ces effets néfastes de l’insuline bovine et porcine s’ajoutent les craintes de complications à long terme découlant de l’injection régulière d’une substance étrangère, ainsi que la baisse prévue de la production d’insuline d’origine animale. Ces facteurs ont amené les chercheurs à envisager de synthétiser l’humuline en insérant le gène insulinique dans un vecteur approprié, la cellule bactérienne E. coli, pour produire de l’insuline chimiquement identique à son contrepartie produite. Ceci a été réalisé en utilisant la technologie de l’ADN recombinant. Cette méthode est plus fiable et plus durable que l’extraction et l’épuration du sous-produit de l’abattoir. 5 L’insuline humaine est cultivée en laboratoire à l’intérieur de bactéries communes. Escherichia coli est de loin le type de bactérie le plus largement utilisé, aussi la levure est également utilisée. Les chercheurs ont besoin de la protéine humaine qui produit l’insuline. Les fabricants l’obtiennent grâce à une machine de séquençage des acides aminés qui synthétise l’ADN. Les fabricants connaissent l’ordre exact des acides aminés de l’insuline (les molécules à base d’azote qui composent les protéines). Il y a 20 acides aminés courants. Les fabricants entrent les acides aminés de l’insuline, et la machine de séquençage relie les acides aminés ensemble. Pour synthétiser l’insuline, il faut aussi de grands réservoirs pour faire croître les bactéries, et il faut des nutriments pour que les bactéries croissent. Plusieurs instruments sont nécessaires pour séparer et purifier l’ADN comme une centrifugeuse, ainsi que diverses chromatographies et de cristallographie par rayons X. La synthèse de l’insuline humaine est un processus biochimique en plusieurs étapes qui dépend des techniques de base de l’ADN recombinant et de la compréhension du gène de l’insuline ( figure I et figure II ). L’ADN contient les instructions sur le fonctionnement du corps et un petit segment de l’ADN, le gène insulinique, code l’insuline protéique. Les fabricants manipulent le précurseur biologique de l’insuline pour qu’elle se développe à l’intérieur de bactéries simples. 1) Le gène de l’insuline est une protéine constituée de deux chaînes distinctes d’acides aminés, une A au-dessus d’une chaîne B qui est maintenue avec des liaisons. Les acides aminés sont les unités de base qui construisent toutes les protéines. La chaîne d’insuline A se compose de 21 acides aminés et la chaîne B en a 30 acide aminés. 2) Avant de devenir une protéine d’insuline active, l’insuline est d’abord produite sous forme de préproinsuline. Il s’agit d’une seule longue chaîne protéique avec les chaînes A et B non encore séparées, une section au milieu reliant les chaînes ensemble et une séquence de signal à une extrémité indiquant la protéine quand commencer à sécréter à l’extérieur de la cellule. Après la préproinsuline, la chaîne évolue en proinsuline, toujours une seule chaîne, mais sans la séquence de signalisation. Vient ensuite l’insuline protéique active, la protéine sans la section reliant les chaînes A et B. À chaque étape, la protéine a besoin d’enzymes spécifiques (protéines qui effectuent des réactions chimiques) pour produire la prochaine forme d’insuline. 3) Une méthode de fabrication de l’insuline consiste à cultiver les deux chaînes d’insuline séparément. Cela évitera de fabriquer chacune des enzymes spécifiques 6 nécessaires. Les fabricants ont besoin des deux mini-gènes : un qui produit la chaîne A et un pour la chaîne B. Depuis la séquence exacte de l’ADN de chaque chaîne est connue, ils synthétisent l’ADN de chaque mini-gène dans une machine de séquençage des acides aminés. 4) Ces deux molécules d’ADN sont ensuite insérées dans des plasmides, de petits morceaux circulaires d’ADN qui sont plus facilement pris par l’ADN de l’hôte. 5) Les fabricants insèrent d’abord les plasmides dans un type non nocif de la bactérie E. coli. Ils l’insèrent à côté du gène lacZ. Lacz encode la 8-galactosidase, un gène largement utilisé dans les procédures de recombinaison de l’ADN parce qu’il est facile à trouver et à couper, permettant à l’insuline d’être facilement enlevée afin qu’elle ne se perde pas dans l’ADN de la bactérie. À côté de ce gène est l’acide aminé méthionine, qui commence la formation de protéines. 6) Les plasmides recombinants, nouvellement formés, sont mélangés avec les cellules bactériennes. Les plasmides entrent dans la bactérie dans un processus appelé transfection. Les fabricants peuvent ajouter à la ligase de l’ADN des cellules, une enzyme qui agit comme de la colle pour aider le plasmide à coller à l’ADN de la bactérie. 7) Les bactéries synthétisant l’insuline subissent alors un processus de fermentation. Ils sont cultivés à des températures optimales dans de grands réservoirs dans les usines de fabrication. Les millions de bactéries se reproduisent environ toutes les 20 minutes par mitose cellulaire, et chacune exprime le gène de l’insuline. 8) Après la multiplication, les cellules sont sorties des réservoirs et ouvertes pour extraire l’ADN. Pour ce faire, on ajoute d’abord un mélange de lysozome qui digère la couche extérieure de la paroi cellulaire, puis un mélange de détergent qui sépare la membrane de la paroi des cellules grasses. L’ADN de la bactérie est ensuite traité avec du bromure de cyanogène, un réactif qui divise les chaînes de protéines aux résidus de méthionine. Cela sépare les chaînes d’insuline du reste de l’ADN. 9) Les deux chaînes sont ensuite mélangées ensemble et reliées par des liaisons au disulfure par la réaction de réduction-réoxydation. Un agent oxydant (un matériau qui cause l’oxydation ou le transfert d’un électron) est ajouté. Le lot est ensuite placé dans une centrifugeuse, un dispositif mécanique qui tourne rapidement pour séparer les composants cellulaires par taille et densité. 10) Le mélange d’ADN est ensuite purifié de sorte que seules les chaînes d’insuline restent. Les fabricants peuvent purifier le mélange au moyen de plusieurs techniques 7 de chromatographie ou de séparation qui exploitent les différences de charge, de taille et d’affinité de la molécule par rapport à l’eau. Les procédures utilisées comprennent une colonne d’échange d’ions, une chromatographie liquide haute performance en phase inverse et une colonne de chromatographie par filtration sur gel. Les fabricants peuvent tester des lots d’insuline pour s’assurer qu’aucune des protéines E. coli de la bactérie n’est mélangée avec l’insuline. Ils utilisent une protéine marqueur qui leur permet de détecter l’ADN d’E. coli. Ils peuvent ensuite déterminer que le processus de purification élimine l’E.coli bactéries. 11) À partir de 1986, les fabricants ont commencé à utiliser une autre méthode pour synthétiser l’insuline humaine. Ils ont commencé par le précurseur direct du gène de l’insuline, leproinsuline. Bon nombre des étapes sont les mêmes que pour la production d’insuline avec les chaînes A et B, sauf que dans cette méthode, la machine d’acide aminé synthétise le gène proinsuline. 12) La séquence qui code la proinsuline est insérée dans la bactérie E. coli non pathogène. Les bactéries passent par le processus de fermentation où elles se reproduisent et produisent de la proinsuline. La séquence de connexion entre les chaînes A et B est ensuite séparée par une enzyme et l’insuline qui en résulte est purifiée. 13) À la fin du processus de fabrication, des ingrédients sont ajoutés à l’insuline pour prévenir les bactéries et aider à maintenir un équilibre neutre entre les acides et les bases. Des ingrédients sont également ajoutés à l’insuline intermédiaire et à action prolongée pour produire le type d’insuline de durée désirée. C’est la méthode traditionnelle de production d’insuline à action prolongée. Les fabricants ajoutent des ingrédients à l’insuline purifiée qui prolongent leurs actions, comme l’oxyde de zinc. Ces additifs retardent l’absorption dans le corps. Les additifs varient entre différentes marques du même type d’insuline. Au lieu de synthétiser la séquence exacte de l’ADN pour l’insuline, les fabricants synthétisent un gène insulinique où la séquence est légèrement altérée. Le changement provoque les protéines résultantes à repousser l’autre, ce qui provoque moins d’agglutination. À l’aide de cette séquence d’ADN modifiée, le processus de fabrication est semblable au processus d’ADN recombinant décrit. 8 Figure I : SYNTHESE D’INSULINE HUMAIN Figure II : 9 V- RÉSULTA L’insuline humaine synthétique est généralement considérée comme un meilleur substitut à l’insuline animale. Il est moins cher et est absorbé plus rapidement par le corps humain, Il a plus court ainsi que plus gérable durée de l’efficacité chez la personne affectée et provoque moins de réactions allergiques ou auto-immunes que l’hormone d’insuline animale.d’autre part l’insuline synthétique a certains des effets secondaires tels que le patient peut connaître une léthargie extrême, confusion mentale, perte de mémoire, douleurs articulaires et musculaires, dépression, sentiment général de malaise. VI- DISCUSSION : À l’heure actuelle, il n’est pas facile de dire si nous devrions utiliser de l’insuline synthétique plutôt que de l’insuline animale. Alors que l’insuline synthétique offre plus d’avantages que l’insuline animale, les gens considèrent l’insuline animale comme un traitement naturel, et donc un meilleur choix pour leur corps à long terme. L’insuline synthétique est le plus souvent prescrite et plus facile à obtenir, les patients aimeraient être plus facilement mis à l’information et le choix pour l’insuline animale. 10 VII- CONCLUSION À l’avenir, l’insuline peut être très utile car la technologie est devenue tellement avancée que nous pouvons produire de différentes façons d’utilise et administre de l’insuline dans le corps humain ( cartouche , stylo, la pompe , patch, pilule , aérosol ). la production d'insuline à l'aide de la méthode de l'ADN recombinant réduire la dépendance à l'égard des glandes animales et en utilisant une insuline chimiquement identique à l'insuline humaine. Les chercheurs travaillent à la création des cellules qui produisent l'insuline en laboratoire. L'idée est que les médecins peuvent un jour remplacer les cellules du pancréas inactives par des cellules productrices d'insuline. La thérapie génique est un autre espoir pour les diabétiques. Les scientifiques travaillent sur la correction de la mutation du gène de l'insuline afin que les diabétiques soient capables de produire de l'insuline par eux-mêmes. 11 REFERNCES 1) LIVRESClark, David P, and Lonnie D. Russell.Molecular biology made simple and fun. 2nd ed. Vienna, IL: Cache River Press, 2000. Considine, Douglas M., ed.VanNostrand’s Scientific Encyclopedia.8th ed. New York: International Thomson Publishing Inc., 1995. Dinsmoor, Robert S. "Insulin: A Never-ending Evolution."Countdown (Spring 2001). ShivangiTiwari&Manisha Sharma,International Journal of Research,03 / 11,July 2016. 2) SOURCES WEB Diabetes Digest Web Page. 15 November 2001. < http://www.diabetesdigest.com >. Discovery of Insulin Web Page 16 November 2001. < http://web.idirect.com/~discover >. Eli Lilly Corporation. Humulin and Humalog Development. CD-ROM, 2001. Eli Lilly Diabetes Web Page. 16 November 2001. < http://www.lillydiabetes.com >. Novo Nordisk Diabetes Web Page. 15 November 2001. < http://www.novonet.co.nz >. Medicalnewstoday.com/info/diabetes www.diabetes.org. https://kassandraguiral.wixsite.com/ 12 SOMMAIRE I- INTORDUCTION ……………………………………………………………………01 II- L’INSULINE SYNTHESE ET MODE D’ACTION ……..………….……..02 II-1- MODE D’ACTION …………………………………………………….02 II-2 - SYNTHESE DE L'INSULINE NATURELLE……………………..…04 III- INSULINE HUMAINE SYNTHÉTIQUE……………...…………………..06 IV- METHODE…………………...………………………………………………06 V- RÉSULTAT ……………………………………………………………………11 VI- DISCUSSION ………………………………………………………………….11 VII- CONCLUSION………………………………………………………………….12 13
