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Immunohématologie
Livret 4 d'activités technologiques
A+
Chantal Muller (Professeur - Lycée La Martinière Duchère - LYON )
Remerciements
Mes remerciements vont à tous ceux qui ont permis la réalisation de cet ouvrage, en particulier
certaines de mes collègues, professeurs au lycée La Martinière Duchère de Lyon avec qui j'ai travaillé
avec énormément de plaisir en immuno-hématologie :
Stéphanie Darmochod et Caroline Platroz qui
m'ont aidé à améliorer ces fiches techniques
ont réalisé de nombreux schémas (en particulier Stéphanie)
et ont relu l'ensemble des livrets.
Un remerciement aussi à Christiane Robin,
technicienne de laboratoire au lycée La Martinière Duchère de Lyon,
qui a contribué avec compétence et gentillesse à la mise au point de techniques.
Des remerciements aussi pour Gilles et Sangeetha Muller qui m'ont aidé pour la mise en page.
Avant-propos
Ce livret 4 d'activités technologiques s'adresse aux étudiants de première année de section de
technicien supérieur d'analyses de biologie médicale (B1ABM).
Il correspond au module 4 des activités technologiques d'hématologie du référentiel 2008 du brevet de
technicien supérieur d'analyses de biologie médicale.
Ce livret 4 fait partie de quatre livrets relatifs aux enseignements technologiques d'hématologie de la
section technicien supérieur d'analyses de biologie médicale.
Livret 1 – Cellules normales du sang et de la moelle rouge des os
Livret 2 – Hémopathies
Livret 3 – Hémostase
Livret 4 – Immuno-hématologie
MAI
2012
Sommaire
Introduction à l'immuno-hématologie.........................................................................................................
5
Chapitre 1 – Groupes sanguins
Pré-requis et objectifs.................................................................................................................................
Détermination des groupes sanguins-Généralités .....................................................................................
Fiche 1 – Détermination des groupes sanguins du système ABO ............................................................
Fiche 2 – Exercices: groupage ABO ........................................................................................................
Fiche 3 – Recherche de la substance H dans la salive..............................................................................
Fiche 4 – Groupage Rhésus standard........................................................................................................
Fiche 5 – Phénotypage Rhésus complet....................................................................................................
Fiche 6 – Détermination du groupe érythrocytaire dans le système Kell..................................................
Fiche 7 – Phénotype étendu.......................................................................................................................
7
8
11
18
21
23
31
37
41
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers
Pré-requis et objectifs.................................................................................................................................
Fiche 1 – Recherches des anticorps irréguliers - Généralités ...................................................................
Fiche 2 – Test de Coombs indirect ...........................................................................................................
Fiche 3 – Test enzymatique à la papaïne...................................................................................................
Fiche 4 – Test de Coombs direct ...............................................................................................................
Fiche 5 – Procédure d'identification des anticorps irréguliers (AI) et exercices d'application..................
Fiche 6 – Titrage des anticorps irréguliers de type IgM.............................................................................
Fiche 7 – Titrage des anticorps irréguliers de type IgG.............................................................................
43
44
51
57
61
65
75
77
Chapitre 3 – Techniques en gel filtration
Généralités.................................................................................................................................................. 79
Fiche 1 – Groupage ABO – RH1............................................................................................................... 81
Fiche 2 – Exercices – Interprétations de résultats obtenus en minigel..................................................... 83
Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
Introduction à l'immunohématologie
1 - Généralités
L’immuno-hématologie correspond à l’étude :
- des antigènes portés par les éléments figurés du sang
- de l’immunisation qu’ils peuvent induire.
- des pathologies qui en résultent.
L'immuno-hématologie est donc une partie de la médecine commune à l'hématologie et à
l'immunologie.
Elle concerne l'étude:
– des groupes sanguins
– du système HLA
– des Ac irréguliers (RAI) mis en cause dans les les incompatibilités fœto-maternelles,
transfusionnelles
– d'auto-Ac formés lors de pathologies auto-immunes …
2 - Prélèvement sanguin
Le sang est généralement prélevé sur EDTA ou sur citrate de sodium.
Un prélèvement sur tube sec ne permettra pas la réalisation de tests automatisés.
Les procédures qui concernent les groupes sanguins, et les examens immuno-hématologiques en
général, doivent être rigoureuses, en particulier pour ce qui concerne la prescription des examens et
l'identification des prélèvements.
ATTENTION : Deux déterminations du groupe sanguin sont nécessaires pour obtenir une carte de
groupe sanguin.
La législation précise : deux prélèvements effectués à des moments différents.
Étiquetage des tubes :
L'étiquetage des tubes doit se faire :
➔par la personne qui a prélevé,
➔immédiatement après le prélèvement,
➔sur le lieu du prélèvement,
➔en contrôlant l'identité du patient et en la lui faisant décliner chaque fois que cela est possible.
Les contrôles doivent être particulièrement vigilants chez les sujets comateux et les nouveaux-nés.
L'étiquette doit comporter les informations suivantes: nom du patient, nom de jeune fille, prénoms,
sexe et date de naissance.
B1ABM
CM ©
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Introduction à l'immuno-hématologie
Demande d'examen :
Toute demande comporte les mêmes informations que celles figurant sur l'étiquette ainsi que :
➔les noms du prescripteur et du préleveur,
➔la date et l'heure du prélèvement,
➔et selon les types d'examen, des renseignements complémentaires chaque fois qu'ils sont utiles à la
réalisation correcte de l'analyse et à son interprétation : antécédents d'anticorps anti-érythrocytaires, de
grossesse ou de transfusions, de réactions transfusionnelles.
Le prélèvement doit être stérile, de moins de 7 jours et conservé dans de bonnes conditions à + 4 °C.
Cependant il est souhaitable d'effectuer la détermination du groupe sanguin dès que possible après le
prélèvement. (en aucun cas une hémolyse ne doit être visible).
6
CM ©
B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
- Chapitre 1 Groupes sanguins
Pré-requis :
– Système ABO et système H :
 Structure des Ag érythrocytaires et tissulaires
 Génétique
 Propriétés des Ac plasmatiques
 Règles de transfusion
– Système Rhésus
 Structure des Ag érythrocytaires
 Génétique
 Propriétés des Ac plasmatiques
 Règles de transfusion
– Système Kell
 Structure des Ag érythrocytaires
 Génétique
 Propriétés des Ac plasmatiques
 Règles de transfusion
– Système MNS, Duffy, Kidd, Lewis, Luthéran...
 Structure des Ag érythrocytaires
 Génétique
 Propriétés des Ac plasmatiques
 Règles de transfusion
– Réactions immunologiques d'agglutination
– Propriétés antigéniques des anticorps
• Objectifs :
– Savoir réaliser les tests de groupages et phénotypages sanguins
– Savoir valider les tests réalisés
– Savoir interpréter les tests réalisés
– Connaître les règles de la transfusion
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Introduction à l'immuno-hématologie
Détermination des groupes sanguins
1 - Présentation générale des groupes sanguins
Un certain nombre d’antigènes (plus de 250 connus à ce jour codés par 29 systèmes) sont présents
sur les membranes des hématies humaines.
Ces antigènes sont codés par des gènes correspondants à des systèmes dont la connaissance est
nécessaire dans plusieurs domaines : transfusion sanguine, allo immunisation fœto-maternelle,
transplantation ou études génétiques.
Ces antigènes :
– sont portés par des glycoprotéines et des glycolipides enchâssés dans la membrane des hématies et
dirigés vers l’extérieur de la cellule.
– sont divisés en deux groupes :
1°) Le groupe appelé « ABO et ses associés », pour lequel l'antigène est une glycoprotéine ou
glycolipide.
Les antigènes sont des polyosides et à ce titre ne peuvent être les produits directs de gènes, ceux-ci
ne sachant synthétiser que des protéines. Ils en sont donc le produit secondaire.
Les anticorps sont naturels (réguliers ou irréguliers), appartiennent à la classe des IgM, Ac froids
et complets.. Ils rarement acquis ou immuns (appartenant plutôt à la classe des IgG).
Ce groupe est principalement composé de ABO, Hh, Lewis.
2°) Le groupe appelé « Rhésus (Rh) et ses associés », dans lequel chaque molécule porte une
spécificité propre.
Les antigènes sont des protéines, (donc produits primaires des gènes).
Les anticorps ne sont pas naturels mais immuns ; ils ne sont présents que s’il a existé une
stimulation antigénique interhumaine (grossesse ou transfusion). Il appartient plutôt à la classe des
IgG, Ac chauds et incomplets.
Ce groupe est principalement composé de Rh, Kell, Duffy, Kidd, et MnSs.
2 - Principe des tests et validation technique
Les tests mis en œuvre lors des groupages sanguins (ABO/RH) ou lors des phénotypages sanguins sont
tous basés sur des réactions d'agglutination active directe (si Ac=IgM) ou indirecte (si Ac=IgG).
La validation technique (ou analytique)du typage érythrocytaire repose sur :
–des
résultats conformes des témoins et des contrôles de qualités internes (CQI),
–une absence de double population érythrocytaire.
–un profil réactionnel cohérent,
–une absence de discordance entre deux réalisations,
–une absence de discordance avec des résultats antérieurs éventuels.
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CM ©
B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
3 - Nomenclatures des principaux systèmes et antigènes de
groupes sanguins
Principaux antigènes
Système
Symbole
ABO
ABO
MNS
Rhésus
Kell
Duffy
Kidd
Lewis
Luthéran
B1ABM
MNS
RH
KEL
FY
JK
Le
Lu
Appellation
courante
Nomenclature
internationale
A
ABO1
B
ABO2
M
MNS1
N
MNS2
S
MNS3
s
MNS4
D
RH1
C
RH2
E
RH3
c
RH4
e
RH5
K
KEL1
k
KEL2
Fya
FY1
Fyb
FY2
Jka
JK1
Jkb
JK2
Lea
LE1
Leb
LE2
Lua
LU1
Lub
LU2
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Introduction à l'immuno-hématologie
4 - Principe général des règles transfusionnelles
Avec les groupes ABO, Rh, Kell, Duffy, Kidd, MnS .. dont la connaissance assure la sécurité de la
très grande majorité des transfusions, il est illusoire de penser que la réalisation des transfusions est
« compatibles dans tous les systèmes ».
La sécurité transfusionnelle repose sur le principe général suivant :
Ne pas apporter, par les hématies transfusées :
- un antigène absent chez le receveur (pour éviter que le receveur ne s’immunise à la suite de ces
transfusions).
- un antigène spécifique d' un anticorps présent dans le sérum (plasma) du receveur (pour éviter une
réaction transfusionnelle liée à un conflit Antigène-Anticorps).
En savoir plus
Karl Landsteiner était un biologiste et médecin
autrichien. Il a établit le premier classement des
groupes sanguins, le groupe ABO. (1909)
10
CM ©
B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie
D
Activités technologiques
Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 1
étermination des groupes sanguins
du système ABO
1 - Principe
La détermination des groupes ABO est basée sur le principe général de la réaction d’agglutination
directe active.
AGGLUTINATION : réaction sérologique spécifique entre un Ag particulaire et un Ac aboutissant à la
formation d’un immuncomplexe formant un édifice multiparticulaire (appelé agglutinat) visible à l’œil
nu ou à faible grossissement.
ACTIVE : l’antigène fait partie intégrante de la particule
DIRECTE : les anticorps intervenant sont des anticorps agglutinants (complets – IgM –) provoquant
Cette détermination fait appel à deux épreuves :
 Une épreuve globulaire (de BETH-VINCENT-TZANCK) correspondant à l’identification des
Ag globulaires à l’aide d’anticorps connus (sérums tests).
 Une épreuve sérique (de SIMONIN) correspondant à l’identification des Ac naturels à
l’aide d’Ag connus (globules rouges tests).
C'est la cohérence de ces 2 épreuves qui permet de conclure du groupe sanguin ABO.
B1ABM
CM ©
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1
2 - Matériel
2.1 - Sang à tester
Le sang est généralement prélevé sur EDTA ou éventuellement sur citrate de sodium..
2.2 - Sérums tests
Sérums polvclonaux d'origine humaine provenant de donneurs sélectionnés (= allo-antisérum)
Anticorps monoclonaux d'origine murine (=hétéro-antisérum) :
Sérum test anti-A (coloration bleue)
Sérum test anti-B (coloration jaune)
Sérum test anti-A et anti-B (coloration naturelle du sérum)
« Sérums » d'origine animale ou végétale (= hétérosérum) :
Sérum ou solution test anti-H = sérum d'anguille (xénoantisérum) ou
phytoagglutinine extraite de graines d'Ulex europaeus.
Solution test anti-A1 = phytoagglutinine extraite de graines de Dolichos
biflorus
2.3 - Hématies-tests (hématies étalons lavées et prêtes à l'emploi)
Hématies étalons Al, (Rhésus -)
Hématies étalons A2, (Rhésus -) ne sont plus obligatoires
Hématies étalons B, (Rhésus -)
Hématies étalons 0, (Rhésus +)
Ce sont des hématies humaines prélevées sur anticoagulant. Elles ont été lavées 3 fois en sérum
physiologique puis remises en suspension dans une solution conservatrice.
Les concentrations des suspensions globulaires dépendent de la technique retenue et des indications
données par le fabricant pour chaque réactif
Techniques sur plaque
10% (V/V)
Techniques en tubes à hémolyse
5% (V/V)
Techniques en microtubes (ou microplaque)
1 à 2 % (V/V)
2.4 - Petits matériels
Plaque d’opaline et/ou plaque alvéolée à usage unique.
Pipettes Pasteur ou Psipettes
Agitateur en verre
Tubes de Khan et Portoir.
Centrifugeuse
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B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
3 - Mode opératoire
3.1 - Aspect législatif
Le groupage ABO doit être effectué dans des conditions très précises et rigoureuses. Le GBEA (Guide
de bonne exécution des analyses de biologie médicale) impose les conditions suivantes :
La réalisation du groupage sanguin nécessite :
• une épreuve globulaire de Beth Vincent à recherche des Ag érythrocytaires A (ABO1) et B
(ABO2) avec les Ac monoclonaux anti-A (anti-ABO1) et anti-B (anti-ABO2) et anti-AB (antiABO3)
L’annexe D II précise que :
... Le réactif anti-B utilisé ne doit pas donner de réaction croisée vis-à-vis de l’antigène B acquis.
L’un des deux réactifs, anti- A ou anti-AB, doit pouvoir reconnaître les hématies Ax.
• une épreuve plasmatique de Simonin à recherche des Ac anti-A et Anti-B avec les hématies
tests A1 et B. Au moins une de ces hématies doit être de phénotype RH -1
Une détermination du groupe sanguin : deux définitions
– 1er cas : technique totalement automatisée (groupage + contrôles + enregistrement des
échantillons et des prescriptions):
à 1 détermination = 1 réalisation exécutée par un lot de réactif et un technicien
– 2ème cas : technique manuelle ou semi-automatisée :
 1 détermination = 2 réalisations exécutées par 2 techniciens différents.
La saisie manuelle doit aussi être réalisée par une double saisie par 2 personnes différentes.
Un groupe sanguin valide doit être réalisé sur 2 prélèvements différents, à des temps réellement
différents, à raison d’une détermination par prélèvement.
3.2 - Préparation du sang à grouper
Culot de GR
BVt
BVp
Sang N°
S
B1ABM
2 gouttes de culot
globulaire
18 gouttes d’eau
physiologique
5 gouttes d’eau
physiologique
Suspension à 5 %
Technique en tube
Suspension à 10 %
Technique en
plaque
Plasma
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1
3.3 - Technique sur plaque alvéolée
Réalisation du groupage ABO : épreuve de Beth Vincent et épreuve de Simonin
Épreuve globulaire de Beth vincent
 Déposer une goutte des sérums tests anti-A, anti-B, anti-A+anti-B (et
éventuellement anti-H).
 Déposer une goutte de suspension globulaire à tester.
Épreuve globulaire de Simonin
 Déposer une goutte de suspension globulaire à A1, A2, B.
 Déposer 2 gouttes du sérum à tester.
Épreuve complémentaire : à effectuer uniquement si le test révèle un groupe A ou AB.
 Déposer une goutte des sérums tests anti-A1 et anti-H (ou anti-A1 uniquement si l’antiH est utilisé systématiquement)
 Déposer une goutte de suspension globulaire à tester.
Animer la plaque d'un mouvement de va et vient afin de faciliter l'agglutination.
Laisser reposer 30 secondes. Lire en imprimant un mouvement de « roulis » à la plaque et
compléter par une seconde lecture au bout de 3 minutes.
5.
GR O+
Témoins
Allo
AB
Anti-A
Anti –A1
Anti-B
Anti A
Anti B
Anti-H
Épreuve globulaire (Beth Vincent)
anti-A antianti-B
anti- anti-H
A1*
A+B
GR A1
GR A2
GR B
Ép. sérique (Simonin)
A1
A2*
B
N° …………
auto
Sérum AB
BVp
S
S ang N°….
S uspe nsion 10%
Plasma
* : épreuves complémentaires (non obligatoires par la législation)
Lecture
D’une manière générale, les agglutinats de l’épreuve sérique apparaissent plus lentement que ceux de
l’épreuve globulaire. Noter l’absence ou la présence d’agglutinats et leur intensité.
- « +++ »
1 à 3 énormes agglutinats sur fond clair.
- « ++ » jusqu’à 10 agglutinats sur fond clair.
- « + » très nombreux agglutinats sur fond clair.
- « (+) » innombrables agglutinats à la limite du visible sur fond clair.
- « - » absence d’agglutinats-suspension rosée homogène.
Signaler aussi la présence éventuelle d’une image de double population (notée ++/--) ou d’une
hémolyse partielle.
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B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
3.4 - Technique en tube
Les réactions sont effectuées dans 6 ou 8 tubes de la même façon que pour la technique en plaque,
en utilisant les mêmes volumes de réactifs.
Boucher les tubes.
Agiter légèrement les tubes.
Centrifuger 1 minute à 500 g (environ 1000 rpm).
Lire par remise en suspension des culots.
Épreuve globulaire
Sang N°….
Suspension 5%
Anti-A
Anti - B
Anti-A
Anti-B
Anti-H
Épreuve sérique
AntiA1
GR
A1
GR
A2
GR B
GR O
BVt
Plasma
S
Introduire :
1
goutte
de
suspe nsion
globulaire te st à 5%
2 gouttes de sérum à tester
Introduire :
1 goutte de sérum test
1 goutte de suspe nsion
globulaire à tester à 5%
Modalités de lecture
- « +++ » : le culot se décolle et se dissocie en 3 amas maximum (agglutinat
volumineux non dissocié sur fond clair).
- « ++ » : le culot se dissocie en de nombreux amas volumineux (agglutinat
volumineux sur fond clair).
- « + » : le culot se dissocie en de nombreux petits amas (agglutinat fin sur
fond rosé).
- « - » : suspension homogène (« fumée de cigarette »).
3.5 - Témoins
Le témoin auto est réalisé systématiquement, les témoins AB et allo sont surtout réalisés uniquement
en cas de discordance entre les épreuves globulaires et sériques.
Mais par mesure de sécurité, les 3 témoins seront réalisés systématiquement au cours des groupages
ABO.
➔Témoin « auto » = une goutte de sérum à tester et une goutte de GR à tester
➔Témoin « AB » = une goutte d'un sérum de groupe AB (appelé sérum AB, à ne pas confondre
avec le sérum anti-A + anti-B) et une goutte de GR à tester.
➔Témoin « allo » = 2 gouttes de sérum à tester et une goutte de GR test.
B1ABM
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1
4 - Résultat
4.1 - Validation technique
4.1.1 - Conformité des témoins
La validation du test exige la conformité des témoins
Rôle des témoins :
Témoin auto : (sérum du sujet et GR du sujet) effectué systématiquement. L'absence
d'agglutination témoigne de l'absence d’auto- anticorps (agglutinines froides).
Témoin allo : (sérum du sujet et GR O). L’absence d’agglutination garantit l’épreuve sérique.
S’il y agglutination, il peut démonter la présence d’allo anticorps irréguliers. L’emploi
systématique de ce témoin a été préconisé ci-dessus. Ce témoin, permet de vérifier que le sérum
du sujet ne contient pas d’Ac capables de reconnaître les Ag autres que les Ag A et les Ag B
(Milieu albumineux).
Témoin AB : (sérum « AB » et GR du sujet). L’absence d’agglutination garantit l’absence de
polyagglutinabilité et garantit l’épreuve globulaire. Il n’est pas nécessaire lors de l’emploi
d’anticorps monoclonaux. Ce témoin permet de vérifier que les GR du sujet ne sont pas
reconnus par des Ac autres que les Ac anti-A et Anti-B (Milieu albumineux).
Si un des trois témoins est positif , schématiquement :
-témoin auto + : signifie agglutinines froides ou rouleaux
-témoin allo + : signifie présence d’agglutinines irrégulières
-témoin AB + : signifie polyagglutinabilité
4.1.2 - Conformité des contrôles de qualité internes (CQI)
Des échantillons de contrôle de phénotype garantis sont testés; ces contrôles comprennent au
minimum:
•un échantillon de groupe A
•un échantillon de groupe B
•un échantillon de groupe O
4.1.3 - Conformité des résultats des deux épreuves.
Attention, aucun résultat n’est valable, si la concordance entre les deux épreuves n’est pas
vérifiée.
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CM ©
B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
Résultats obtenus avec les groupes et sous-groupes du système ABO
ÉPREUVE GLOBULAIRE (BETH VINCENT)
GROUPE
A1
A2
B
Anti-A Anti-B Anti-A
+ anti-B
+++
+++
-
++
-
+++
++
+++
ÉPREUVE SÉRIQUE (SIMONIN)
Anti- H AntiA1
Ag
-
+++
A,
A1
++
-
A,
H
B
-
GR A1 GR A2
GR B
GR O
Ac
Anti B
-
-
++
-
-
-
++
-
+++
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
++
-
(+ rare)
Anti B
(anti A1)
Anti A
(+parfois
)
A1B
+++
++
+++
-
+++
A2B
++
++
++
++
-
O
-
-
-
+++
A,
A1,
B
A,
H, B
H
Mise en évidence des Ag membranaires
(+ parfois)
++
(anti A1)
Anti A
Anti B
Mise en évidence des Ac naturels
réguliers
Difficultés du groupage ABO – discordance entre les deux épreuves
Le cas le plus fréquent, et normal, de discordance est l’absence d’Ac naturels chez le nouveau né.
Il existe de nombreuses autres causes de discordance. Il faut alors refaire le groupage après avoir lavé
les hématies du sujet et éventuellement décomplémenté son sérum
(30 minutes à 56°C). Il faut en outre effectuer les témoins AB et allo.
B1ABM
CM ©
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 2
Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 2
Exercices: groupage ABO
1 - Patient (A) adulte
TÉMOINS :
Préciser la composition et
le rôle des témoins
effectués.
Auto
Allo
AB
Aspect
Agglutination :
Épreuve……………................de
………………………………..................................................
Sérum
Sérum
Sérum
Sérum Sérum
Anti-A
Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1
Épreuve……………................de
……………………………......….
GR A1
GR A2
GR B
Interprétation :
Interprétation :
Conclusion
-
Interpréter les deux épreuves puis conclure.
2 - Patient (B) adulte
Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ».
Épreuve……………................de
………………………………..................................................
Sérum
Sérum
Sérum
Sérum
Sérum
Anti-A
Anti-B
Anti A+ B Anti-H
Anti-A1
Épreuve……………................de
……………………………......….
GR A1
GR A2
GR B
Interprétation :
Interprétation :
Conclusion
-
18
Interpréter les deux épreuves puis conclure.
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B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
3 - Patient (C) adulte
Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ».
Épreuve……………................de
………………………………..................................................
Sérum
Sérum
Sérum
Sérum
Sérum
Anti-A
Anti-B
Anti A+B Anti-H
Anti-A1
Épreuve……………................de
……………………………......….
GR A1
GR A2
GR B
Interprétation :
Interprétation :
Conclusion
-
Interpréter les deux épreuves puis conclure.
4 - Patient (D) adulte
Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ».
Épreuve……………................de
………………………………..................................................
Sérum
Sérum
Sérum
Sérum
Sérum
Anti-A
Anti-B
Anti-A+
Anti-H
Anti-A1
anti-B
Épreuve……………................de
……………………………......….
GR A1
GR A2
GR B
Interprétation :
Interprétation :
Conclusion
-
B1ABM
Interpréter les résultats déjà obtenus, donner le groupe présumé en le justifiant et
proposer les résultats (cohérents) de l’épreuve de Beth-Vincent .
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 2
5 - Patient (E) adulte
Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ».
Épreuve……………................de
………………………………..................................................
Sérum
Sérum
Sérum
Sérum
Sérum
Anti-A
Anti-B
Anti-A+
Anti-H
Anti-A1
anti-B
Épreuve……………................de
……………………………......….
GR A1
GR A2
GR B
Interprétation :
Interprétation :
Conclusion
-
Interpréter les résultats déjà obtenus, donner le groupe présumé en le justifiant et
proposer les résultats (cohérents) de l’épreuve de Simonin.
6 - Nourrisson de 2 mois (F)
Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ».
Épreuve……………................de
………………………………..................................................
Sérum
Sérum
Sérum
Sérum Sérum
Anti-A
Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1
+++
+++
+
- Interpréter les deux épreuves puis conclure.
Épreuve……………................de
……………………………......….
GR A1
GR A2
GR B
-
-
-
7 - Patient J adulte
Auto
-
Allo
+++
AB
-
Témoin :
Épreuve……………................de
Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum
Sérum
Sérum
Sérum Sérum
GR A1
GR A2
GR B
Anti-A
Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1
+++
+++
+++
- Conclure d’après les résultats obtenus.
20
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B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 3
R
echerche de la substance H
dans la salive
La substance H (ou AgH « tissulaire ») soluble peut être trouvée dans la salive ou autres liquides
physiologiques d'individus appelés « sécréteurs ».
1 - Principe du test
Il s'agit d'une inhibition d'agglutination (active directe)
2 - Protocole
2.1 - Préparation de l'échantillon de salive
Collecter environ 2 mL de salive fraîche dans un tube de verre
Placer le tube au bain marie bouillant pendant 10 min
Centrifuger le tube fortement pendant 10 min. Utiliser immédiatement le surnageant pour le congeler
immédiatement pour des tests ultérieurs.
2.2 - Préparation de la suspension d'hématies
Préparer une suspension à 3-5% d'hématies de groupe O dans une solution saline isotonique.
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 3
2.3 - Mode opératoire
Dans un tube à hémolyse en verre, verser:
- 3 gouttes (100 µL) de surnageant salivaire
- 1 goutte (100 µL) de anti-H lectin
Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 min
- Ajouter 1 goutte (50 µL) de suspension d'hématies
Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min
Bien mélanger et centrifuger pendant 1 min à 1000 rpm.
Remettre délicatement les hématies en suspension et au-dessus d'un éclairage indirect, observer la
présence éventuelle d'agglutinats.
3 - Questions
- Proposer les génotypes possibles d'un sujet O sécréteurs et d'un sujet O non sécréteur.
- Schématiser, au niveau moléculaire et cellulaire, la réaction sérologique dans le cas où il y a :
➔
présence de substance H (Ag H« tissulaire ») soluble
➔
absence de substance H (Ag H« tissulaire ») soluble
- Expliquer l'expression : « inhibition d'agglutination »
- Relier les expressions suivantes:
Les hématies agglutinent
Les hématies n'agglutinent pas
L'Ag H « tissulaire » a été secrété dans la
salive
L'Ag H « tissulaire » n'a pas été secrété dans
la salive
- Proposer un mode opératoire précis pour préparer 1 mL de suspension d'hématies de groupe O
à 3 % dans une solution saline isotonique.
- Proposer la composition qualitative et quantitative de trois témoins permettant la validation de la
technique. Préciser également le rôle de ces témoins.
- Proposer un tableau récapitulatif présentant la composition de chaque test réalisé et le résultat
attendu des témoins.
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Activités technologiques
Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 4
Groupage Rhésus standard
Il consiste à rechercher l'Ag D (RH1) à la surface des hématies.
Cette recherche s'effectue en association avec la recherche des Ag A (ABO1), B (ABO2) et des Ac
anti-A (anti-ABO1) et anti-B (anti-ABO2) lors du groupage ABO-RH1.
1 - Principes
Recherche des Ag D éventuellement présents à la surface des hématies (épreuve globulaire)
Par agglutination active indirecte (artificielle)
- à l'aide d’un sérum test contenant des Ac antiD (IgG) enrichi en albumine (=artifice) à
37°C.
Par agglutination active directe
à l’aide d’un sérum test contenant des Ac anti-D (IgM) en milieu salin.
-
Les IgG sont :
- non spontanément agglutinant en milieu salin
- des Ac « chauds », nécessitant une température
de 37-40°C.
Les IgM sont :
 spontanément agglutinant en milieu salin
 des Ac « froids », ne nécessitant pas forcément une température de 37-40°C.
Pour obtenir une agglutination des hématies par
les Ac anti-D (IgG)
- un artifice est nécessaire la présence
d’albumine provoque la diminution du
potentiel zêta en masquant les charges négatives
entourant les GR.
- la réaction immunologique s’effectue à 37°C
(utilisation d’un Rhésuscope)
Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-D régulier.
Si une personne Rh- possède des anti-D, ce sont des Ac immuns (irréguliers) – IgG.
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4
Schémas immunologiques
Agglutination active indirecte
Agglutination active directe
Hématies D +
(Rhésus +RH1
(GR du patient)
Z
Z
SENSIBILISATION DES
GLOBULES ROUGES À
TESTER.
ADDITION DE L’ARTIFICE
MILIEU ALBUMINEUX
Sérum test
(Ac anti-D IgG)
Sérum-test
(Ac anti-D –
IgM)
Albumine
AGGLUTINATION
L’artifice entraîne la diminution du potentiel
zêta (Z), en masquant les charges négatives.
La distance entre les hématies diminue 
agglutination des GR par les IgG anti D.
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Activités technologiques
2 - Agglutination sur plaque alvéolée jetable
2.1 - Matériel et réactifs
Agglutination active indirecte
Agglutination active directe
(méthode ancienne )
(méthode actuelle)
Sang à tester : recueilli sur EDTA (généralement).
 à tester rapidement (au plus tard 48 h), sinon conserver à 2-8°C.
Contrôles de qualité internes ou GR témoins : GBEA : [O,RH1 (D+)], [O,RH-1 (D-)
et [O, RH1 faible] est préconisé en plus dans la norme iso15189
- Sérum test anti-D enrichi en albumine
bovine (BSA).
 Ig G anti-D monoclonale humaine
- Sérum témoin ou Rh contrôle sans Ac antiD, mais enrichi en albumine bovine.
Rhésuscope : plaque chauffante (40°C) mobile
autour d’un axe.
- vérifier la température de la plaque au moment
de son utilisation.
Une température supérieure à 45°C provoque
une dessiccation importante des gouttes de
réactifs (fausse réaction positive ou difficulté de
lecture).
GBEA : sérum anti-D monoclonal
D'autres normes préconisent :
-2 sérums anti-D salin contenant des Ac
monoclonaux (IgM) provenant au moins de 2
clones différents.
-1 sérum anti-D ne devant pas détecter l'Ag
variant DVI :sérums tests D(VI+) et D(VI-)
- Sérum témoin Rh contrôle sans anti-D, salin.
Rhésuscope non indispensable
Température de 20°C ou de 40°C
2.2 - Mode opératoire
Annoter correctement la plaque alvéolée.
2.2.1 - Préparation du sang à tester
Dans un tube soigneusement référencé, verser 6 gouttes de plasma et 4 gouttes de culot globulaire à
tester.
37°C
6 gouttes de plasma
Plasma
Culot de GR
4 gouttes de
culot globulaire
Suspension à
40 % dans son
plasma
TECHNIQUE EN
PLAQUE
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4
2.2.2 - Technique : agglutination active directe
Déposer rapidement sur la plaque alvéolée, comme indiqué sur le schéma ci-dessous
Sg
RH1
CQI +
(O,RH1)
Gouttes de
suspension
de GR à 40 %
T
Sg N°
R
T
Sangs
à
tester
T
R
Sg
RH-1
Sg N°
R
T
CQI (O,RH-1)
R
Gouttes de
sérum test
Sérum RH
Anti-D*
contrôle
* En laboratoire, deux sérums tests sont parfois utilisés : sérum-test anti-D(VI+) et anti-D(VI-).
Mélanger et essuyer l’agitateur entre chaque réaction.
Incliner la boîte chauffante d’un angle juste suffisant pour permettre l’homogénéisation des
gouttes.
Poursuivre l’agitation pendant 3 minutes
Effectuer la lecture des agglutinats.
2.2.3 - Contrôles de qualité internes (CQI)
Utilisation d’échantillons de contrôle de phénotype garantis comprenant au minimum:
 un échantillon d'hématies tests de groupe RH1 (avec AgD)
 un échantillon d'hématies tests de groupe RH-1 (sans AgD)
Les normes iso 15189 préconisent en plus:
 un échantillon d'hématies test de groupe RH1 faible (Ag D présent en faible quantité)
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Activités technologiques
3 - Agglutination en tube
Les hématies à tester sont lavés puis préparés en suspension à 3-5% en milieu sérique (dans leur
propre plasma).
Les témoins effectués sont les mêmes que ceux réalisés au cours de la technique en plaque.
Préparer et annoter correctement le nombre de tubes nécessaires.
Introduire dans les tubes 50 µL de GR à tester et 50 µL de sérum test. Boucher les tubes.
Si l’agglutination est active indirecte : incuber 45 minutes au bain thermostaté à 37°C ou à l’étuve
à 37°C (tubes bouchés).
Centrifuger 1 minute à 1000 tours / min (tubes bouchés).
Effectuer la lecture en remettant doucement en suspension le culot d’hématies.
Illustration 1: Résultat d'une agglutination en tube
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4
4 - Lecture et interprétation des résultats
4.1 - Témoins
CQI (+) : hématies [O, RH1] et sérum test anti-D
L’agglutination témoigne de l’efficacité du sérum test anti-D. ce témoin indique également le moment
de lecture des autres tests.
CQI (-) : hématies [O, RH-1] et le sérum test anti-D
L’absence d’agglutination témoigne de la spécificité du sérum test anti-D, et de l’absence de rouleaux
d’hématies pouvant provenir de l’addition éventuelle d’albumine.
Ce témoin limite le temps de lecture, au-delà duquel survient la dessiccation.
4.2 - Lecture des tests
4.2.1 - Témoin (T) :
Composition : hématies à tester et sérum Rhésus contrôle sans anti-D
L’absence d’agglutination vérifie l’absence :
 d’auto-agglutination des hématies provoquée par des auto-Ac (anémie hémolytique autoimmune)
 d’agglutination provoquée par des allo Ac (maladie hémolytique du nouveau né)
 de rouleaux d’hématies.
Si les 3 témoins sont validés  lecture du test R (réaction)
4.2.2 - Test « réaction » (R)
La présence d’une agglutination (réaction positive) atteste de la présence d’AgD à la surface des
hématies à tester ; le sang est alors dit Rh positif (RH1)
L’agglutination doit être nette avec des amas d’hématies bien visibles au centre et en périphérie.
L’absence d’agglutination (réaction négative) indique que les hématies à tester ne possèdent pas l’AgD ; le
sang est dit Rh négatif (RH-1).
L’absence d’agglutination doit être très nette. En cas de doute vis-à-vis de la dessiccation, rajouter une goutte d’eau
physiologique sur la tâche, mélanger avec un agitateur :
 le mélange devient homogène, la réaction est négative
 une agglutination vraie est observée, les amas d’hématies sont plus nettement perçus, la réaction est positive.
Une agglutination faible et retardée signifie que la réaction est douteuse, une présence d’Ag D faible
est possible.
Toute agglutination douteuse sera contrôlée par une réaction plus sensible : test de Coombs indirect.
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Activités technologiques
5 - Recherche de l’Ag D faible et de l'Ag D partiel
Ag D faible : L'Ag D est présent mais en faible quantité à la surface des hématies; par conséquent il
est faiblement ou pas du tout agglutiné par le sérum anti-D.
Faiblement retrouvé dans la population blanche, cet Ag faible est très fréquent dans la population noire.
Les patients possédant l'Ag faible sont considérés Rhésus +.
Ag D partiel : C'est un Ag D incomplet, auquel il manque des épitopes (ex: DIV, DVII etc ...).
Les patients possédant un Ag D partiel sont considérés comme Rh – s'ils sont receveurs et Rh+ s'ils
sont donneurs.
Remarque : une mère ayant un Ag D partiel peut s'immuniser contre un épitope de l'Ag D qu 'elle ne
possède pas, si son enfant possède l'Ag D complet.
Une technique plus sensible de détection de l’AgD, la réaction de Coombs indirecte ou test indirect à
l'antiglobuline (TIA), est utilisée.
L’arrêté du 26 avril 2002 ne mentionne plus l’obligation d’identifier les sujets RH1
faible à l’aide d’un test indirect à l’antiglobuline. Cette décision se base d’une part sur
l’amélioration des performances des réactifs monoclonaux anti-RH1 utilisés au
laboratoire.
Cependant, si dans de nombreux laboratoires d’immuno-hématologie, la recherche de
RH1 faible n’est plus réalisée chez les patients en vue de transfusion, elle est dans la
plupart des cas encore effectuée chez la femme enceinte et le nouveau-né.
5.1 - Principe de la réaction de Coombs indirecte
Il consiste à rechercher un Ag (ex : Ag Du) à la surface des hématies
 par agglutination active indirecte
 à l’aide d’Ac spécifiques (ex : anti-D) en milieu salin.
Les hématies sensibilisées par les Ac sont lavées pour éliminer les Ac non fixés sur les hématies puis
sont agglutinées en présence d’anti-globulines humaines (AGH).
Si les Ac spécifiques sont des Ac « chauds » (IgG), la réaction de sensibilisation s’effectue à 37-40°C
Schéma immunologique : cf. page 30
5.2 - Technique en tube
Préparer une suspension d’hématies à 3-5% en eau physiologique.
Introduire dans 2 tubes, respectivement une goutte de sérum anti-D et une goutte de sérum Rh
contrôle (sans anti-D).
Verser une goutte de suspension globulaire à tester dans chaque tube
Agiter doucement puis incuber 15 min à 37°C.
Laver les hématies 2 fois en eau physiologique et jeter l’eau du dernier lavage.
Ajouter au culot d’hématies, 2 gouttes d’antiglobulines humaines (AGH) polyvalente ou 2
gouttes d’anti-IgG humaine.
Homogénéiser puis centrifuger 1 min à 1000 tours/min
Effectuer la lecture en remettant doucement en suspension le culot d’hématies.
Remarque : On peut effectuer des contrôles de qualité (CQI) positif et négatif à l’aide de suspension
d’hématies témoins [O,RH1] ,[O,RH-1] et [O,RH1 faible].
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4
Schéma immunologique :
recherche de l'Ag D faible
par la réaction de Coombs indirecte
Hématies porteuses de l'Ag D faible.
37°C
Sensibilisation des hématies par des Ac anti-D
(IgG) polyvalents
Élimination des anti-D non fixés par des cycles
de lavage et centrifugation .
Ajout d'une anti-globuline humaine
polyvalente ou d'une anti-IgG
Agglutination active indirecte
(ou artificielle)
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Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 5
Phénotypage Rhésus complet
Ce phénotypage Rhésus complet s'effectue au laboratoire, en association avec la recherche de l'Ag K :
phénotypage RH-KEL1
1 - Principes
Ils reposent sur les mêmes principes d’agglutination que le groupage Rhésus standard.
Recherche des Ag D,C,E,c,e
éventuellement présents à la surface des hématies (épreuve
globulaire)
Par agglutination active indirecte (artificielle)
Par agglutination active directe
à l’aide d’un sérum test contenant des Ac antiD, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e (IgG) enrichi en
albumine (=artifice) à 37°C.
à l’aide d’un sérum test contenant des Ac antiD, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e (IgM) en milieu
salin.
Les IgG sont :
– non spontanément agglutinant en milieu
salin
– des Ac « chauds », nécessitant une
température de 37-40°C.
Les IgM sont :
 spontanément agglutinant en milieu salin
 des Ac « froids », ne nécessitant pas une
température de 37-40°C.
Pour obtenir une agglutination des hématies par
les Ac anti-D (IgG)
- un artifice est nécessaire la présence
d’albumine provoque la diminution du
potentiel zêta en masquant les charges négatives
entourant les GR.
- la réaction immunologique s’effectue à 37°C
(utilisation d’un Rhésuscope)
Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-Dou anti-.... régulier.
Si une personne Rh- possède des anti-D, ce sont des Ac immuns (irréguliers) - IgG
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5
Schémas immunologiques
Agglutination active indirecte
Agglutination active directe
Hématies D +
(RH1))
(GR du patient)
Z
Z
Sérum test
(Ac anti-D ou
anti-C ou … IgG)
ADDITION DE L’ARTIFICE
MILIEU ALBUMINEUX
Sérum-test
(Ac anti-D ou
anti-C ou … - –
IgM)
Albumine
AGGLUTINATION
L’artifice entraîne la diminution du potentiel
zêta, en masquant les charges négatives.
La distance entre les hématies diminue :
 agglutination des GR par les IgG anti-D.
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Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
2 - Agglutination sur plaque alvéolée jetable
2.1 - Matériel et réactifs
Agglutination active indirecte
Agglutination active directe
Sang à tester : recueilli sur EDTA (généralement).
 à tester rapidement (au plus tard 48 h), sinon conserver à 2-8°C.
CQI : hématies tests phénotypées (cf.§2.2.2)
Sérum test enrichi en albumine bovine (BSA).
 Ig G anti-D monoclonale humaine
Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c,
Anti-e
Sérum salin contenant des IgM monoclonaux :
 Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c,
Anti-e
Sérum témoin ou Rh contrôle sans Ac anti-D,
mais enrichi en albumine bovine.
Sérum témoin Rh contrôle sans anti-D, salin.
Rhésuscope : plaque chauffante (40°C) mobile
autour d’un axe.
- vérifier la température de la plaque au moment
de son utilisation.
Une température > 45°C provoque une
dessiccation importante des gouttes de réactifs
(fausse réaction positive ou difficulté de lecture)
Rhésuscope non indispensable
Température de 20°C ou de 40°C
Les sérums tests utilisés : Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c, Anti-e.
2.2 - Mode opératoire
Certains sérums test utilisés comportent des IgG : par conséquent la technique s’effectuera en milieu
albumineux et à 37°C (Rhésuscope) : il s’agit alors d’une agglutination active indirecte.
2.2.1 - Préparation du sang à tester
Préparer dans un tube soigneusement référencé, un échantillon du sang à grouper, en plaçant 6 gouttes
de plasma et 4 gouttes de culot globulaire, de manière à obtenir une suspension à 40 % dans son
plasma. (milieu albumineux).
2.2.2 - Témoins et contrôles de qualité internes
D'après le GBEA, chaque sérum-test doit être validé à l'aide d'hématies tests phénotypées CQI+ et
CQI-.
Un témoin (T Rh) doit être réalisé pour chaque lot d'hématies phénotypées utilisées . Ceshématies ne
doivent pas agglutiner dans le sérum rhésus contrôle (sans Ac du système Rhésus). Ce sérum contrôle
Rh est salin si les sérums tests utilisés sont salins, il est albumineux, si les sérums tests sont
albumineux.
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5
Validation du sérum test anti-DCE
à l'aide des hématies tests :GR-CQI (+) [D+,C+,c+,E+,e+] et GR-CQI (-) [D-,C-,c+,E-,e+]
Schéma de la plaque :
GRCQI+
GRCQI-
CQI (+)
2 gouttes de
suspension de
GR à 40 %
1
T Rh*
CQI (-)
3
2
4
T Rh*
R
R
1 goutte de
sérums tests
Sérum Rh
contrôle
Anti-DCE
Validation du sérum test anti-C (anti-RH2)
à l'aide des hématies tests : T+ [C+, c+] ou RH:2,4
et T- [C-, c+] ou RH:-2,4
La technique est la même que précédemment, le sérum test anti-DCE est remplacé par le sérum test
anti-C.
Validation du sérum test anti-E (anti-RH3)
à l'aide des hématies tests : T+ [E+, e+] ou RH:3,5
et T- [E-, e+] ou RH:-3,5
Validation du sérum test anti-c (anti-RH4)
à l'aide des hématies tests : T+ [C+, c+] ou RH:2,4
et T- [C+, c-] ou RH:2,-4
Validation du sérum test anti-e (anti-RH5)
à l'aide des hématies tests : T+ [E+, e+] ou RH:3,5
et T- [E+, e-] ou RH:3,-5
2.2.3 - Phénotypage
- Si le Rh standard est connu (cas général), il est inutile de tester les hématies du patient
avec le sérum test anti-D
- Si le Rh standard est positif (individu RH-1), il est inutile d'utiliser le sérum anti-DCE.
Le phénotypage avec les sérums anti-D, anti-C, anti-c, anti-E et anti-e, sont à
effectuer en fonction des résultats obtenus avec le sérum testé précédemment. Il faut
être logique et chronologique.
Il existe un antithétisme, c'est-à-dire que le globule rouge porte soit C, soit c soit les
2 et soit E, soit e, soit les 2. Il faut donc effectuer le phénotypage en tenant compte
de ces données.
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Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
Schéma de la plaque :
Sg N°
1
2 gouttes de T Rh
suspension à
40 %
2
DCE
3
D
4
C
5
c
6
E
7
e
Anti-c
Anti-E
Anti-e
1 goutte de
sérum test
Sérum Rh
contrôle
Anti-DCE
Anti-D
Anti-C
 Mélanger sans attendre à l'aide d'un agitateur bien propre.
 Agiter en inclinant doucement la plaque sur le rhésuscope par des mouvements lents de balancier pendant 1 à 3 min environ.
 Observer s'il y a agglutination ou pas.
3 - Résultats et interprétation
3.1 - Contrôles de qualité internes (CQI) et témoin
CQI positifs :
Ces contrôles doivent présenter une agglutination. Ils contrôlent l’efficacité des réactifs..
Ce témoin indique également le temps de lecture. Dès que l’agglutination apparaît pour le sang témoin
positif, on peut lire les sangs à tester.
CQI négatifs :
Ce témoin ne doit pas présenter d’agglutination. Ils contrôlent la spécificité des sérums tests,
l’absence de rouleaux due à l’addition d’albumine et enfin limite le temps de lecture (au-delà de
laquelle survient la dessiccation).
Témoin Rh ou témoin effectué avec le sérum test albumineux
Ce témoin doit être négatif, c'est-à-dire, ne doit pas présenter d’agglutination.
Une image de rouleaux ou d’agglutination de cette goutte interdit toute interprétation de la lecture de la
réaction elle-même.
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5
3.2 - Lecture des tests
Lecture de la réaction :
La réaction ne peut être lue que si tous les témoins sont corrects.
- Agglutination : La réaction est positive. L’agglutination doit être nette avec des
amas de globules rouges aussi bien visibles au centre qu’à la périphérie de la tâche.
Cela signifie que le globule rouge porte l’Ag correspondant au sérum utilisé.
- Absence d’agglutination : La réaction est négative. L’absence d’agglutination doit
être très nette. En cas de doute vis-à-vis de la dessiccation, rajouter une goutte d’eau
physiologique sur la tâche, mélanger avec l’agitateur.
Cela signifie que le globule rouge ne porte pas l’Ag correspondant au sérum utilisé.
4 - Mode opératoire - technique en tube
La technique se conduira selon le même principe que la technique en tube du groupage Rhésus.
Les hématies sont lavées puis mises en suspension à 5 % en eau physiologique et les tubes placés
à température ambiante.
5 - Fréquence des haplotypes
Haplotype
DCe (R1)
Fréquence
en France
42
FRÉQUENTS
dce (r)
DcE (R2)
39
13
Dce (R0)
2
RARES
dCe (r’)
dcE (r’’)
1
0,05
TRÈS RARES
DCE (Rz) dCE (ry)
0,03
0
Astuces mnémotechniques pour retenir les 3 haplotypes les plus
fréquents : écrire, comme ci-dessous dans les cases, les allèles D,d,C,c,E,e dans l'ordre
alphabétique et en respectant la casse.
CD e
36
c d e
CM ©
c
DE
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Module 4 – Immuno-hématologie
D
Activités technologiques
Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 6
étermination du groupe érythrocytaire
dans le système Kell
Il est effectué au laboratoire en association avec le phénotypage Rhésus :
RH-KELL1
1 - Généralités
Le système Kell correspond à un ensemble de couples d'allèles codominants et antithétiques:
• les allèles K et k codant pour 2 Ag principaux K (KEL1) et k (KEL2)
• les allèles Kpa et Kpb codant pour les Ag Kpa (KEL3) de faible fréquence et l'Ag Kpb (KEL4), très
largement répandu.
1.1 - Antigènes K et k, deux Ag antithétiques principaux
Les antigènes Kell ou K ou encore KEL1 (nomenclature internationale)
et cellano ou k ou encore KEL2 (nomenclature internationale)
sont codés par des allèles codominants et antithétiques, par conséquent il existe trois phénotypes
courants :
 K- , k+ ou KEL-1,2 (génotype k//k). Ils représentent 91% de la population caucasoïde.
 K+, k+ ou KEL1,2 (génotype K//k). Ils représentent 9 % de la population.
 K+, k- ou KELL1,-2 (génotype K//K). Ils représentent 0,02 % de la population.
Ces derniers ne possèdent donc pas l’antigène de grande fréquence k ou Cellano (possédé
par 99,98% de la population blanche).
Dans la pratique courante des laboratoires, la recherche se limite à l’Ag Kell car il est après l'Ag D le
plus immunogène des antigènes de groupes sanguins.
Transfusions:
– Un sujet K+, k+ pourra recevoir tous types de phénotype Kell, puisqu’il ne pourra s’immuniser
contre aucun des deux antigènes.
– Un sujet K-, k+ doit recevoir du sang K-. Dans le cas contraire on prend le risque de l’immuniser et
de lui faire produire un anti-K, ce qui se produira statistiquement dans un tiers des cas.
– Un sujet K+, k- doit déjà être considéré comme un « receveur dangereux » car l’allo anti-k qu’il est
susceptible de développer est un anticorps « anti-public » c’est à dire dirigé contre un antigène de
grande fréquence dans la population (ici 99,98%) c’est à dire qu’il rendra toute transfusion ultérieure
incompatible.
Conséquence : Si le receveur est K+, il faut vérifier qu'il possède aussi l'Ag k (agglutination de ses
hématies avec un sérum anti-k), afin de s’assurer que les deux antigènes sont bien présents et que ce
sujet ne doit pas être considéré comme un « receveur dangereux ».
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37
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 6
1.2 - Anticorps du système Kell
Ce sont, comme les anti-RH des anticorps :
immuns, nécessitant donc une stimulation (lors de transfusion ou lors d'une grossesse)
IgG, Ac incomplet, chaud
à propriétés hémolysantes en présence de complément (hémolysines)
traversant le placenta
n'activant pas le complément.
Conséquences: Ils peuvent donner des hémolyses intra-tissulaires et être responsables d’accidents
hémolytiques de transfusion.
Ils peuvent être aussi à l’origine d’une incompatibilité fœto-maternelle.
2 - Principes
Les principes sont les mêmes que pour la recherche des Ag Rhésus.
• 1er principe : si le réactif anti-KEL1 est d'origine polyclonal (IgG)
La présence d'Ag K est recherchée à la surface des hématies d'un patient par agglutination active indirecte à l'aide d'un réactif anti-K enrichi en albumine à 37°C. (épreuve globulaire uniquement).
• 2ème principe : si le réactif anti-KEL1 est d'origine monoclonal (IgM)
La présence d'Ag K est recherchée à la surface des hématies d'un patient par agglutination active directe à l'aide d'un réactif anti-K en milieu salin et à température du laboratoire. (épreuve globulaire
uniquement).
Les agglutinations peuvent être réalisées en plaque, en tube, en microplaque ou en gel.
Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-K régulier.
Si une personne K- possède des anti-K, ce sont des Ac immuns (irréguliers) – IgG
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Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
3 - Agglutination active directe en plaque alvéolée
3.1 - Mode opératoire
Annoter correctement la plaque alvéolée.
3.1.1 - Préparation du sang à tester
Dans un tube soigneusement référencé, verser 6 gouttes de plasma et 4 gouttes de culot globulaire à
tester.
37°C
6 gouttes de plasma
Plasma
4-5 gouttes de
culot globulaire
Culot de GR
Suspension de GR à
40 % dans son plasma
TECHNIQUE EN PLAQUE
3.1.2 - Technique
• Déposer rapidement sur la plaque alvéolée, comme indiqué sur le schéma ci-dessous.
CQI – (O,K-)
Gouttes de
suspension
de GR à 40 %
Sg N°
Sg T-
T
R
T
Sangs
à
tester
R
Sg N°
T
Sg T+
R
T
CQI + (O,K+)
R
Gouttes de
sérum test
AntiKEL1
Sérum Kell
contrôle
• Si nécessaire, allumer le rhésuscope, vérifier la température et poser la plaque
• Mélanger et essuyer l’agitateur entre chaque réaction.
• Incliner la boîte chauffante d’un angle juste suffisant pour permettre l’homogénéisation
des gouttes.
• Poursuivre l’agitation pendant 3 minutes
• Effectuer la lecture des agglutinats.
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 6
3.1.3 - Contrôles qualité internes (CQI)
Utilisation d’échantillons de contrôle de phénotype garantis comprenant au minimum:
➢ un échantillon de groupe K + (KEL1)
➢ un échantillon de groupe K - (KEL-1).
4 - Lecture et interprétation des résultats
4.1 - Contrôles de qualité internes
CQI positif : hématies [O, K+] et sérum test anti-K
L’agglutination témoigne de l’efficacité du sérum test anti-K. ce témoin indique également le moment
de lecture des autres tests.
CQI négatif : hématies [O, K-] et le sérum test anti-K
L’absence d’agglutination témoigne de la spécificité du sérum test anti-K, et de l’absence de rouleaux
d’hématies .
Ce témoin limite le temps de lecture, au-delà duquel survient la dessication.
4.2 - Lecture des tests
4.2.1 - Témoin (T) :
Composition : hématies à tester et sérum Kell contrôle sans anti-K
L’absence d’agglutination vérifie l’absence :
- d’auto-agglutination des hématies provoquée par des auto-Ac (anémie
hémolytique autoimmune)
- d’agglutination provoquée par des allo Ac (maladie hémolytique du nouveau né)
- de rouleaux d’hématies.
Si les 3 témoins sont validés  lecture du test R (réaction)
4.2.2 - Test « réaction » (R)
La présence d’une agglutination (réaction positive) atteste de la présence d’AgK à la surface des
hématies à tester ; le sang est alors dit K positif (KEL1)
L’agglutination doit être nette avec des amas d’hématies bien visibles au centre et en périphérie.
L’absence d’agglutination (réaction négative) indique que les hématies à tester ne possèdent pas l’Ag
K ; le sang est dit K négatif (KEL-1).
L’absence d’agglutination doit être très nette. En cas de doute vis-à-vis de la dessication, rajouter une
goutte d’eau physiologique sur la tâche, mélanger avec un agitateur :
- le mélange devient homogène, la réaction est négative
- une agglutination vraie est observée, les amas d’hématies sont plus nettement
perçus, la réaction est positive.
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Activités technologiques
Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 7
Phénotype étendu
1 - Définition de l'analyse
Cette analyse consiste à rechercher un ou plusieurs antigènes érythrocytaires autres que ceux qui sont
définis par le groupage ABO.RH1 et par le phénotypage RH-KEL 1.
Ag recherchés
En général, on se limite aux Ag des systèmes Duffy, Kidd et MNS, mais d'autres Ag peuvent aussi
être recherchés.
–
–
–
–
–
–
Rhésus
Duffy
Kidd
MNS
Lewis
P
Ag Cw (RH8),
Ag Fya (FY1), Fyb (FY2)
Ag Jka (JK1) ,Jkb(JK2)
Ag M (MNS1), N (MNS2), S(MNS3), s (MNS4)
Ag Lea (LE1), Leb (LE2)
Ag P1
2 - Indication du phénotypage étendu
Il est indiqué :
- chez tout sujet présentant une allo-immunisation post-transfusionnelle, dans le but de prévenir la
production de nouveaux anticorps qui rendraient difficiles la sélection de culots globulaires
compatibles lors de transfusions ultérieures,
- chez la femme jeune avec antécédent d’immunisation fœto-maternelle,
- dans les hémopathies chroniques (thalassémie, drépanocytose, anémies réfractaires) ou malignes. Il
est important de déterminer le phénotype étendu de ces sujets dès le diagnostic et avant les premières
transfusions, car les transfusions répétées ultérieures vont gêner le phénotypage.
3 - Mise en œuvre et contrôles de qualité internes
La recherche de chaque antigène est basée sur l'utilisation du réactif spécifique et du témoin adéquat.
Le système analytique doit être contrôlé en utilisant, pour chaque spécificité, deux échantillons de
contrôle de phénotypes garantis (typage obtenu par un processus analytique différent de celui qui doit
être contrôlé par ces échantillons).
L'un de ces échantillons doit être négatif et l'autre d'expression «hétérozygote».
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 7
Illustration 2: Carte de groupe sanguin
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- Chapitre 2 Anticorps irréguliers
Pré-requis :
–
–
–
Structure et propriétés des IgM et IgG
Propriétés des Ac des systèmes érythrocytaires Rhésus, Duffy, Kidd ; MNS, Lewis, Luthéran, P
....
Réactions sérologiques d'agglutination
Objectifs :
–
–
–
Connaître les risques encourus par un patient possédant des anticorps plasmatiques
Savoir réaliser une recherche d'anticorps irréguliers dans le plasma
Savoir interpréter les tests de recherche des anticorps irréguliers
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 1
R
echerche des Anticorps irréguliers
Généralités
1 - Rappel – Définitions
Anticorps circulant (Ac) : immunoglobuline (Ig) capables de se fixer
spécifiquement à l'antigène (Ag) qui a induit sa formation.
Les classes d'Ig : IgG, IgM, IgE, IgA et IgD
Ac naturels
(apparaissent spontanément
- ne sont pas le
produit d’immunisation par des Ag)
Il s'agit généralement d'IgM
Ac immuns
(sont le produit d'une stimulation
immunitaire par des Ag du non soi)
Il s'agit généralement d'Ig G
Ac réguliers
(Toujours présents en l'absence de l'Ag
spécifique)
Ac irréguliers
(pas toujours présents en absence de l'Ag
spécifique)
Donc : 2 types d'Ac irréguliers
 Ac immuns (toujours irréguliers)
 Ac naturels irréguliers
Caractéristiques sérologiques
Ac naturels
Ac immuns
Apparition
sans pré-immunisation apparente
préalable
après immunisation (contact
avec l'Ag)
Présence
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réguliers
irréguliers
toujours irréguliers
optimum thermique
0 à 20°C (Ac froids)
37°C (Ac chauds)
fixation du complément
transfert placentaire
classe d'Ig
++
non
IgM
+
oui
IgG
pouvoir agglutinant
agglutination directe
(Ac complet)
agglutination indirecte
(Ac incomplet)
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Activités technologiques
2 - Origine de la présence d'Ac irréguliers chez un patient
2.1 - Ac naturels irréguliers
Ces Ac apparaissent sans pré-immunisation apparente chez des sujets de phénotypes particuliers, c'est
à dire ne possédant pas l'Ag correspondant.
Ex: Sujet Le a (–) peut posséder des Ac naturels irréguliers anti-Le a.
Il s'agit le plus souvent d'IgM.
Exemples : anti-Lea , anti-Leb , anti-M, anti-N, anti-P1........
Ces anticorps dits « froids », ont un optimum thermique situé à basse température. Cependant même à
37°C leur dangerosité est grande, ils se fixent sur l’hématie possédant l'Ag spécifique, activent le
complément, puis peuvent s’éluer (se décrocher) de l’hématie et revenir dans le plasma. L’activation
du complément est en général totale, jusqu’à la fraction C9 perforant la cellule, ce qui entraîne une
hémolyse intra-vasculaire avec libération d’hémoglobine libre dans le plasma. Celui ci aura donc une
couleur rouge « laquée », et les urines seront foncées (voire noires).
Les complications majeures à redouter sont la coagulation intra-vasculaire disséminée (CIVD) et
l’oligoanurie puis l’anurie.
2.2 - Ac immuns irréguliers
Dans ce cas, un sujet en contact avec un Ag qu'il ne possède pas, s'immunise vis à vis de cet Ag et
acquière un Ac immun (donc irréguliers).
Ex. sujet Rhésus - qui après contact avec l'Ag D acquière des Ac immuns irréguliers anti-D.
Il s'agit le plus souvent d'IgG
Ex : Ac anti-D, anti-C, anti-c, anti-E, anti-e, anti-Kell, anti-Kidd etc....)
Ces anticorps dits « chauds », ont un optimum thermique situé autour de 37 - 40°C, se fixant sur
l’hématie possédant l'Ag spécifique. Les hématies ainsi sensibilisées seront phagocytées par les
macrophages, ceux-ci ayant un « récepteur aux IgG ». Il s’agit donc ici d’une hémolyse « intratissulaire » qui aura pour conséquence une dégradation de l’hémoglobine en bilirubine, avec
l’apparition d’un ictère.
2 types d'allo-immunisation sont possibles :
– allo-immunisation post-transfusionnelle
– allo-immunisation fœto-maternelle
2.2.1 - Allo-immunisation post transfusionnelle
Un receveur peut s'immuniser contre des Ag provenant du donneur.
Ex: receveur Rhésus standard (-) peut acquérir après transfusion de sang d'un donneur Rhésus (+)
des Ac anti-D.
Dans le système Rhésus, l'Ag D est le plus immunogène, suivi de l'Ag E et c.
Dans les autres systèmes, les Ag peuvent être aussi immunogènes et conduire à la production
d'Ac irréguliers chez le receveur. anti-Rh > anti-Le > anti-Pl > anti-Kell
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités
2.2.2 - Allo-immunisation fœto-maternelle
Allo-immunisation fœto-maternelle la plus fréquente :
◊ Mère: Rhésus (-) enceinte d'un enfant Rhésus (+)
En fin de grossesse ou lors de
l'accouchement, il arrive que des hématies de
l'enfant rhésus (+), porteur de l'Ag D passe
dans le sang de la mère.
LB
L'Ag D représente pour la mère un Ag du nonsoi. Le système immunitaire s'active et produit
des anti-D, Ac irréguliers immuns.
D'autres allo-immunisations existent :
- Dans le système Rhésus : Ac irréguliers anti- c, anti-E,...
- Dans le système Kell : Ac irrégulier anti-K et dans les autres systèmes: Duffy, Kidd....
N.B.: des allo-immunisations fœto-maternelles peuvent aussi avoir lieu avec des Ag plaquettaires de
l'enfant.
Remarque :
Dans les 2 cas d’allo-immunisation, la synthèse d’Ac irréguliers ne porte pas à
conséquence dans l’immédiat.
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Activités technologiques
3 - Conséquences néfastes dues à la présence d'Ac irréguliers
3.1 - Chez les receveurs de sang (ou d'organe)
Les Ac irréguliers du receveur peuvent se fixer sur les hématies (Ag) du donneur :  accident
transfusionnel.
Exemple : Receveur Rh (–) possédant déjà des Ac irréguliers anti-D (acquis lors d’une 1ère
immunisation) recevant du sang d'un donneur Rh (+).
Cette fixation peut avoir 2 conséquences:
✔ Hémolyse intravasculaire aiguë – cf. cours «Les hématies » B1ABM (rares dans le cas des Ac
irréguliers). L'immun complexe formé active le complément jusqu'au stade de formation du
complexe d'attaque membranaire lysant les hématies du donneur dans le système circulatoire.
Exemple: anti-JKa (Ac perfide et dangereux)
✔
Hémolyse intratissulaire – cf. cours « les hématies» B1ABM (le plus souvent avec des Ac
irréguliers de type IgG). Les Ac irréguliers se comportent comme des opsonines et facilitent la
phagocytose des hématies du donneur au niveau du foie ou de la rate.
Exemple : anti-D
L’hémolyse dépend de l’Ac, de l’Ag et de la capacité phagocytaire des phagocytes.
Du fait des 2 possibilités, hémolyse intravasculaire ou intratissulaire, la traduction clinique est très
variable : accident hémolytique immédiat  transfusion sans bénéfice.
La prévention des accidents post-transfusionnels nécessite :
• le groupage du sang du receveur
– groupage ABO et Rh standard (ABO-RH1) pour une transfusion
– phénotypage standard -Rhésus complet et Kell - (RH-KEL1) chez les femmes en âge de
procréer (prévention de la maladie hémolytique du nouveau-né).
– phénotypage étendu à d’autres systèmes (Kidd, Duffy, ...) pour les polytransfusés
• la recherche des anticorps irréguliers anti-érythrocytaires (RAI)
• une épreuve de compatibilité au laboratoire (EDC) (sérum du malade + GR à transfuser +
antiglobuline : test de COOMBS indirect ).
– Cette analyse complète la RAI , et peut mettre en évidence des Ac anti- “ privés ”, c’est à dire des Ac
dirigés contre des Ag rarement rencontrés dans la population.
– L’EDC s’applique avec un résultat de RAI positif ou douteux et en cas d’antécédent de réaction
hémolytique même mineure.
• le contrôle ultime au lit du malade : épreuve de Beth-Vincent avec le sang du patient et le sang à
transfuser  les résultats doivent être identiques.
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités
3.2 - Chez les fœtus ou nouveau-né dont la mère possèdent des Ac
irréguliers
Pendant la grossesse, les Ac irréguliers IgG de la mère peuvent traverser le placenta et se fixer sur les
hématies (s'ils possèdent l'Ag spécifique) de son enfant : maladie hémolytique du nouveau-né
(MHNN)
.
Exemple: Mère Rhésus (-) possédant des Ac irréguliers anti-D (IgG), enceinte
d'un enfant Rhésus(+).
Les Ac irréguliers anti-D (IgG) traversent le
placenta et vont détruire les hématies (AgD) de
l'enfant Rhésus (+)
L'enfant est atteint de la
maladie hémolytique du
nouveau-né (MHNN)
MHNN : anémie hémolytique plus ou moins sévère associé à un ictère prononcé (présence importante
de bilirubine libre dans le sérum) pouvant dans les cas très grave provoquer la mort de l'enfant.
Parfois à la naissance, une exanguinotransfusion avec du sang compatible est nécessaire.
D'autres Ac peuvent être responsables de MHNN : anti-c, anti-C, anti-K
 Si l'Ac irrégulier est un Ac anti-plaquettaire fœtale, l'enfant est alors atteint de thrombopénie.
Remarque: seul les IgG irréguliers sont dangereux, car eux seuls traversent la barrière placentaire.
Surveillance du conflit fœto-maternel lorsqu'il est décelé :
Recherche et à dosage des Ac immuns irréguliers
 dans le sérum de la mère (épreuve sérique – Réaction de Coombs indirecte)
 dans le sang du fœtus. Les Ac recouvrent les hématies fœtales (épreuve globulaire – réaction de
Coombs directe).
Prévention d'une allo-immunisation fœto-maternelle
Tests obligatoires lors de la déclaration de grossesse:
Groupage sanguin ABO – Phénotype rhésus complet et Kell (K)
Recherche d’agglutinines irrégulières (RAI)
N.B.Toute parturiente Rhésus(-) susceptible de former des Ac irréguliers immuns anti-D par
immunisation fœto-maternelle, reçoit très rapidement une injection d'Ac anti-D après
l'accouchement. Si des hématies fœtales porteuses de l'Ag D sont présentes dans la circulation
maternelle, les Ac anti-D injectés les détruisent et évitent ainsi l'allo-immunisation.
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Activités technologiques
4 - Recherche des agglutinines irrégulières (RAI)
4.1 - Généralités
D’après les norme iso15189, l’analyse « RAI » consiste à dépister puis à identifier des Ac dirigés
contre les Ag érythrocytaires autres que les Ag A, A1 et B.
Une étape de dépistage est requise et au terme de laquelle le laboratoire pourra répondre « dépistage
positif » ou « dépistage négatif ».
Suite à un dépistage positif une identification doit être mise en œuvre.
Cette recherche est importante:
- chez les receveurs de sang ou d'organe (homme ou femme)
- chez les femmes enceintes
et éventuellement chez les nouveaux-nés chez qui on suspecte une MHNN.
4.2 - Techniques de recherche des agglutinines irrégulières (AI)
Les Ac irréguliers sériques sont pour la plupart incomplets, leur mise en évidence par une réaction
d'agglutination nécessite un artifice  agglutination indirecte (artificielle).
Deux techniques d'agglutination active indirecte sont utilisées en parallèle:
- réaction de COOMBS indirecte : artifice = anti-globuline humaine (AGH)
L'AGH polyvalente utilisée autrefois est actuellement remplacée par une anti-IgG et une antiC3d.
- traitement préalable des hématies par une enzyme protéolytique (cette méthode est de
plus en plus abandonnée car les AI mis en évidence par cette technique sont peu dangereux)
puis agglutination.
cf. fiches techniques 2 et 3 du chapitre 2
Les contrôles qualité interne (CQI) :
Le système analytique sera contrôlé en utilisant des échantillons de contrôle comportant des
anticorps (natifs ou réactifs) de spécificité et de titre connus avec au minimum un anticorps de
titre 4 dans la technique d'utilisation et sur une hématie comportant l'antigène correspondant
d'expression « hétérozygote ».
4.2.1 - Dépistage :
Principe :
La présence d'AI est recherchée dans le sérum d'un patient
-par agglutination active indirecte (COOMBS indirect et test enzymatique),
-à l'aide de 3 séries d'hématies de groupe O et de phénotypes connus (les Ag des 3 séries
d'hématies doivent correspondre à l'ensemble des AI recherchés).
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités
Les 3 lots d' hématies tests de groupe O doivent permettre la détection des Ac correspondants aux Ag RH1 (D), RH2
(C), RH3 (E), RH4 (c), RH5 (e), KEL 1 (K), KEL 2 (Cellano k), KEL 4 (Kpb), FY1 (Fya), FY 2 (Fyb), JK1 (Jka),
JK2 (Jkb), MNS1 (M), MNS2 (N), MNS3 (S), MNS4 (s), LE1 (Lea), LE2 (Leb), P1, LU1 (Lua) LU2 (Lub).
Les phénotypes RH suivants doivent être obligatoirement représentés sur la gamme de dépistage :
- RH : 1, 2, -3, -4, 5 (DCe)
- RH : 1, -2, 3, 4, -5 (DcE)
- RH : -1, -2, -3, 4, 5 (dce)
Une expression du phénotype « homozygote » doit être respecté pour les Ag FY1, JK1, JK2, MNS3 et recommandée
pour les Ag FY2 et MNS4
Interprétation:
L'absence d'agglutination avec les 3 séries d'hématies (= panel de dépistage) permet de conclure à
l'absence d'AI dans le sérum du patient
La présence d'une agglutination avec une ou plusieurs séries d'hématies permet conclure à la présence
d'une ou plusieurs AI
Dans ce cas, il faut poursuivre la recherche par l'identification précise de l'AI.
4.2.2 - Identification
Si le dépistage d'AI est positif, l'identification de ou des AI selon le même principe que
précédemment, mais en utilisant 10 séries d'hématies phénotypées de groupe O (=panel
d'identification).
L’ensemble de ces hématies de groupe O doit comporter les antigènes suivants : Ag RH1 (D), RH2 (C), RH3 (E),
RH4 (c), RH5 (e), RH8 (Cw), KEL 1 (K), KEL 2 (Cellano k), KEL3 (Kpa), KEL 4 (Kpb), FY1 (Fya), FY 2 (Fyb),
JK1 (Jka), JK2 (Jkb), MNS1 (M), MNS2 (N), MNS3 (S), MNS4 (s), LE1 (Lea), LE2 (Leb), P1, LU1 (Lua) LU2
(Lub).
Les phénotypes suivants doivent être représentés au moins sur 2 hématies : KEL1, FY1 ; -2, JK 1 ; -2, JK-1 ;2, MNS
3, -4, MNS -3 ;4, P-1.
Les AI identifiés pourront ensuite être dosés. (cf fiche technique 7 du chapitre 2)
La durée légale de validité des AI identifiée est le 3 jours.
4.3 - Recherche des agglutinines irrégulières maternelles sur les hématies
fœtales
Principe :
La présence d'AI maternels déjà fixés sur les hématies fœtales est recherchée
- par la réaction de Coombs directe ou test direct à l'anti-globuline (TDA)
Une agglutination des hématies fœtales en présence d'anti-globuline (anti-IgG et anti-C3d)
atteste de la sensibilisation des hématies fœtales par les AI maternels.
Les AI seront ensuite élués puis identifiés .
cf. fiches techniques 4 et 7 chapitre 2 .
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Module 4 – Immuno-hématologie
T
Activités technologiques
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 2
est de COOMBS indirect
ou test indirect à l'antiglobuline (TIA)
1 - Principe
La présence d'Ac irréguliers est recherchée dans le sérum d'un patient
-par agglutination active indirecte (artificielle) utilisant des anti-globulines humaines (AGH)
-à l'aide d'un panel d'hématies phénotypées.
1ére étape : les GR sont sensibilisés par les AI éventuels présents dans le sérum du patient
2ème étape : lavages → élimination des Ig non spécifiquement fixés à l'Ag érythrocytaire.
3ème étape : agglutination des GR sensibilisés par des AGH
☞ Importance des lavages : la réaction de Coombs n'est spécifique que si les GR sont débarrassées de
toutes traces d'Ig non fixées spécifiquement sur l'Ag.
Remarques :
-
Variantes :
 Coombs à basse force ionique (BFI). Augmentation de la fixation des Ac sur les Ag
et diminution du temps de sensibilisation.
 Coombs sur hématies trypsinées. Augmentation de l’accessibilité des Ag.
-
Inconvénient :
 Certains Ac irréguliers ne sont pas détectés par cette technique
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2
Schéma immunologique
Globules rouges de phénotype connu
panel de dépistage
ou panel d'identification
SÉRUM À TESTER
Les Ac irréguliers (Anti-D, anti-K, anti-Jka etc..)
présent dans le sérum à tester se fixent sur les GR
phénotypés possédant les Ag spécifiques : GR
sensibilisés.
LAVAGES EN EAU PHYSIOLOGIQUE + CENTRIFUGATION
Élimination des Ac non spécifiques, différents des Ac
irréguliers.
Le culot est repris en eau physiologique
AJOUT D’AGH (ANTIGLOBULINE HUMAINE)
Antiglobuline humaine polyvalente
Sérum de cheval anti-Ig humaines (Anti-IgG, IgM …) ,
actuellement remplacée par une anti-IgG+antiC3d
Agglutination active indirecte
(artificielle)
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Activités technologiques
2 - Technique
2.1 - Réactifs
Hématies phénotypées de groupe O
• panel de dépistage : 3 séries d'hématies dont l'éventail des Ag couvre l'ensemble des AI recherchés :
 dépistage des AI
ou
• panel d’identification: 10 séries d'hématies  identification des AI (si le dépistage est +)
Sérum anti-globuline humaine (AGH) : anti-IgG + anti-C3d
Contrôle de qualité interne (CQI) :
• CQI + : hématies [O, Rh+] (5 % en tampon à basse force ionique)
• CQI - : hématies [O, Rh -] (5 % en tampon à basse force ionique)
• sérum anti-D salin (ne contenant que des IgG anti-D en milieu salin NaCl)
Hématies phénotypées
• panel de dépistage : 3 séries d'hématies dont l'éventail des Ag couvre l'ensemble des AI recherchés :
 dépistage des AI
ou
• panel d’identification: 10 séries d'hématies  identification des AI (si le dépistage est positif)
2.2 - Mode opératoire
Cf. page 54
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2
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Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
3 - Résultats et interprétations
3.1 - Contrôles de qualité interne
- CQI (+) : la présence d’une agglutination vérifie que :
* la présence de l’Ag et l’Ac spécifique est bien repérée par un agglutinat
* les différents temps de la réaction (sensibilisation, lavage et action de l’AGH) se déroulent
parfaitement
* la bonne qualité de l’AGH.
- CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs
dues à l’AGH. En absence d’Ag, les Ac ne conduisent pas à une agglutination.
3.2 - Lecture des réactions
- Une agglutination révèle la présence de l’Ac correspondant à l’un des Ag présents sur les hématies
testées.
Avec le panel de dépistage, l’absence de toute agglutination signifie l’absence d’AI.
Dans le cas contraire, la présence d’une ou plusieurs agglutinations permet d’affirmer la présence d’AI
qu’il faut identifier avec le panel d’hématies d’identification (cf. exercices)
En cas de AI présents, la comparaison obtenus avec les hématies de dépistage permet déjà de donner
une orientation de diagnostic.
La lecture du panel de d’identification permet d’identifier le ou les AI probable(s) ou
Attention : l’interprétation doit aussi tenir compte du phénotype du patient. (Ex : un sujet D-, C+, c-,
E+, e- ne peut pas posséder des anti-C)
L’AI identifiée est ensuite titrée. Le sérum est alors conservé par congélation en vue de titrage
ultérieurs.
B1ABM
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2
En savoir plus
ROBERT ROYSTON AMOS ("ROBIN") COOMBS (19212006) : un médecin immunologiste britannique
56
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Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 3
Test enzymatique (papaïne)
1 - Principe
La présence d'Ac irréguliers est recherchée dans le sérum d'un patient
- par agglutination active indirecte (artificielle) utilisant un artifice enzymatique (traitement des
hématies par une enzyme protéolytique)
- à l'aide d'un panel d'hématies phénotypées (et traitées).
1ère étape : les GR sont traités par une enzyme protéolytique (papaïne, broméline …) à 37°C.
2ème étape : lavages  élimination des fragments éliminés par le traitement ainsi que les enzymes
3ème étape : les GR traités sont sensibilisés par les AI éventuels présents dans le.sérum du patient.
☞ Importance des lavages :
Le traitement par une enzyme élimine des petits fragments à la surface des hématies. Ces fragments et
les enzymes doivent être éliminés pour éviter toute interférence (éventuelle dénaturation des Ac
présents dans le sérum testé).
Les AI éventuellement présents dans le sérum du patient pourront atteindre beaucoup plus facilement
les Ag portés par les hématies (augmentation de l’accessibilité de certains sites antigéniques,
diminution du potentiel zeta, diminution de l’encombrement stérique.)
REMARQUES :
➢ Avantages :
• Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Rhésus.
• Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Kidd par la papaïne.
• Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Lewis par la ficine.
➢ Inconvénient – altération de la puissance antigénique :
• Ag M N S s Fya Fyb détruits par tout traitement enzymatique.
• Ag Fya Fyb détruits ( S s affaiblis ) par la papaïne.
• Ag M N affaiblis par tout traitement enzymatique.
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57
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 3
Schéma immunologique
Globules rouges de phénotype connu
GR panel identification : list I, II, III
37°C
TRAITEMENT ENZYMATIQUE
Papaïne ou Broméline ou Trypsine
Démasquage de certains Ag.
(Destruction de certains Ag)
Globules rouges traités
LAVAGES EN EAU PHYSIOLOGIQUE + CENTRIFUGATION
Élimination des débris et fragments protéiques, et
enzymes
Les GR, une fois lavés sont repris en eau
physiologique.
37°C
SÉRUM À TESTER
Recherche des Ac irréguliers (Anti D, anti K, anti
Jka etc..)
Ac de la classe des IgG (Ac chaud)
Agglutination active indirecte (artificielle)
58
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Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
2 - Technique
2.1 - Réactifs
Enzyme protéolytique : trypsine ou papaïne ou broméline ou ficine .....
Les hématies des panels sont traitées par les enzymes (en respectant la procédure indiquée par le
fabriquant), lavées en eau physiologique puis remise ne suspension à 40% (test sur rhésuscope) ou à
10 % (test en tube).
Contrôles de qualité (CQI) :
– CQI (+) : hématies [O, Rh+] (40% ou 10% en eau physiologique)
– CQI (+) : hématies [O, Rh -] (40% ou 10% en eau physiologique)
Sérum anti-D salins (ne contenant que des IgG anti-D en milieu salin NaCl)
2.2 - Mode opératoire
Cf. page 60.
3 - Résultats et interprétations
3.1 - Contrôles de qualité
- CQI (+) : la présence d’une agglutination vérifie :
* la présence de l’Ag et l’Ac spécifique est bien repérée par un agglutinat
* les différents temps de la réaction (traitement enzymatique efficace, température de sensibilisation
correcte) se déroulent parfaitement
* la bonne qualité l’enzyme.
- CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs
dues un traitement enzymatique trop important. Les Ac en absence d’Ag ne conduisent pas à une
agglutination.
3.2 - Lecture des réactions
- Une agglutination révèle la présence de l’Ac correspondant à l’un des Ag présents sur les hématies
testées.
Avec le panel de dépistage, l’absence de toute agglutination signifie l’absence d’AI.
Dans le cas contraire, la présence d’une ou plusieurs agglutination permet d’affirmer la présence d’AI
qu’il faut identifier avec le panel d’hématies d’identification (cf exercices)
En cas de AI présents, la comparaison obtenus avec les hématies de dépistage permet déjà de donner
une orientation de diagnostic.
La lecture du panel de d’identification permet d’identifier le ou les AI probable(s) ou
Attention : l’interprétation doit aussi tenir compte du phénotype du patient. (Ex : un sujet D-, C+, c-,
E+, e- ne peut pas posséder des anti-C)
L’AI identifiée est ensuite être titrée Le sérum est alors conservé par congélation en vue de titrage
ultérieurs.
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59
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 3
60
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Module 4 – Immuno-hématologie
T
Activités technologiques
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 4
est de COOMBS direct
ou test direct à l’antiglobuline (TDA)
1 - Principe
La présence d'Ac irréguliers est recherchée sur des hématies déjà sensibilisées par des Ac présents dans
le sérum d’un patient :
-par agglutination active indirecte (artificielle) utilisant des anti-globulines humaines (AGH)
monospécifiques (détectant les IgG et la fraction C3 du complément.
1ére étape : lavages des hématies sensibilisées en solutions salines (élimination des Ig non
spécifiquement fixés à l'Ag érythrocytaire).
2ème étape : agglutination des GR sensibilisés par des AGH
☞ Importance des lavages : la réaction de Coombs n'est spécifique que si les GR sont débarrassées de
toutes traces d'Ig non fixées spécifiquement sur l'Ag.
À savoir
Cette technique permet de révéler la présence :
•d’agglutinines irrégulières (AI) d’origine maternelle sur les GR fœtaux (cf MHNN)
•d’auto-Ac sur les GR d’un patient atteint d'anémie hémolytique auto-immune – cf cours
hématologie B2ABM)
B1ABM
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61
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 4
Schéma immunologique
Lavages des hématies déjà sensibilisées
par des Ac en eau physiologique + centrifugation
Élimination des Ac non spécifiques, différents des
Ac irréguliers.
Le culot est repris en eau physiologique
Ajout d’AGH
AGH = Antiglobuline humaine monospécifique:
Sérum de cheval anti-Ig humaines
(Anti-IgG, anti-C3…)
Agglutination active indirecte
(artificielle)
62
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Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
2 - Technique
Le sang à examiner peut être:
-du sang du cordon ou du nouveau né, recueilli sur anticoagulant, déposé au froid et porté au
laboratoire immédiatement après le prélèvement
- du sang d'un patient possédant des allo-Ac (cas d'une transfusion incompatible) ou des auto-Ac (cas
d'une maladie auto-immune provoquant une anémie hémolytique=AHAI).

GR du patient sont mis en suspension saline à 50 %.
2.1 - Réactifs
Sérum anti-globuline humaine (AGH) : sérum polyspécifique ou monospécifique.
Contrôles de qualité :
– CQI (+) : hématies O Rh+
( 50 % en eau physiologique)
– CQI (-) : hématies O Rh – sérum anti-D salins (ne contenant que des IgG anti-D)
2.2 - Mode opératoire
Cf. page 64
3 - Résultats et interprétations
3.1 - Contrôles de qualité internes et témoin
- CQI (+) : la présence d’une agglutination vérifie :
* la présence de la présence de GR sensibilisés par des Ac est bien repérée par un agglutinat
* les différents temps de la réaction (lavage et action de l’AGH) se déroulent parfaitement
* la bonne qualité de l’AGH.
- CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs
dues à l’AGH. Les Ac en absence d’Ag ne conduisent pas à une agglutination.
- Témoin contrôle : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction. Les GR sensibilisés
ne doivent pas agglutiner en absence d’AGH.
3.2 - Lecture des réactions
Si les témoins sont corrects :
•Une agglutination pour le test R signifie que les GR sont recouvertes par un Ac que le contexte
biologique identifiera comme un Ac d’origine maternelle.
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63
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 4
Dans 4 tubes à hémolyse, verser :
Sensibilisation des
GR témoins
Lavage
Suspension à
20 % de GR pour
technique en
plaque
Sérum anti-D
Réaction de Coombs
directe
Réaction
T contrôle
-
GR témoins
GR du
patient
50 % eau Ψ
Eau Ψ
CQI (+)
CQI (-)
2 gouttes
2 gouttes
1 goutte de 1 goutte de
GR [O, Rh +] GR [O, Rh -]
Incuber à 37°C – 30 min
-
1 goutte
1 goutte
-
-
4 mL
4 mL
4 mL
4 mL
Centrifuger 3 min à 800g
Jeter l’eau du lavage dans la Javel et décoller le culot en grattant le tube sur
le portoir
Refaire ainsi 2 autres lavages dans 4 mL d'eau physiologique
Puis déposer sur chaque culot du dernier lavage :
3 gouttes
3 gouttes
3 gouttes
3 gouttes
Eau Ψ
Poursuivre comme indiqué dans le tableau jaune (Technique en plaque)
ci-dessous.
4 mL
4 mL
4 mL
4 mL
Suspension à 5 % Eau Ψ
de GR pour
Poursuivre comme indiqué dans le tableau bleu (Technique en tubes)
technique en tube
ci-dessous.
Eau Ψ : Eau physiologique
Réaction
Agglutination des
GR sensibilisés et
lavés
par l’AGH
Technique en plaque
T contrôle
CQI (+)
CQI (-)
Suspensions
à 20 %
1 goutte
1 goutte
1 goutte
1 goutte
AGH
1 goutte
-
1 goutte
1 goutte
Eau Ψ
-
1 goutte
-
-
Mélanger à l’aide d’un agitateur
Laisser reposer 5 min sur la paillasse et observer la présence éventuelle
d’agglutination.
Agglutination des
GR sensibilisés et
lavés
par l’AGH
Technique en tubes (dans 4 nouveaux tubes identifiés)
Réaction
T contrôle
CQI (+)
CQI (-)
Suspensions
1 goutte
1 goutte
1 goutte
1 goutte
à 5%
AGH
1 goutte
-
1 goutte
1 goutte
Eau Ψ
-
1 goutte
-
-
Agiter pour mélanger
Laisser reposer 5 min sur la paillasse et observer la présence éventuelle
d’agglutination.
64
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Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 5
P
rocédure d'identification des
anticorps irréguliers (AI)
et exercices d'application
1 - Importance des informations préalables
Les informations concernant le contexte de la recherche ou l’identification des agglutinines irrégulières
chez le patient permettront d’identifier au mieux la ou les agglutinines irrégulières les plus probables.
Avant tout dépistage, il faut connaître si possible :
• le groupe ABO-RH1, le phénotype standard RH-KEL1 et éventuellement le phénotype
étendu précisant la présence des Ag érythocytaires appartenant
aux autres systèmes
érythocytaires (ex: Duffy, Kidd, Lewis...).
• s’il s’agit d’une personne non transfusée ou sans enfant
à absence d’AI immuns
 présence éventuelles d’AI naturels (agglutinine froide, auto-Ac ou autres Ac naturels
irréguliers).
• s’il s’agit d’une femme avec 1 enfant, il y a une probabilité non négligeable de trouver 1
agglutinine irrégulière, en général (non systématique).
• S’il s’agit d’une femme multipare (plusieurs enfants) ou s’il s’agit d’une personne
polytransfusée il y a une probabilité non négligeable de trouver plusieurs agglutinines
irrégulières.
La fréquence des agglutinines irrégulières : Ac irréguliers les plus fréquemment rencontrés : Anti-D,
anti-E, anti-c, anti-Jka, anti-K (En général les Ac anti Ag du système Rhésus, Kell, Duffy et Kidd).
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65
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5
2 - Dépistage des agglutinines irrégulières (DSAI)
2.1 - Technique (cf. fiches n°2 et 3 )
Un panel de dépistage est utilisé. Ce panel est constitué généralement 3 lots d'hématies, l'ensemble de
ces lots d'hématies devant posséder l'ensemble des Ag spécifiques des Ac irréguliers recherchés.
Le sérum du patient est testé sur chacun de ces lots d'hématies : test de Coombs indirect et
éventuellement test à la papaïne*(* non obligatoire -GBEA arrêté 26 avril 2002).
Exemple :
Résultat
Lots
de
GR
Panel 1
de
2
dépis 3
-tage Auto
D
C c E e K
k
+
+
-
+ - - + - +
- + + - - +
- + - + + +
Fya Fyb Jka Jkb M N S s Lea
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ + + +
+ - + + - - +
+
-
Leb P1 Cw Lua Lub Kpa
+
+
+
+
S
+
-
+
-
+
+
+
Papaïne * 37°C
Présence (+) ou absence (-) des Ag à la surface des hématies du lot
Kell Duffy
Kidd
MNs
Lewis
P Cw Luthéran
Coombs indirect 37°C
Rhésus
+
-
contrô
-le
2.2 - Interprétation
2.2.1 - Auto-contrôle
Un autocontrôle positif signale la présence d’un auto-anticorps qui doit être confirmée par
la réalisation d’un test de Coombs direct. (cf. fiche 4 )
Il est alors nécessaire d’adsorber l'auto-anticorps (incubation du sérum avec les hématies du
patient) pour déceler et identifier un éventuel allo-anticorps masqué en renouvelant la RAI
après adsorption ;
2.2.2 - Dépistage des agglutinines irrégulières (AI)
Si l'auto-contrôle est négatif :
→ Des résultats négatifs [absence (-) d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la
papaïne), avec les 3 lots d'hématies, prouvent l'absence d'agglutinine irrégulière (AI).
→ Des résultats positifs [présence (+) d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la
papaïne), avec un lot au moins d'hématies, prouveraient la présence d'agglutinines irrégulières,
qu'il faudra identifier puis titrer.
66
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Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
3 - Identification des agglutinines irrégulières
3.1 - Technique (cf. fiches n°2 et 3 )
Un panel d'identification comprenant 10 lots d'hématies est utilisé.
L'ensemble de ces lots doit posséder l'ensemble des Ag spécifiques des Ac irréguliers recherchés.
Cependant chaque lot possède moins d'Ag que le panel de dépistage.
Exemple :
PANEL D’IDENTIFICATION
Lots
de
GR
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
Auto
contrôle
D
+
C c E e K
+ - - + +
k
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
W
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Fya Fyb Jka Jkb M N S s Lea
+
+
+
+ + - + -
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
Papaïne* 37°C
Résultat
Coombs indirect 37°C
Présence (+) ou absence (-) des Ag à la surface des hématies du lot
Kell Duffy
Kidd
MNs
Lewis
P Cw Luthéran
Rhésus
Leb P1 Cw Lua Lub Kpa
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
S
+
+
S
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
W
+
+
+
+
Importance des techniques employées pour l’identification des agglutinines irrégulières
Il faut savoir que la majorité des Ag érythrocytaires peuvent êtres reconnus par Ac
irréguliers par le test de Coombs indirect, alors que certains Ag érythrocytaires sont
détruits ou affaiblis par la réaction à la Papaïne et donc ne peuvent être reconnus par les Ac
irréguliers correspondants.
Par exemple :
Ag Fya et Fyb sont détruits par la papaïne.
Ag M et N ainsi que S et s peuvent éventuellement être affaiblis.
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5
3.2 - Interprétation
3.2.1 - Auto-contrôle
➔
Un autocontrôle positif signale la présence d’un auto-anticorps, qu'il faudra confirmer
puis éliminer (cf. 2.2.1) pour refaire une RAI.
➔
Un auto-contrôle négatif et des résultats positifs à tous les lots d'hématies [présence (+)
d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la papaïne) doit orienter vers la recherche
d’un anticorps dirigé contre un antigène de grande fréquence, dit « public ».
Si l'auto-contrôle est négatif, et si tous les résultats aux tests de Coombs indirect (et papaïne) ne
sont pas tous positifs, procéder à l'identification des AI.
L'identification des AI est alors un jeu logique qui s'effectue en 3 temps.
3.2.2 - Premier temps : identification de tous les AI possibles
• Tenir compte des résultats négatifs obtenus avec les GR du panel d’identification en éliminant les
Ac correspondant aux Ag présents sur les GR tests.
Procéder par élimination, en rayant les Ag des hématies n’ayant pas réagit avec le sérum du
patient. Les Ac spécifiques de ces Ag sont ainsi éliminés.
 Noter le ou les Ac spécifiques des Ag restants : AI possibles
Remarques particulières : En général,
on peut éliminer les Ac anti-Fya et/ou Fyb et Jka et/ou Jkb uniquement si on dispose d’hématies homozygotes.
on peut éliminer les Ac anti-M et/ou N et Set/ou s uniquement si on dispose d’hématies homozygotes.
On peut se servir des résultats obtenus avec les hématies de dépistage pour l’identification.
3.2.3 - Deuxième temps : identification des AI les plus probables
• Tenir compte des résultats positifs obtenus avec les GR du panel d’identification en recherchant
l’Ag commun aux GR ayant donné des résultats positifs.
L’Ac le plus probable correspond à l’Ag commun aux GR tests donnant un résultat
positif. (Ă confronter aux renseignements concernant le patient)
Cependant, dans certains cas, il faut tenir compte des éventuelles disparités de réaction entre les deux tests
(Coombs indirect ou papaïne), qui peuvent alors s’expliquer par des disparitions ou affaiblissements des Ag par
le traitement à la papaïne.
3.2.4 - Troisième temps : élimination des Ac spécifiques aux Ag du patient
Si et seulement si l'absence d'auto-Ac a été démontré, il est alors possible d'éliminer les Ac
spécifiques aux Ag du patient.
Ex: Si le patient présente le phénotype : D+; C+, c- ; E- , e+ , éliminer les Ac anti-D, anti-C, anti-e.
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5
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Activités technologiques
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5
72
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Module 4 – Immuno-hématologie
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Activités technologiques
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5
Illustration 3: Agglutination en
tube. A: négatif - B: positif
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Activités technologiques
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 6
T
itrage des anticorps irréguliers
de type IgM1
1 - Généralités
Les anticorps irréguliers peuvent être de type IgM (immun ou naturels) ou IgG.
Les Ac de type IgM sont généralement des Ac complets.
Leur mise en évidence repose alors sur une réaction d’agglutination active directe.
Ce titrage est mis en œuvre en particulier pour vérifier le titre en Ac d'un sérum test.
2 - Application : titrage des Ac naturels irréguliers anti-A1
2.1 - Principe
Les Ac naturels (IgM) irréguliers du système ABO sont titrés par une technique de dilution en série
d’un sérum et à l’aide d’une agglutination directe active.
Le titre en Ac anti-A1 est exprimé en UI/mL. Dans ce cas, le titrage des anticorps du sérum à titrer
nécessite une comparaison avec un sérum étalon de titre connu
2.2 - Mode opératoire
2.2.1 - Matériel et réactifs
 Suspension de globules rouges A1 à 2% en eau physiologique.
 Sérum à titrer (Sx) : 120 µL en tube à hémolyse
 Sérum étalon anti-A1(anti-A1 étalon) : 120 µL en tube à hémolyse.
Le titre de ce sérum est connu et donné par l’OMS.
 Microplaque à fond conique
 Tubes à hémolyse
 Pissette d’eau physiologique
 Distributeur de particules calibrées 25µL.
 Pipette automatique.
1 Attention : les Ac de type IgM peuvent être naturels réguliers (ex : anti-A), naturels irréguliers (ex:anti-A1) ou encore
immuns.
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 6
2.2.2 - Technique
 deux titrages seront entrepris : sérum Sx et sérum étalon de titre ..........UI/mL
Réaliser 2 séries de dilution : 1 série de dilution par sérum
– Dilution de base de 1 et de raison 1/2
– -Diluant : eau physiologique.
– Volume final après dilution du sérum : 50 µL
– Volume de suspension érythrocytaire : 25 µL
Compléter le tableau suivant
Cupule n°
Diluant (µL)
Sérum étalon ou
sérum x (µL)
Volume à
redistribuer (µL)
Dilution
Hématies A1 (µL)
1
2
3
4
5
6
7
8
50
-
1/1
25
25
Lecture de la plaque
S étalon
Résultats S étalon
Lecture de la plaque
Sx
Résultats Sx
Recouvrir d’un parafilm et mélanger. Centrifuger 3 minutes à 1 500 rpm.
Observer les voiles d'agglutination ou les boutons de sédimentation.
Remettre en suspension par agitation. Noter la présence de voile d'agglutination ou de bouton de
sédimentation.
2.3 - Interprétation
Rôle de la cupule 8 : ................................................................
Le titre d'Ac anti-A1 d'un sérum correspond à la plus grande dilution du sérum donnant encore
un voile d'agglutination .
Titre d'Ac anti-A1 en dilution (d) et en inverse (Fd)
• du sérum étalon : ....................
• du sérum inconnu :.................
Le titre en Ac anti-A1 d'un sérum peut aussi s'exprimer en UI/mL
Titre d'Ac anti-A1 en UI/mL du sérum inconnu :
– sachant que le sérum étalon a un titre d'Ac anti-A1 de ……… UI/mL (cette valeur sera donnée
en TP)
– à l’aide de la formule suivante (à démontrer)
[titre étalon] = [titre X]
Fd étalon
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Fd X
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Activités technologiques
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 7
T
itrage des anticorps irréguliers
de type IgG
1 - Généralités
Les Ac irréguliers sont en majorité incomplets (IgG), leur mise en évidence par une réaction
d'agglutination nécessite un artifice  agglutination indirecte (artificielle).
Le GBEA et les normes ISO 15189 préconisent d'utiliser le test indirect à l'antiglobuline (TIA) ou test
de Coombs indirect.
2 - Titrage des Ac irréguliers anti-D
2.1 - Principe
Les Ac immuns irréguliers anti-D (IgG) sont titrés par une technique de dilution en série d’un sérum et
à l’aide d’une agglutination indirecte active (antiglobuline humaine).
Le titre en Ac anti-D est exprimé en UI/mL. Dans ce cas, le titrage des anticorps du sérum à titrer
nécessite une comparaison avec un sérum étalon de titre connu
2.2 - Mode opératoire
2.2.1 - Matériel et réactifs.
 Suspension de globules rouges O Rh+ à 2% en eau physiologique.
 Sérum du patient à titrer (Sx) : 120 µL en tube à hémolyse
 Sérum étalon anti-D (anti-D étalon) : 120 µL en tube à hémolyse.
Le titre de ce sérum est connu et donné par l’OMS.
 Anti-globuline humaine (AGH)
 Microplaque à fond conique
 Tubes à hémolyse
 Pissette d’eau physiologique
 Distributeur de particules calibrées 25µL.
 Pipette automatique.
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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 7
2.2.2 - Technique.
Réaliser une série de dilution du sérum à tester de base de 1 et de raison ½
– Diluant : eau physiologique.
– Volume final après dilution du sérum : 50 µL
Compléter le tableau suivant
Cupule n°
1
8
9
10
Diluant (µL)
75
50
50
Sérum
sérum x (µL)
-
50
-
Volume à
redistribuer
(µL)
-
-
-
Dilution
1/1
Hématies
Rh+ (µL)
25
2
3
4
5
6
7
25
25
25
Recouvrir d’un parafilm. Agiter 1 min et incuber à 37°C pendant 20 min.
AGH (µL)
50
-
-
50
Recouvrir d’un parafilm et mélanger. Centrifuger 3 minutes à 1 500 rpm.
Observer les voiles d'agglutination ou les boutons de sédimentation.
2.3 - Interprétation
Donner le rôle des cupules 8, 9 et 10
Donner le titre d'Ac anti-D en dilution (d) et en inverse (Fd) du sérum à tester.
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Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
- Chapitre 3 Techniques en gel filtration
Généralités
Ces techniques ont l'avantage d'être automatisables.
1 - Principe
Le mélange hématies-sérum se déroule au sein d’un gel.
– Les hématies n’ayant fixé aucun Ac traversent et sédimentent au fond du micro tube (Le diamètre des
hématies est inférieur aux mailles et pores du gel utilisé).
– Les immun complexes correspondant à des agglutinats (édifice multiparticulaire d’Ag réunis par des
ponts d’Ac) spécifiques aux Ag) restent bloqués dans les mailles du gel.
• Une réaction négative se traduit par une sédimentation des GR libres dans le fond du micro tube.
• Une réaction fortement positive se traduit par une rétention des hématies agglutinées, dans la partie
supérieure du micro tube.
• Une réaction faiblement positive se traduit une dissémination des hématies agglutinées, à l’intérieur
du micro tube.
La réaction Ag-Ag est accélérée et révélée après centrifugation.
GR non agglutinés
GR agglutinés
Gel avec un certain
« maillage »
B1ABM
CM ©
79
Chapitre 3 – Techniques en gel filtration – Généralités
2 - Différents types de gel
– Gels neutres immunologiquement : Dextran préparé dans un tampon neutre.
– Gels contenant des Ac connus :
• Ac anti-A ou Ac anti-B ou Ac anti-D (système ABO et Rhésus).
• Ac anti-D, anti-E, anti-e, anti-C, anti-c (phénotypage Rhésus et Kell).
Dans ce type de gel, la formation de l’agglutinat se fait au cours de la centrifugation.
– Gels contenant un artifice :
• Anti-globuline humaine (test de Coombs)
3 - Procédures standardisées Diamed®
Groupage ABO – Épreuve globulaire uniquement.
•Carte ID ABO/Rh.
•Gel contenant des Ac agglutinants anti-A, anti-B et anti-A + B.
•Suspension d’hématies à grouper, préparées à 5% en tampon ID diluent 1 (broméliné).
•Réalisation du test à température ambiante.
Groupage ABO – E preuve sérique uniquement.
•Carte ID NaCl/enz.
•Gel neutre.
•Suspension d’hématies tests (ID diacell A1, A2, B et O préparées à 5%.)
•Mélange des GR tests + sérum à tester à la surface du gel.
•Réalisation du test à température ambiante.
Détermination du phénotype Rhésus complet et Kell.
•Carte ID Diaclon Rh.
•Gel contenant des Ac agglutinant anti-C, anti-c et anti-E etc … (Ac monoclonaux en général).
•Suspension d’hématies à grouper, préparées à 5% en tampon ID diluent 2 (Eau physiologique).
•Réalisation du test à température ambiante.
Recherche d’agglutinines irrégulières.
•Carte combinée AGH/Enz (3 micro tubes contenant le gel + AGH et 3 micro tubes contenant le gel neutre).
•Carte combinée ID liss/Coombs.
•Carte Enz NaCl/Enz.
•Utilisation du sérum à tester.
•Utilisation de GR de panels de dépistage et / d’identification (ID diacell List I, II et III pour le tests de Coombs
et ID diacell list Ip, IIp, IIIp pour le test à la papaïne).
Avantages et inconvénients.
•Grande sensibilité.
•Petite quantité de réactif nécessaire.
•Nombre de manipulation réduit.
•Nécessité de standardiser les gels.
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CM ©
B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
Chapitre 3 – Techniques en gel filtration – Fiche 1
G
roupage ABO - RH1
Système en minigel – Système Diamed®
1 - Matériel et réactifs
−
Carte
« ID ABO/Rh » possédant six microtubes contenant des gels A, B, AB, D, DCE et ctl :
è
gel A contenant des Ac anti-A
è
gel B contenant des Ac anti-B
è
gel AB contenant des Ac anti A+anti-B
è
gel D contenant des Ac anti-D
è
gel DCE contenant des Ac anti-D+anti-C+anti-E
è
gel ctl neutre immunologiquement.
−
un tube à hémolyse contenant environ 1mL de diluent ID2 (basse force ionique)
−
2
−
2 pastettes et 1 pipette automatique de 10 µL
−
gants.
tubes à hémolyse
2 - Mode opératoire
A partir du tube de sang fourni, recueilli sur EDTA et centrifugé :
−
−
−
−
préparer une suspension globulaire à environ 5 % (soit environ 1/20) en tampon ID2 dans un
tube à hémolyse.
mélanger et incuber 10 min à température ambiante.
enlever la pellicule d’aluminium de la carte délicatement de manière à ne pas souiller les
microtubes entre eux.
déposer à la surface de chaque gel, 10 µL de suspension globulaire à 5%.
Attention : ne pas toucher le bord des microtubes avec la pointe de pipette.
−
centrifuger la carte dans la centrifugeuse ID spécifique.
3 - Lecture et interprétation
Réaliser un tableau de résultat, dans lequel seront schématisé l'aspect des gels et l'interprétation
correspondante.
Interpréter l'ensemble des résultats et proposer des tests complémentaires.
B1ABM
CM ©
81
Chapitre 23– Techniques en gels filtration – fiche 1
Illustration 4: Un automate permettant la réalisation
des groupages sanguins en gel filtration (Classic Plus
ID-GelStation -Diamed)
Illustration 5: Un exemple de résultats Groupe ABO1 - RH1
82
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B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
Chapitre 3 – Techniques de gel filtration – Fiche 2
E
xercices – Interprétations de
résultats obtenus en minigel
Système Diamed®
1 - Étude du cas 1
Analyser les gels suivants, concernant une patiente, 32 ans, déjà mère de 3 enfants et enceinte d'un
4ème enfant.
Pour chaque gel, indiquer la présence ou non de composés additionnels et préciser la composition du
dépôt versé sur chaque gel.
A
A1
B
A2
Simonin
B1ABM
AB
D
B
DCE
I
II
ctl
C
III
c
I
Coombs
E
II
Coombs
CM ©
III
e
Kell
IP
IIP
ctl
IIIP
Papaïne
83
Chapitre 3 – Techniques en gel filtration – fiche 2
2 - Étude du cas 2
Un patient doit subir seconde transfusion sanguine. .
Interpréter les résultats obtenus sur les cartes de groupage et phénotypage correspondantes.
Analyser les résultats obtenus pour le dépistage des agglutinines irrégulières, ainsi que pour
l’identification.
A
B
A1
A2
AB
B
D
DCE
ctl
C
c
E
e
I
II
III
I
II
III
IP
Coombs
1
2
3
1
8
Coombs
84
4
3
9
7
8
5
9
10
Enzyme
11
Coombs
CM ©
IIP
ctl
IIIP
Enzyme
6
4
Coombs
Enzyme
Coombs
7
2
Kell
5
6
Enzyme
Ctl
10
11
Ctl
Enzyme
B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie
Activités technologiques
Rhésus
Kell Duffy
D C c E e K k Fya Fyb
MNs
Lewis
P Cw Luthéran
M N S s Lea Leb P1 Cw Lua Lub
Panel
1
de
2
dépista 3
ge
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
contrôle
+ + - - + - +
+ - + + - + +
- - + - + - +
+
+
+
+
+ +
+ + -
+ +
+ - +
+
-
+
+
+
+
S
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
S
+
+
S
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
W
+
+
+
PANEL D’IDENTIFICATION
Panel d'hématies
n°00689
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
W
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
Coombs Papaï-
37°C
ne
37°C
Proposer des examens complémentaires éventuels.
3 - Étude du cas 3
Dépistage d'une maladie hémolytique chez un nouveau-né :
– recherche des Ag érythrocytaires A,B et D
– test de Coombs direct (ou test direct à l'antiglobuline).
• Pour chaque gel utilisé ci-dessous, indiquer la présence ou non de composés additionnels et préciser
la composition du dépôt versé sur chaque gel.
• Analyser les résultats obtenus et conclure.
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