Immunohématologie Livret 4 d'activités technologiques A+ Chantal Muller (Professeur - Lycée La Martinière Duchère - LYON ) Remerciements Mes remerciements vont à tous ceux qui ont permis la réalisation de cet ouvrage, en particulier certaines de mes collègues, professeurs au lycée La Martinière Duchère de Lyon avec qui j'ai travaillé avec énormément de plaisir en immuno-hématologie : Stéphanie Darmochod et Caroline Platroz qui m'ont aidé à améliorer ces fiches techniques ont réalisé de nombreux schémas (en particulier Stéphanie) et ont relu l'ensemble des livrets. Un remerciement aussi à Christiane Robin, technicienne de laboratoire au lycée La Martinière Duchère de Lyon, qui a contribué avec compétence et gentillesse à la mise au point de techniques. Des remerciements aussi pour Gilles et Sangeetha Muller qui m'ont aidé pour la mise en page. Avant-propos Ce livret 4 d'activités technologiques s'adresse aux étudiants de première année de section de technicien supérieur d'analyses de biologie médicale (B1ABM). Il correspond au module 4 des activités technologiques d'hématologie du référentiel 2008 du brevet de technicien supérieur d'analyses de biologie médicale. Ce livret 4 fait partie de quatre livrets relatifs aux enseignements technologiques d'hématologie de la section technicien supérieur d'analyses de biologie médicale. Livret 1 – Cellules normales du sang et de la moelle rouge des os Livret 2 – Hémopathies Livret 3 – Hémostase Livret 4 – Immuno-hématologie MAI 2012 Sommaire Introduction à l'immuno-hématologie......................................................................................................... 5 Chapitre 1 – Groupes sanguins Pré-requis et objectifs................................................................................................................................. Détermination des groupes sanguins-Généralités ..................................................................................... Fiche 1 – Détermination des groupes sanguins du système ABO ............................................................ Fiche 2 – Exercices: groupage ABO ........................................................................................................ Fiche 3 – Recherche de la substance H dans la salive.............................................................................. Fiche 4 – Groupage Rhésus standard........................................................................................................ Fiche 5 – Phénotypage Rhésus complet.................................................................................................... Fiche 6 – Détermination du groupe érythrocytaire dans le système Kell.................................................. Fiche 7 – Phénotype étendu....................................................................................................................... 7 8 11 18 21 23 31 37 41 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers Pré-requis et objectifs................................................................................................................................. Fiche 1 – Recherches des anticorps irréguliers - Généralités ................................................................... Fiche 2 – Test de Coombs indirect ........................................................................................................... Fiche 3 – Test enzymatique à la papaïne................................................................................................... Fiche 4 – Test de Coombs direct ............................................................................................................... Fiche 5 – Procédure d'identification des anticorps irréguliers (AI) et exercices d'application.................. Fiche 6 – Titrage des anticorps irréguliers de type IgM............................................................................. Fiche 7 – Titrage des anticorps irréguliers de type IgG............................................................................. 43 44 51 57 61 65 75 77 Chapitre 3 – Techniques en gel filtration Généralités.................................................................................................................................................. 79 Fiche 1 – Groupage ABO – RH1............................................................................................................... 81 Fiche 2 – Exercices – Interprétations de résultats obtenus en minigel..................................................... 83 Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Introduction à l'immunohématologie 1 - Généralités L’immuno-hématologie correspond à l’étude : - des antigènes portés par les éléments figurés du sang - de l’immunisation qu’ils peuvent induire. - des pathologies qui en résultent. L'immuno-hématologie est donc une partie de la médecine commune à l'hématologie et à l'immunologie. Elle concerne l'étude: – des groupes sanguins – du système HLA – des Ac irréguliers (RAI) mis en cause dans les les incompatibilités fœto-maternelles, transfusionnelles – d'auto-Ac formés lors de pathologies auto-immunes … 2 - Prélèvement sanguin Le sang est généralement prélevé sur EDTA ou sur citrate de sodium. Un prélèvement sur tube sec ne permettra pas la réalisation de tests automatisés. Les procédures qui concernent les groupes sanguins, et les examens immuno-hématologiques en général, doivent être rigoureuses, en particulier pour ce qui concerne la prescription des examens et l'identification des prélèvements. ATTENTION : Deux déterminations du groupe sanguin sont nécessaires pour obtenir une carte de groupe sanguin. La législation précise : deux prélèvements effectués à des moments différents. Étiquetage des tubes : L'étiquetage des tubes doit se faire : ➔par la personne qui a prélevé, ➔immédiatement après le prélèvement, ➔sur le lieu du prélèvement, ➔en contrôlant l'identité du patient et en la lui faisant décliner chaque fois que cela est possible. Les contrôles doivent être particulièrement vigilants chez les sujets comateux et les nouveaux-nés. L'étiquette doit comporter les informations suivantes: nom du patient, nom de jeune fille, prénoms, sexe et date de naissance. B1ABM CM © 5 Introduction à l'immuno-hématologie Demande d'examen : Toute demande comporte les mêmes informations que celles figurant sur l'étiquette ainsi que : ➔les noms du prescripteur et du préleveur, ➔la date et l'heure du prélèvement, ➔et selon les types d'examen, des renseignements complémentaires chaque fois qu'ils sont utiles à la réalisation correcte de l'analyse et à son interprétation : antécédents d'anticorps anti-érythrocytaires, de grossesse ou de transfusions, de réactions transfusionnelles. Le prélèvement doit être stérile, de moins de 7 jours et conservé dans de bonnes conditions à + 4 °C. Cependant il est souhaitable d'effectuer la détermination du groupe sanguin dès que possible après le prélèvement. (en aucun cas une hémolyse ne doit être visible). 6 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques - Chapitre 1 Groupes sanguins Pré-requis : – Système ABO et système H : Structure des Ag érythrocytaires et tissulaires Génétique Propriétés des Ac plasmatiques Règles de transfusion – Système Rhésus Structure des Ag érythrocytaires Génétique Propriétés des Ac plasmatiques Règles de transfusion – Système Kell Structure des Ag érythrocytaires Génétique Propriétés des Ac plasmatiques Règles de transfusion – Système MNS, Duffy, Kidd, Lewis, Luthéran... Structure des Ag érythrocytaires Génétique Propriétés des Ac plasmatiques Règles de transfusion – Réactions immunologiques d'agglutination – Propriétés antigéniques des anticorps • Objectifs : – Savoir réaliser les tests de groupages et phénotypages sanguins – Savoir valider les tests réalisés – Savoir interpréter les tests réalisés – Connaître les règles de la transfusion B1ABM CM © 7 Introduction à l'immuno-hématologie Détermination des groupes sanguins 1 - Présentation générale des groupes sanguins Un certain nombre d’antigènes (plus de 250 connus à ce jour codés par 29 systèmes) sont présents sur les membranes des hématies humaines. Ces antigènes sont codés par des gènes correspondants à des systèmes dont la connaissance est nécessaire dans plusieurs domaines : transfusion sanguine, allo immunisation fœto-maternelle, transplantation ou études génétiques. Ces antigènes : – sont portés par des glycoprotéines et des glycolipides enchâssés dans la membrane des hématies et dirigés vers l’extérieur de la cellule. – sont divisés en deux groupes : 1°) Le groupe appelé « ABO et ses associés », pour lequel l'antigène est une glycoprotéine ou glycolipide. Les antigènes sont des polyosides et à ce titre ne peuvent être les produits directs de gènes, ceux-ci ne sachant synthétiser que des protéines. Ils en sont donc le produit secondaire. Les anticorps sont naturels (réguliers ou irréguliers), appartiennent à la classe des IgM, Ac froids et complets.. Ils rarement acquis ou immuns (appartenant plutôt à la classe des IgG). Ce groupe est principalement composé de ABO, Hh, Lewis. 2°) Le groupe appelé « Rhésus (Rh) et ses associés », dans lequel chaque molécule porte une spécificité propre. Les antigènes sont des protéines, (donc produits primaires des gènes). Les anticorps ne sont pas naturels mais immuns ; ils ne sont présents que s’il a existé une stimulation antigénique interhumaine (grossesse ou transfusion). Il appartient plutôt à la classe des IgG, Ac chauds et incomplets. Ce groupe est principalement composé de Rh, Kell, Duffy, Kidd, et MnSs. 2 - Principe des tests et validation technique Les tests mis en œuvre lors des groupages sanguins (ABO/RH) ou lors des phénotypages sanguins sont tous basés sur des réactions d'agglutination active directe (si Ac=IgM) ou indirecte (si Ac=IgG). La validation technique (ou analytique)du typage érythrocytaire repose sur : –des résultats conformes des témoins et des contrôles de qualités internes (CQI), –une absence de double population érythrocytaire. –un profil réactionnel cohérent, –une absence de discordance entre deux réalisations, –une absence de discordance avec des résultats antérieurs éventuels. 8 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 3 - Nomenclatures des principaux systèmes et antigènes de groupes sanguins Principaux antigènes Système Symbole ABO ABO MNS Rhésus Kell Duffy Kidd Lewis Luthéran B1ABM MNS RH KEL FY JK Le Lu Appellation courante Nomenclature internationale A ABO1 B ABO2 M MNS1 N MNS2 S MNS3 s MNS4 D RH1 C RH2 E RH3 c RH4 e RH5 K KEL1 k KEL2 Fya FY1 Fyb FY2 Jka JK1 Jkb JK2 Lea LE1 Leb LE2 Lua LU1 Lub LU2 CM © 9 Introduction à l'immuno-hématologie 4 - Principe général des règles transfusionnelles Avec les groupes ABO, Rh, Kell, Duffy, Kidd, MnS .. dont la connaissance assure la sécurité de la très grande majorité des transfusions, il est illusoire de penser que la réalisation des transfusions est « compatibles dans tous les systèmes ». La sécurité transfusionnelle repose sur le principe général suivant : Ne pas apporter, par les hématies transfusées : - un antigène absent chez le receveur (pour éviter que le receveur ne s’immunise à la suite de ces transfusions). - un antigène spécifique d' un anticorps présent dans le sérum (plasma) du receveur (pour éviter une réaction transfusionnelle liée à un conflit Antigène-Anticorps). En savoir plus Karl Landsteiner était un biologiste et médecin autrichien. Il a établit le premier classement des groupes sanguins, le groupe ABO. (1909) 10 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie D Activités technologiques Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 1 étermination des groupes sanguins du système ABO 1 - Principe La détermination des groupes ABO est basée sur le principe général de la réaction d’agglutination directe active. AGGLUTINATION : réaction sérologique spécifique entre un Ag particulaire et un Ac aboutissant à la formation d’un immuncomplexe formant un édifice multiparticulaire (appelé agglutinat) visible à l’œil nu ou à faible grossissement. ACTIVE : l’antigène fait partie intégrante de la particule DIRECTE : les anticorps intervenant sont des anticorps agglutinants (complets – IgM –) provoquant Cette détermination fait appel à deux épreuves : Une épreuve globulaire (de BETH-VINCENT-TZANCK) correspondant à l’identification des Ag globulaires à l’aide d’anticorps connus (sérums tests). Une épreuve sérique (de SIMONIN) correspondant à l’identification des Ac naturels à l’aide d’Ag connus (globules rouges tests). C'est la cohérence de ces 2 épreuves qui permet de conclure du groupe sanguin ABO. B1ABM CM © 11 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1 2 - Matériel 2.1 - Sang à tester Le sang est généralement prélevé sur EDTA ou éventuellement sur citrate de sodium.. 2.2 - Sérums tests Sérums polvclonaux d'origine humaine provenant de donneurs sélectionnés (= allo-antisérum) Anticorps monoclonaux d'origine murine (=hétéro-antisérum) : Sérum test anti-A (coloration bleue) Sérum test anti-B (coloration jaune) Sérum test anti-A et anti-B (coloration naturelle du sérum) « Sérums » d'origine animale ou végétale (= hétérosérum) : Sérum ou solution test anti-H = sérum d'anguille (xénoantisérum) ou phytoagglutinine extraite de graines d'Ulex europaeus. Solution test anti-A1 = phytoagglutinine extraite de graines de Dolichos biflorus 2.3 - Hématies-tests (hématies étalons lavées et prêtes à l'emploi) Hématies étalons Al, (Rhésus -) Hématies étalons A2, (Rhésus -) ne sont plus obligatoires Hématies étalons B, (Rhésus -) Hématies étalons 0, (Rhésus +) Ce sont des hématies humaines prélevées sur anticoagulant. Elles ont été lavées 3 fois en sérum physiologique puis remises en suspension dans une solution conservatrice. Les concentrations des suspensions globulaires dépendent de la technique retenue et des indications données par le fabricant pour chaque réactif Techniques sur plaque 10% (V/V) Techniques en tubes à hémolyse 5% (V/V) Techniques en microtubes (ou microplaque) 1 à 2 % (V/V) 2.4 - Petits matériels Plaque d’opaline et/ou plaque alvéolée à usage unique. Pipettes Pasteur ou Psipettes Agitateur en verre Tubes de Khan et Portoir. Centrifugeuse 12 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 3 - Mode opératoire 3.1 - Aspect législatif Le groupage ABO doit être effectué dans des conditions très précises et rigoureuses. Le GBEA (Guide de bonne exécution des analyses de biologie médicale) impose les conditions suivantes : La réalisation du groupage sanguin nécessite : • une épreuve globulaire de Beth Vincent à recherche des Ag érythrocytaires A (ABO1) et B (ABO2) avec les Ac monoclonaux anti-A (anti-ABO1) et anti-B (anti-ABO2) et anti-AB (antiABO3) L’annexe D II précise que : ... Le réactif anti-B utilisé ne doit pas donner de réaction croisée vis-à-vis de l’antigène B acquis. L’un des deux réactifs, anti- A ou anti-AB, doit pouvoir reconnaître les hématies Ax. • une épreuve plasmatique de Simonin à recherche des Ac anti-A et Anti-B avec les hématies tests A1 et B. Au moins une de ces hématies doit être de phénotype RH -1 Une détermination du groupe sanguin : deux définitions – 1er cas : technique totalement automatisée (groupage + contrôles + enregistrement des échantillons et des prescriptions): à 1 détermination = 1 réalisation exécutée par un lot de réactif et un technicien – 2ème cas : technique manuelle ou semi-automatisée : 1 détermination = 2 réalisations exécutées par 2 techniciens différents. La saisie manuelle doit aussi être réalisée par une double saisie par 2 personnes différentes. Un groupe sanguin valide doit être réalisé sur 2 prélèvements différents, à des temps réellement différents, à raison d’une détermination par prélèvement. 3.2 - Préparation du sang à grouper Culot de GR BVt BVp Sang N° S B1ABM 2 gouttes de culot globulaire 18 gouttes d’eau physiologique 5 gouttes d’eau physiologique Suspension à 5 % Technique en tube Suspension à 10 % Technique en plaque Plasma CM © 13 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1 3.3 - Technique sur plaque alvéolée Réalisation du groupage ABO : épreuve de Beth Vincent et épreuve de Simonin Épreuve globulaire de Beth vincent Déposer une goutte des sérums tests anti-A, anti-B, anti-A+anti-B (et éventuellement anti-H). Déposer une goutte de suspension globulaire à tester. Épreuve globulaire de Simonin Déposer une goutte de suspension globulaire à A1, A2, B. Déposer 2 gouttes du sérum à tester. Épreuve complémentaire : à effectuer uniquement si le test révèle un groupe A ou AB. Déposer une goutte des sérums tests anti-A1 et anti-H (ou anti-A1 uniquement si l’antiH est utilisé systématiquement) Déposer une goutte de suspension globulaire à tester. Animer la plaque d'un mouvement de va et vient afin de faciliter l'agglutination. Laisser reposer 30 secondes. Lire en imprimant un mouvement de « roulis » à la plaque et compléter par une seconde lecture au bout de 3 minutes. 5. GR O+ Témoins Allo AB Anti-A Anti –A1 Anti-B Anti A Anti B Anti-H Épreuve globulaire (Beth Vincent) anti-A antianti-B anti- anti-H A1* A+B GR A1 GR A2 GR B Ép. sérique (Simonin) A1 A2* B N° ………… auto Sérum AB BVp S S ang N°…. S uspe nsion 10% Plasma * : épreuves complémentaires (non obligatoires par la législation) Lecture D’une manière générale, les agglutinats de l’épreuve sérique apparaissent plus lentement que ceux de l’épreuve globulaire. Noter l’absence ou la présence d’agglutinats et leur intensité. - « +++ » 1 à 3 énormes agglutinats sur fond clair. - « ++ » jusqu’à 10 agglutinats sur fond clair. - « + » très nombreux agglutinats sur fond clair. - « (+) » innombrables agglutinats à la limite du visible sur fond clair. - « - » absence d’agglutinats-suspension rosée homogène. Signaler aussi la présence éventuelle d’une image de double population (notée ++/--) ou d’une hémolyse partielle. 14 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 3.4 - Technique en tube Les réactions sont effectuées dans 6 ou 8 tubes de la même façon que pour la technique en plaque, en utilisant les mêmes volumes de réactifs. Boucher les tubes. Agiter légèrement les tubes. Centrifuger 1 minute à 500 g (environ 1000 rpm). Lire par remise en suspension des culots. Épreuve globulaire Sang N°…. Suspension 5% Anti-A Anti - B Anti-A Anti-B Anti-H Épreuve sérique AntiA1 GR A1 GR A2 GR B GR O BVt Plasma S Introduire : 1 goutte de suspe nsion globulaire te st à 5% 2 gouttes de sérum à tester Introduire : 1 goutte de sérum test 1 goutte de suspe nsion globulaire à tester à 5% Modalités de lecture - « +++ » : le culot se décolle et se dissocie en 3 amas maximum (agglutinat volumineux non dissocié sur fond clair). - « ++ » : le culot se dissocie en de nombreux amas volumineux (agglutinat volumineux sur fond clair). - « + » : le culot se dissocie en de nombreux petits amas (agglutinat fin sur fond rosé). - « - » : suspension homogène (« fumée de cigarette »). 3.5 - Témoins Le témoin auto est réalisé systématiquement, les témoins AB et allo sont surtout réalisés uniquement en cas de discordance entre les épreuves globulaires et sériques. Mais par mesure de sécurité, les 3 témoins seront réalisés systématiquement au cours des groupages ABO. ➔Témoin « auto » = une goutte de sérum à tester et une goutte de GR à tester ➔Témoin « AB » = une goutte d'un sérum de groupe AB (appelé sérum AB, à ne pas confondre avec le sérum anti-A + anti-B) et une goutte de GR à tester. ➔Témoin « allo » = 2 gouttes de sérum à tester et une goutte de GR test. B1ABM CM © 15 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1 4 - Résultat 4.1 - Validation technique 4.1.1 - Conformité des témoins La validation du test exige la conformité des témoins Rôle des témoins : Témoin auto : (sérum du sujet et GR du sujet) effectué systématiquement. L'absence d'agglutination témoigne de l'absence d’auto- anticorps (agglutinines froides). Témoin allo : (sérum du sujet et GR O). L’absence d’agglutination garantit l’épreuve sérique. S’il y agglutination, il peut démonter la présence d’allo anticorps irréguliers. L’emploi systématique de ce témoin a été préconisé ci-dessus. Ce témoin, permet de vérifier que le sérum du sujet ne contient pas d’Ac capables de reconnaître les Ag autres que les Ag A et les Ag B (Milieu albumineux). Témoin AB : (sérum « AB » et GR du sujet). L’absence d’agglutination garantit l’absence de polyagglutinabilité et garantit l’épreuve globulaire. Il n’est pas nécessaire lors de l’emploi d’anticorps monoclonaux. Ce témoin permet de vérifier que les GR du sujet ne sont pas reconnus par des Ac autres que les Ac anti-A et Anti-B (Milieu albumineux). Si un des trois témoins est positif , schématiquement : -témoin auto + : signifie agglutinines froides ou rouleaux -témoin allo + : signifie présence d’agglutinines irrégulières -témoin AB + : signifie polyagglutinabilité 4.1.2 - Conformité des contrôles de qualité internes (CQI) Des échantillons de contrôle de phénotype garantis sont testés; ces contrôles comprennent au minimum: •un échantillon de groupe A •un échantillon de groupe B •un échantillon de groupe O 4.1.3 - Conformité des résultats des deux épreuves. Attention, aucun résultat n’est valable, si la concordance entre les deux épreuves n’est pas vérifiée. 16 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Résultats obtenus avec les groupes et sous-groupes du système ABO ÉPREUVE GLOBULAIRE (BETH VINCENT) GROUPE A1 A2 B Anti-A Anti-B Anti-A + anti-B +++ +++ - ++ - +++ ++ +++ ÉPREUVE SÉRIQUE (SIMONIN) Anti- H AntiA1 Ag - +++ A, A1 ++ - A, H B - GR A1 GR A2 GR B GR O Ac Anti B - - ++ - - - ++ - +++ ++ - - - - - - - - - - + ++ - (+ rare) Anti B (anti A1) Anti A (+parfois ) A1B +++ ++ +++ - +++ A2B ++ ++ ++ ++ - O - - - +++ A, A1, B A, H, B H Mise en évidence des Ag membranaires (+ parfois) ++ (anti A1) Anti A Anti B Mise en évidence des Ac naturels réguliers Difficultés du groupage ABO – discordance entre les deux épreuves Le cas le plus fréquent, et normal, de discordance est l’absence d’Ac naturels chez le nouveau né. Il existe de nombreuses autres causes de discordance. Il faut alors refaire le groupage après avoir lavé les hématies du sujet et éventuellement décomplémenté son sérum (30 minutes à 56°C). Il faut en outre effectuer les témoins AB et allo. B1ABM CM © 17 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 2 Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 2 Exercices: groupage ABO 1 - Patient (A) adulte TÉMOINS : Préciser la composition et le rôle des témoins effectués. Auto Allo AB Aspect Agglutination : Épreuve……………................de ……………………………….................................................. Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum Anti-A Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1 Épreuve……………................de ……………………………......…. GR A1 GR A2 GR B Interprétation : Interprétation : Conclusion - Interpréter les deux épreuves puis conclure. 2 - Patient (B) adulte Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ». Épreuve……………................de ……………………………….................................................. Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum Anti-A Anti-B Anti A+ B Anti-H Anti-A1 Épreuve……………................de ……………………………......…. GR A1 GR A2 GR B Interprétation : Interprétation : Conclusion - 18 Interpréter les deux épreuves puis conclure. CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 3 - Patient (C) adulte Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ». Épreuve……………................de ……………………………….................................................. Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum Anti-A Anti-B Anti A+B Anti-H Anti-A1 Épreuve……………................de ……………………………......…. GR A1 GR A2 GR B Interprétation : Interprétation : Conclusion - Interpréter les deux épreuves puis conclure. 4 - Patient (D) adulte Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ». Épreuve……………................de ……………………………….................................................. Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum Anti-A Anti-B Anti-A+ Anti-H Anti-A1 anti-B Épreuve……………................de ……………………………......…. GR A1 GR A2 GR B Interprétation : Interprétation : Conclusion - B1ABM Interpréter les résultats déjà obtenus, donner le groupe présumé en le justifiant et proposer les résultats (cohérents) de l’épreuve de Beth-Vincent . CM © 19 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 2 5 - Patient (E) adulte Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ». Épreuve……………................de ……………………………….................................................. Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum Anti-A Anti-B Anti-A+ Anti-H Anti-A1 anti-B Épreuve……………................de ……………………………......…. GR A1 GR A2 GR B Interprétation : Interprétation : Conclusion - Interpréter les résultats déjà obtenus, donner le groupe présumé en le justifiant et proposer les résultats (cohérents) de l’épreuve de Simonin. 6 - Nourrisson de 2 mois (F) Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ». Épreuve……………................de ……………………………….................................................. Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum Anti-A Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1 +++ +++ + - Interpréter les deux épreuves puis conclure. Épreuve……………................de ……………………………......…. GR A1 GR A2 GR B - - - 7 - Patient J adulte Auto - Allo +++ AB - Témoin : Épreuve……………................de Épreuve……………................de ……………………………….................................................. ……………………………......…. Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B Anti-A Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1 +++ +++ +++ - Conclure d’après les résultats obtenus. 20 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 3 R echerche de la substance H dans la salive La substance H (ou AgH « tissulaire ») soluble peut être trouvée dans la salive ou autres liquides physiologiques d'individus appelés « sécréteurs ». 1 - Principe du test Il s'agit d'une inhibition d'agglutination (active directe) 2 - Protocole 2.1 - Préparation de l'échantillon de salive Collecter environ 2 mL de salive fraîche dans un tube de verre Placer le tube au bain marie bouillant pendant 10 min Centrifuger le tube fortement pendant 10 min. Utiliser immédiatement le surnageant pour le congeler immédiatement pour des tests ultérieurs. 2.2 - Préparation de la suspension d'hématies Préparer une suspension à 3-5% d'hématies de groupe O dans une solution saline isotonique. B1ABM CM © 21 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 3 2.3 - Mode opératoire Dans un tube à hémolyse en verre, verser: - 3 gouttes (100 µL) de surnageant salivaire - 1 goutte (100 µL) de anti-H lectin Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 min - Ajouter 1 goutte (50 µL) de suspension d'hématies Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min Bien mélanger et centrifuger pendant 1 min à 1000 rpm. Remettre délicatement les hématies en suspension et au-dessus d'un éclairage indirect, observer la présence éventuelle d'agglutinats. 3 - Questions - Proposer les génotypes possibles d'un sujet O sécréteurs et d'un sujet O non sécréteur. - Schématiser, au niveau moléculaire et cellulaire, la réaction sérologique dans le cas où il y a : ➔ présence de substance H (Ag H« tissulaire ») soluble ➔ absence de substance H (Ag H« tissulaire ») soluble - Expliquer l'expression : « inhibition d'agglutination » - Relier les expressions suivantes: Les hématies agglutinent Les hématies n'agglutinent pas L'Ag H « tissulaire » a été secrété dans la salive L'Ag H « tissulaire » n'a pas été secrété dans la salive - Proposer un mode opératoire précis pour préparer 1 mL de suspension d'hématies de groupe O à 3 % dans une solution saline isotonique. - Proposer la composition qualitative et quantitative de trois témoins permettant la validation de la technique. Préciser également le rôle de ces témoins. - Proposer un tableau récapitulatif présentant la composition de chaque test réalisé et le résultat attendu des témoins. 22 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 4 Groupage Rhésus standard Il consiste à rechercher l'Ag D (RH1) à la surface des hématies. Cette recherche s'effectue en association avec la recherche des Ag A (ABO1), B (ABO2) et des Ac anti-A (anti-ABO1) et anti-B (anti-ABO2) lors du groupage ABO-RH1. 1 - Principes Recherche des Ag D éventuellement présents à la surface des hématies (épreuve globulaire) Par agglutination active indirecte (artificielle) - à l'aide d’un sérum test contenant des Ac antiD (IgG) enrichi en albumine (=artifice) à 37°C. Par agglutination active directe à l’aide d’un sérum test contenant des Ac anti-D (IgM) en milieu salin. - Les IgG sont : - non spontanément agglutinant en milieu salin - des Ac « chauds », nécessitant une température de 37-40°C. Les IgM sont : spontanément agglutinant en milieu salin des Ac « froids », ne nécessitant pas forcément une température de 37-40°C. Pour obtenir une agglutination des hématies par les Ac anti-D (IgG) - un artifice est nécessaire la présence d’albumine provoque la diminution du potentiel zêta en masquant les charges négatives entourant les GR. - la réaction immunologique s’effectue à 37°C (utilisation d’un Rhésuscope) Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-D régulier. Si une personne Rh- possède des anti-D, ce sont des Ac immuns (irréguliers) – IgG. B1ABM CM © 23 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4 Schémas immunologiques Agglutination active indirecte Agglutination active directe Hématies D + (Rhésus +RH1 (GR du patient) Z Z SENSIBILISATION DES GLOBULES ROUGES À TESTER. ADDITION DE L’ARTIFICE MILIEU ALBUMINEUX Sérum test (Ac anti-D IgG) Sérum-test (Ac anti-D – IgM) Albumine AGGLUTINATION L’artifice entraîne la diminution du potentiel zêta (Z), en masquant les charges négatives. La distance entre les hématies diminue agglutination des GR par les IgG anti D. 24 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 2 - Agglutination sur plaque alvéolée jetable 2.1 - Matériel et réactifs Agglutination active indirecte Agglutination active directe (méthode ancienne ) (méthode actuelle) Sang à tester : recueilli sur EDTA (généralement). à tester rapidement (au plus tard 48 h), sinon conserver à 2-8°C. Contrôles de qualité internes ou GR témoins : GBEA : [O,RH1 (D+)], [O,RH-1 (D-) et [O, RH1 faible] est préconisé en plus dans la norme iso15189 - Sérum test anti-D enrichi en albumine bovine (BSA). Ig G anti-D monoclonale humaine - Sérum témoin ou Rh contrôle sans Ac antiD, mais enrichi en albumine bovine. Rhésuscope : plaque chauffante (40°C) mobile autour d’un axe. - vérifier la température de la plaque au moment de son utilisation. Une température supérieure à 45°C provoque une dessiccation importante des gouttes de réactifs (fausse réaction positive ou difficulté de lecture). GBEA : sérum anti-D monoclonal D'autres normes préconisent : -2 sérums anti-D salin contenant des Ac monoclonaux (IgM) provenant au moins de 2 clones différents. -1 sérum anti-D ne devant pas détecter l'Ag variant DVI :sérums tests D(VI+) et D(VI-) - Sérum témoin Rh contrôle sans anti-D, salin. Rhésuscope non indispensable Température de 20°C ou de 40°C 2.2 - Mode opératoire Annoter correctement la plaque alvéolée. 2.2.1 - Préparation du sang à tester Dans un tube soigneusement référencé, verser 6 gouttes de plasma et 4 gouttes de culot globulaire à tester. 37°C 6 gouttes de plasma Plasma Culot de GR 4 gouttes de culot globulaire Suspension à 40 % dans son plasma TECHNIQUE EN PLAQUE B1ABM CM © 25 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4 2.2.2 - Technique : agglutination active directe Déposer rapidement sur la plaque alvéolée, comme indiqué sur le schéma ci-dessous Sg RH1 CQI + (O,RH1) Gouttes de suspension de GR à 40 % T Sg N° R T Sangs à tester T R Sg RH-1 Sg N° R T CQI (O,RH-1) R Gouttes de sérum test Sérum RH Anti-D* contrôle * En laboratoire, deux sérums tests sont parfois utilisés : sérum-test anti-D(VI+) et anti-D(VI-). Mélanger et essuyer l’agitateur entre chaque réaction. Incliner la boîte chauffante d’un angle juste suffisant pour permettre l’homogénéisation des gouttes. Poursuivre l’agitation pendant 3 minutes Effectuer la lecture des agglutinats. 2.2.3 - Contrôles de qualité internes (CQI) Utilisation d’échantillons de contrôle de phénotype garantis comprenant au minimum: un échantillon d'hématies tests de groupe RH1 (avec AgD) un échantillon d'hématies tests de groupe RH-1 (sans AgD) Les normes iso 15189 préconisent en plus: un échantillon d'hématies test de groupe RH1 faible (Ag D présent en faible quantité) 26 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 3 - Agglutination en tube Les hématies à tester sont lavés puis préparés en suspension à 3-5% en milieu sérique (dans leur propre plasma). Les témoins effectués sont les mêmes que ceux réalisés au cours de la technique en plaque. Préparer et annoter correctement le nombre de tubes nécessaires. Introduire dans les tubes 50 µL de GR à tester et 50 µL de sérum test. Boucher les tubes. Si l’agglutination est active indirecte : incuber 45 minutes au bain thermostaté à 37°C ou à l’étuve à 37°C (tubes bouchés). Centrifuger 1 minute à 1000 tours / min (tubes bouchés). Effectuer la lecture en remettant doucement en suspension le culot d’hématies. Illustration 1: Résultat d'une agglutination en tube B1ABM CM © 27 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4 4 - Lecture et interprétation des résultats 4.1 - Témoins CQI (+) : hématies [O, RH1] et sérum test anti-D L’agglutination témoigne de l’efficacité du sérum test anti-D. ce témoin indique également le moment de lecture des autres tests. CQI (-) : hématies [O, RH-1] et le sérum test anti-D L’absence d’agglutination témoigne de la spécificité du sérum test anti-D, et de l’absence de rouleaux d’hématies pouvant provenir de l’addition éventuelle d’albumine. Ce témoin limite le temps de lecture, au-delà duquel survient la dessiccation. 4.2 - Lecture des tests 4.2.1 - Témoin (T) : Composition : hématies à tester et sérum Rhésus contrôle sans anti-D L’absence d’agglutination vérifie l’absence : d’auto-agglutination des hématies provoquée par des auto-Ac (anémie hémolytique autoimmune) d’agglutination provoquée par des allo Ac (maladie hémolytique du nouveau né) de rouleaux d’hématies. Si les 3 témoins sont validés lecture du test R (réaction) 4.2.2 - Test « réaction » (R) La présence d’une agglutination (réaction positive) atteste de la présence d’AgD à la surface des hématies à tester ; le sang est alors dit Rh positif (RH1) L’agglutination doit être nette avec des amas d’hématies bien visibles au centre et en périphérie. L’absence d’agglutination (réaction négative) indique que les hématies à tester ne possèdent pas l’AgD ; le sang est dit Rh négatif (RH-1). L’absence d’agglutination doit être très nette. En cas de doute vis-à-vis de la dessiccation, rajouter une goutte d’eau physiologique sur la tâche, mélanger avec un agitateur : le mélange devient homogène, la réaction est négative une agglutination vraie est observée, les amas d’hématies sont plus nettement perçus, la réaction est positive. Une agglutination faible et retardée signifie que la réaction est douteuse, une présence d’Ag D faible est possible. Toute agglutination douteuse sera contrôlée par une réaction plus sensible : test de Coombs indirect. 28 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 5 - Recherche de l’Ag D faible et de l'Ag D partiel Ag D faible : L'Ag D est présent mais en faible quantité à la surface des hématies; par conséquent il est faiblement ou pas du tout agglutiné par le sérum anti-D. Faiblement retrouvé dans la population blanche, cet Ag faible est très fréquent dans la population noire. Les patients possédant l'Ag faible sont considérés Rhésus +. Ag D partiel : C'est un Ag D incomplet, auquel il manque des épitopes (ex: DIV, DVII etc ...). Les patients possédant un Ag D partiel sont considérés comme Rh – s'ils sont receveurs et Rh+ s'ils sont donneurs. Remarque : une mère ayant un Ag D partiel peut s'immuniser contre un épitope de l'Ag D qu 'elle ne possède pas, si son enfant possède l'Ag D complet. Une technique plus sensible de détection de l’AgD, la réaction de Coombs indirecte ou test indirect à l'antiglobuline (TIA), est utilisée. L’arrêté du 26 avril 2002 ne mentionne plus l’obligation d’identifier les sujets RH1 faible à l’aide d’un test indirect à l’antiglobuline. Cette décision se base d’une part sur l’amélioration des performances des réactifs monoclonaux anti-RH1 utilisés au laboratoire. Cependant, si dans de nombreux laboratoires d’immuno-hématologie, la recherche de RH1 faible n’est plus réalisée chez les patients en vue de transfusion, elle est dans la plupart des cas encore effectuée chez la femme enceinte et le nouveau-né. 5.1 - Principe de la réaction de Coombs indirecte Il consiste à rechercher un Ag (ex : Ag Du) à la surface des hématies par agglutination active indirecte à l’aide d’Ac spécifiques (ex : anti-D) en milieu salin. Les hématies sensibilisées par les Ac sont lavées pour éliminer les Ac non fixés sur les hématies puis sont agglutinées en présence d’anti-globulines humaines (AGH). Si les Ac spécifiques sont des Ac « chauds » (IgG), la réaction de sensibilisation s’effectue à 37-40°C Schéma immunologique : cf. page 30 5.2 - Technique en tube Préparer une suspension d’hématies à 3-5% en eau physiologique. Introduire dans 2 tubes, respectivement une goutte de sérum anti-D et une goutte de sérum Rh contrôle (sans anti-D). Verser une goutte de suspension globulaire à tester dans chaque tube Agiter doucement puis incuber 15 min à 37°C. Laver les hématies 2 fois en eau physiologique et jeter l’eau du dernier lavage. Ajouter au culot d’hématies, 2 gouttes d’antiglobulines humaines (AGH) polyvalente ou 2 gouttes d’anti-IgG humaine. Homogénéiser puis centrifuger 1 min à 1000 tours/min Effectuer la lecture en remettant doucement en suspension le culot d’hématies. Remarque : On peut effectuer des contrôles de qualité (CQI) positif et négatif à l’aide de suspension d’hématies témoins [O,RH1] ,[O,RH-1] et [O,RH1 faible]. B1ABM CM © 29 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4 Schéma immunologique : recherche de l'Ag D faible par la réaction de Coombs indirecte Hématies porteuses de l'Ag D faible. 37°C Sensibilisation des hématies par des Ac anti-D (IgG) polyvalents Élimination des anti-D non fixés par des cycles de lavage et centrifugation . Ajout d'une anti-globuline humaine polyvalente ou d'une anti-IgG Agglutination active indirecte (ou artificielle) 30 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 5 Phénotypage Rhésus complet Ce phénotypage Rhésus complet s'effectue au laboratoire, en association avec la recherche de l'Ag K : phénotypage RH-KEL1 1 - Principes Ils reposent sur les mêmes principes d’agglutination que le groupage Rhésus standard. Recherche des Ag D,C,E,c,e éventuellement présents à la surface des hématies (épreuve globulaire) Par agglutination active indirecte (artificielle) Par agglutination active directe à l’aide d’un sérum test contenant des Ac antiD, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e (IgG) enrichi en albumine (=artifice) à 37°C. à l’aide d’un sérum test contenant des Ac antiD, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e (IgM) en milieu salin. Les IgG sont : – non spontanément agglutinant en milieu salin – des Ac « chauds », nécessitant une température de 37-40°C. Les IgM sont : spontanément agglutinant en milieu salin des Ac « froids », ne nécessitant pas une température de 37-40°C. Pour obtenir une agglutination des hématies par les Ac anti-D (IgG) - un artifice est nécessaire la présence d’albumine provoque la diminution du potentiel zêta en masquant les charges négatives entourant les GR. - la réaction immunologique s’effectue à 37°C (utilisation d’un Rhésuscope) Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-Dou anti-.... régulier. Si une personne Rh- possède des anti-D, ce sont des Ac immuns (irréguliers) - IgG B1ABM CM © 31 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5 Schémas immunologiques Agglutination active indirecte Agglutination active directe Hématies D + (RH1)) (GR du patient) Z Z Sérum test (Ac anti-D ou anti-C ou … IgG) ADDITION DE L’ARTIFICE MILIEU ALBUMINEUX Sérum-test (Ac anti-D ou anti-C ou … - – IgM) Albumine AGGLUTINATION L’artifice entraîne la diminution du potentiel zêta, en masquant les charges négatives. La distance entre les hématies diminue : agglutination des GR par les IgG anti-D. 32 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 2 - Agglutination sur plaque alvéolée jetable 2.1 - Matériel et réactifs Agglutination active indirecte Agglutination active directe Sang à tester : recueilli sur EDTA (généralement). à tester rapidement (au plus tard 48 h), sinon conserver à 2-8°C. CQI : hématies tests phénotypées (cf.§2.2.2) Sérum test enrichi en albumine bovine (BSA). Ig G anti-D monoclonale humaine Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c, Anti-e Sérum salin contenant des IgM monoclonaux : Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c, Anti-e Sérum témoin ou Rh contrôle sans Ac anti-D, mais enrichi en albumine bovine. Sérum témoin Rh contrôle sans anti-D, salin. Rhésuscope : plaque chauffante (40°C) mobile autour d’un axe. - vérifier la température de la plaque au moment de son utilisation. Une température > 45°C provoque une dessiccation importante des gouttes de réactifs (fausse réaction positive ou difficulté de lecture) Rhésuscope non indispensable Température de 20°C ou de 40°C Les sérums tests utilisés : Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c, Anti-e. 2.2 - Mode opératoire Certains sérums test utilisés comportent des IgG : par conséquent la technique s’effectuera en milieu albumineux et à 37°C (Rhésuscope) : il s’agit alors d’une agglutination active indirecte. 2.2.1 - Préparation du sang à tester Préparer dans un tube soigneusement référencé, un échantillon du sang à grouper, en plaçant 6 gouttes de plasma et 4 gouttes de culot globulaire, de manière à obtenir une suspension à 40 % dans son plasma. (milieu albumineux). 2.2.2 - Témoins et contrôles de qualité internes D'après le GBEA, chaque sérum-test doit être validé à l'aide d'hématies tests phénotypées CQI+ et CQI-. Un témoin (T Rh) doit être réalisé pour chaque lot d'hématies phénotypées utilisées . Ceshématies ne doivent pas agglutiner dans le sérum rhésus contrôle (sans Ac du système Rhésus). Ce sérum contrôle Rh est salin si les sérums tests utilisés sont salins, il est albumineux, si les sérums tests sont albumineux. B1ABM CM © 33 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5 Validation du sérum test anti-DCE à l'aide des hématies tests :GR-CQI (+) [D+,C+,c+,E+,e+] et GR-CQI (-) [D-,C-,c+,E-,e+] Schéma de la plaque : GRCQI+ GRCQI- CQI (+) 2 gouttes de suspension de GR à 40 % 1 T Rh* CQI (-) 3 2 4 T Rh* R R 1 goutte de sérums tests Sérum Rh contrôle Anti-DCE Validation du sérum test anti-C (anti-RH2) à l'aide des hématies tests : T+ [C+, c+] ou RH:2,4 et T- [C-, c+] ou RH:-2,4 La technique est la même que précédemment, le sérum test anti-DCE est remplacé par le sérum test anti-C. Validation du sérum test anti-E (anti-RH3) à l'aide des hématies tests : T+ [E+, e+] ou RH:3,5 et T- [E-, e+] ou RH:-3,5 Validation du sérum test anti-c (anti-RH4) à l'aide des hématies tests : T+ [C+, c+] ou RH:2,4 et T- [C+, c-] ou RH:2,-4 Validation du sérum test anti-e (anti-RH5) à l'aide des hématies tests : T+ [E+, e+] ou RH:3,5 et T- [E+, e-] ou RH:3,-5 2.2.3 - Phénotypage - Si le Rh standard est connu (cas général), il est inutile de tester les hématies du patient avec le sérum test anti-D - Si le Rh standard est positif (individu RH-1), il est inutile d'utiliser le sérum anti-DCE. Le phénotypage avec les sérums anti-D, anti-C, anti-c, anti-E et anti-e, sont à effectuer en fonction des résultats obtenus avec le sérum testé précédemment. Il faut être logique et chronologique. Il existe un antithétisme, c'est-à-dire que le globule rouge porte soit C, soit c soit les 2 et soit E, soit e, soit les 2. Il faut donc effectuer le phénotypage en tenant compte de ces données. 34 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Schéma de la plaque : Sg N° 1 2 gouttes de T Rh suspension à 40 % 2 DCE 3 D 4 C 5 c 6 E 7 e Anti-c Anti-E Anti-e 1 goutte de sérum test Sérum Rh contrôle Anti-DCE Anti-D Anti-C Mélanger sans attendre à l'aide d'un agitateur bien propre. Agiter en inclinant doucement la plaque sur le rhésuscope par des mouvements lents de balancier pendant 1 à 3 min environ. Observer s'il y a agglutination ou pas. 3 - Résultats et interprétation 3.1 - Contrôles de qualité internes (CQI) et témoin CQI positifs : Ces contrôles doivent présenter une agglutination. Ils contrôlent l’efficacité des réactifs.. Ce témoin indique également le temps de lecture. Dès que l’agglutination apparaît pour le sang témoin positif, on peut lire les sangs à tester. CQI négatifs : Ce témoin ne doit pas présenter d’agglutination. Ils contrôlent la spécificité des sérums tests, l’absence de rouleaux due à l’addition d’albumine et enfin limite le temps de lecture (au-delà de laquelle survient la dessiccation). Témoin Rh ou témoin effectué avec le sérum test albumineux Ce témoin doit être négatif, c'est-à-dire, ne doit pas présenter d’agglutination. Une image de rouleaux ou d’agglutination de cette goutte interdit toute interprétation de la lecture de la réaction elle-même. B1ABM CM © 35 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5 3.2 - Lecture des tests Lecture de la réaction : La réaction ne peut être lue que si tous les témoins sont corrects. - Agglutination : La réaction est positive. L’agglutination doit être nette avec des amas de globules rouges aussi bien visibles au centre qu’à la périphérie de la tâche. Cela signifie que le globule rouge porte l’Ag correspondant au sérum utilisé. - Absence d’agglutination : La réaction est négative. L’absence d’agglutination doit être très nette. En cas de doute vis-à-vis de la dessiccation, rajouter une goutte d’eau physiologique sur la tâche, mélanger avec l’agitateur. Cela signifie que le globule rouge ne porte pas l’Ag correspondant au sérum utilisé. 4 - Mode opératoire - technique en tube La technique se conduira selon le même principe que la technique en tube du groupage Rhésus. Les hématies sont lavées puis mises en suspension à 5 % en eau physiologique et les tubes placés à température ambiante. 5 - Fréquence des haplotypes Haplotype DCe (R1) Fréquence en France 42 FRÉQUENTS dce (r) DcE (R2) 39 13 Dce (R0) 2 RARES dCe (r’) dcE (r’’) 1 0,05 TRÈS RARES DCE (Rz) dCE (ry) 0,03 0 Astuces mnémotechniques pour retenir les 3 haplotypes les plus fréquents : écrire, comme ci-dessous dans les cases, les allèles D,d,C,c,E,e dans l'ordre alphabétique et en respectant la casse. CD e 36 c d e CM © c DE B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie D Activités technologiques Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 6 étermination du groupe érythrocytaire dans le système Kell Il est effectué au laboratoire en association avec le phénotypage Rhésus : RH-KELL1 1 - Généralités Le système Kell correspond à un ensemble de couples d'allèles codominants et antithétiques: • les allèles K et k codant pour 2 Ag principaux K (KEL1) et k (KEL2) • les allèles Kpa et Kpb codant pour les Ag Kpa (KEL3) de faible fréquence et l'Ag Kpb (KEL4), très largement répandu. 1.1 - Antigènes K et k, deux Ag antithétiques principaux Les antigènes Kell ou K ou encore KEL1 (nomenclature internationale) et cellano ou k ou encore KEL2 (nomenclature internationale) sont codés par des allèles codominants et antithétiques, par conséquent il existe trois phénotypes courants : K- , k+ ou KEL-1,2 (génotype k//k). Ils représentent 91% de la population caucasoïde. K+, k+ ou KEL1,2 (génotype K//k). Ils représentent 9 % de la population. K+, k- ou KELL1,-2 (génotype K//K). Ils représentent 0,02 % de la population. Ces derniers ne possèdent donc pas l’antigène de grande fréquence k ou Cellano (possédé par 99,98% de la population blanche). Dans la pratique courante des laboratoires, la recherche se limite à l’Ag Kell car il est après l'Ag D le plus immunogène des antigènes de groupes sanguins. Transfusions: – Un sujet K+, k+ pourra recevoir tous types de phénotype Kell, puisqu’il ne pourra s’immuniser contre aucun des deux antigènes. – Un sujet K-, k+ doit recevoir du sang K-. Dans le cas contraire on prend le risque de l’immuniser et de lui faire produire un anti-K, ce qui se produira statistiquement dans un tiers des cas. – Un sujet K+, k- doit déjà être considéré comme un « receveur dangereux » car l’allo anti-k qu’il est susceptible de développer est un anticorps « anti-public » c’est à dire dirigé contre un antigène de grande fréquence dans la population (ici 99,98%) c’est à dire qu’il rendra toute transfusion ultérieure incompatible. Conséquence : Si le receveur est K+, il faut vérifier qu'il possède aussi l'Ag k (agglutination de ses hématies avec un sérum anti-k), afin de s’assurer que les deux antigènes sont bien présents et que ce sujet ne doit pas être considéré comme un « receveur dangereux ». B1ABM CM © 37 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 6 1.2 - Anticorps du système Kell Ce sont, comme les anti-RH des anticorps : immuns, nécessitant donc une stimulation (lors de transfusion ou lors d'une grossesse) IgG, Ac incomplet, chaud à propriétés hémolysantes en présence de complément (hémolysines) traversant le placenta n'activant pas le complément. Conséquences: Ils peuvent donner des hémolyses intra-tissulaires et être responsables d’accidents hémolytiques de transfusion. Ils peuvent être aussi à l’origine d’une incompatibilité fœto-maternelle. 2 - Principes Les principes sont les mêmes que pour la recherche des Ag Rhésus. • 1er principe : si le réactif anti-KEL1 est d'origine polyclonal (IgG) La présence d'Ag K est recherchée à la surface des hématies d'un patient par agglutination active indirecte à l'aide d'un réactif anti-K enrichi en albumine à 37°C. (épreuve globulaire uniquement). • 2ème principe : si le réactif anti-KEL1 est d'origine monoclonal (IgM) La présence d'Ag K est recherchée à la surface des hématies d'un patient par agglutination active directe à l'aide d'un réactif anti-K en milieu salin et à température du laboratoire. (épreuve globulaire uniquement). Les agglutinations peuvent être réalisées en plaque, en tube, en microplaque ou en gel. Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-K régulier. Si une personne K- possède des anti-K, ce sont des Ac immuns (irréguliers) – IgG 38 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 3 - Agglutination active directe en plaque alvéolée 3.1 - Mode opératoire Annoter correctement la plaque alvéolée. 3.1.1 - Préparation du sang à tester Dans un tube soigneusement référencé, verser 6 gouttes de plasma et 4 gouttes de culot globulaire à tester. 37°C 6 gouttes de plasma Plasma 4-5 gouttes de culot globulaire Culot de GR Suspension de GR à 40 % dans son plasma TECHNIQUE EN PLAQUE 3.1.2 - Technique • Déposer rapidement sur la plaque alvéolée, comme indiqué sur le schéma ci-dessous. CQI – (O,K-) Gouttes de suspension de GR à 40 % Sg N° Sg T- T R T Sangs à tester R Sg N° T Sg T+ R T CQI + (O,K+) R Gouttes de sérum test AntiKEL1 Sérum Kell contrôle • Si nécessaire, allumer le rhésuscope, vérifier la température et poser la plaque • Mélanger et essuyer l’agitateur entre chaque réaction. • Incliner la boîte chauffante d’un angle juste suffisant pour permettre l’homogénéisation des gouttes. • Poursuivre l’agitation pendant 3 minutes • Effectuer la lecture des agglutinats. B1ABM CM © 39 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 6 3.1.3 - Contrôles qualité internes (CQI) Utilisation d’échantillons de contrôle de phénotype garantis comprenant au minimum: ➢ un échantillon de groupe K + (KEL1) ➢ un échantillon de groupe K - (KEL-1). 4 - Lecture et interprétation des résultats 4.1 - Contrôles de qualité internes CQI positif : hématies [O, K+] et sérum test anti-K L’agglutination témoigne de l’efficacité du sérum test anti-K. ce témoin indique également le moment de lecture des autres tests. CQI négatif : hématies [O, K-] et le sérum test anti-K L’absence d’agglutination témoigne de la spécificité du sérum test anti-K, et de l’absence de rouleaux d’hématies . Ce témoin limite le temps de lecture, au-delà duquel survient la dessication. 4.2 - Lecture des tests 4.2.1 - Témoin (T) : Composition : hématies à tester et sérum Kell contrôle sans anti-K L’absence d’agglutination vérifie l’absence : - d’auto-agglutination des hématies provoquée par des auto-Ac (anémie hémolytique autoimmune) - d’agglutination provoquée par des allo Ac (maladie hémolytique du nouveau né) - de rouleaux d’hématies. Si les 3 témoins sont validés lecture du test R (réaction) 4.2.2 - Test « réaction » (R) La présence d’une agglutination (réaction positive) atteste de la présence d’AgK à la surface des hématies à tester ; le sang est alors dit K positif (KEL1) L’agglutination doit être nette avec des amas d’hématies bien visibles au centre et en périphérie. L’absence d’agglutination (réaction négative) indique que les hématies à tester ne possèdent pas l’Ag K ; le sang est dit K négatif (KEL-1). L’absence d’agglutination doit être très nette. En cas de doute vis-à-vis de la dessication, rajouter une goutte d’eau physiologique sur la tâche, mélanger avec un agitateur : - le mélange devient homogène, la réaction est négative - une agglutination vraie est observée, les amas d’hématies sont plus nettement perçus, la réaction est positive. 40 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 7 Phénotype étendu 1 - Définition de l'analyse Cette analyse consiste à rechercher un ou plusieurs antigènes érythrocytaires autres que ceux qui sont définis par le groupage ABO.RH1 et par le phénotypage RH-KEL 1. Ag recherchés En général, on se limite aux Ag des systèmes Duffy, Kidd et MNS, mais d'autres Ag peuvent aussi être recherchés. – – – – – – Rhésus Duffy Kidd MNS Lewis P Ag Cw (RH8), Ag Fya (FY1), Fyb (FY2) Ag Jka (JK1) ,Jkb(JK2) Ag M (MNS1), N (MNS2), S(MNS3), s (MNS4) Ag Lea (LE1), Leb (LE2) Ag P1 2 - Indication du phénotypage étendu Il est indiqué : - chez tout sujet présentant une allo-immunisation post-transfusionnelle, dans le but de prévenir la production de nouveaux anticorps qui rendraient difficiles la sélection de culots globulaires compatibles lors de transfusions ultérieures, - chez la femme jeune avec antécédent d’immunisation fœto-maternelle, - dans les hémopathies chroniques (thalassémie, drépanocytose, anémies réfractaires) ou malignes. Il est important de déterminer le phénotype étendu de ces sujets dès le diagnostic et avant les premières transfusions, car les transfusions répétées ultérieures vont gêner le phénotypage. 3 - Mise en œuvre et contrôles de qualité internes La recherche de chaque antigène est basée sur l'utilisation du réactif spécifique et du témoin adéquat. Le système analytique doit être contrôlé en utilisant, pour chaque spécificité, deux échantillons de contrôle de phénotypes garantis (typage obtenu par un processus analytique différent de celui qui doit être contrôlé par ces échantillons). L'un de ces échantillons doit être négatif et l'autre d'expression «hétérozygote». B1ABM CM © 41 Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 7 Illustration 2: Carte de groupe sanguin 42 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques - Chapitre 2 Anticorps irréguliers Pré-requis : – – – Structure et propriétés des IgM et IgG Propriétés des Ac des systèmes érythrocytaires Rhésus, Duffy, Kidd ; MNS, Lewis, Luthéran, P .... Réactions sérologiques d'agglutination Objectifs : – – – Connaître les risques encourus par un patient possédant des anticorps plasmatiques Savoir réaliser une recherche d'anticorps irréguliers dans le plasma Savoir interpréter les tests de recherche des anticorps irréguliers B1ABM CM © 43 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 1 R echerche des Anticorps irréguliers Généralités 1 - Rappel – Définitions Anticorps circulant (Ac) : immunoglobuline (Ig) capables de se fixer spécifiquement à l'antigène (Ag) qui a induit sa formation. Les classes d'Ig : IgG, IgM, IgE, IgA et IgD Ac naturels (apparaissent spontanément - ne sont pas le produit d’immunisation par des Ag) Il s'agit généralement d'IgM Ac immuns (sont le produit d'une stimulation immunitaire par des Ag du non soi) Il s'agit généralement d'Ig G Ac réguliers (Toujours présents en l'absence de l'Ag spécifique) Ac irréguliers (pas toujours présents en absence de l'Ag spécifique) Donc : 2 types d'Ac irréguliers Ac immuns (toujours irréguliers) Ac naturels irréguliers Caractéristiques sérologiques Ac naturels Ac immuns Apparition sans pré-immunisation apparente préalable après immunisation (contact avec l'Ag) Présence 44 réguliers irréguliers toujours irréguliers optimum thermique 0 à 20°C (Ac froids) 37°C (Ac chauds) fixation du complément transfert placentaire classe d'Ig ++ non IgM + oui IgG pouvoir agglutinant agglutination directe (Ac complet) agglutination indirecte (Ac incomplet) CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 2 - Origine de la présence d'Ac irréguliers chez un patient 2.1 - Ac naturels irréguliers Ces Ac apparaissent sans pré-immunisation apparente chez des sujets de phénotypes particuliers, c'est à dire ne possédant pas l'Ag correspondant. Ex: Sujet Le a (–) peut posséder des Ac naturels irréguliers anti-Le a. Il s'agit le plus souvent d'IgM. Exemples : anti-Lea , anti-Leb , anti-M, anti-N, anti-P1........ Ces anticorps dits « froids », ont un optimum thermique situé à basse température. Cependant même à 37°C leur dangerosité est grande, ils se fixent sur l’hématie possédant l'Ag spécifique, activent le complément, puis peuvent s’éluer (se décrocher) de l’hématie et revenir dans le plasma. L’activation du complément est en général totale, jusqu’à la fraction C9 perforant la cellule, ce qui entraîne une hémolyse intra-vasculaire avec libération d’hémoglobine libre dans le plasma. Celui ci aura donc une couleur rouge « laquée », et les urines seront foncées (voire noires). Les complications majeures à redouter sont la coagulation intra-vasculaire disséminée (CIVD) et l’oligoanurie puis l’anurie. 2.2 - Ac immuns irréguliers Dans ce cas, un sujet en contact avec un Ag qu'il ne possède pas, s'immunise vis à vis de cet Ag et acquière un Ac immun (donc irréguliers). Ex. sujet Rhésus - qui après contact avec l'Ag D acquière des Ac immuns irréguliers anti-D. Il s'agit le plus souvent d'IgG Ex : Ac anti-D, anti-C, anti-c, anti-E, anti-e, anti-Kell, anti-Kidd etc....) Ces anticorps dits « chauds », ont un optimum thermique situé autour de 37 - 40°C, se fixant sur l’hématie possédant l'Ag spécifique. Les hématies ainsi sensibilisées seront phagocytées par les macrophages, ceux-ci ayant un « récepteur aux IgG ». Il s’agit donc ici d’une hémolyse « intratissulaire » qui aura pour conséquence une dégradation de l’hémoglobine en bilirubine, avec l’apparition d’un ictère. 2 types d'allo-immunisation sont possibles : – allo-immunisation post-transfusionnelle – allo-immunisation fœto-maternelle 2.2.1 - Allo-immunisation post transfusionnelle Un receveur peut s'immuniser contre des Ag provenant du donneur. Ex: receveur Rhésus standard (-) peut acquérir après transfusion de sang d'un donneur Rhésus (+) des Ac anti-D. Dans le système Rhésus, l'Ag D est le plus immunogène, suivi de l'Ag E et c. Dans les autres systèmes, les Ag peuvent être aussi immunogènes et conduire à la production d'Ac irréguliers chez le receveur. anti-Rh > anti-Le > anti-Pl > anti-Kell B1ABM CM © 45 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités 2.2.2 - Allo-immunisation fœto-maternelle Allo-immunisation fœto-maternelle la plus fréquente : ◊ Mère: Rhésus (-) enceinte d'un enfant Rhésus (+) En fin de grossesse ou lors de l'accouchement, il arrive que des hématies de l'enfant rhésus (+), porteur de l'Ag D passe dans le sang de la mère. LB L'Ag D représente pour la mère un Ag du nonsoi. Le système immunitaire s'active et produit des anti-D, Ac irréguliers immuns. D'autres allo-immunisations existent : - Dans le système Rhésus : Ac irréguliers anti- c, anti-E,... - Dans le système Kell : Ac irrégulier anti-K et dans les autres systèmes: Duffy, Kidd.... N.B.: des allo-immunisations fœto-maternelles peuvent aussi avoir lieu avec des Ag plaquettaires de l'enfant. Remarque : Dans les 2 cas d’allo-immunisation, la synthèse d’Ac irréguliers ne porte pas à conséquence dans l’immédiat. 46 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 3 - Conséquences néfastes dues à la présence d'Ac irréguliers 3.1 - Chez les receveurs de sang (ou d'organe) Les Ac irréguliers du receveur peuvent se fixer sur les hématies (Ag) du donneur : accident transfusionnel. Exemple : Receveur Rh (–) possédant déjà des Ac irréguliers anti-D (acquis lors d’une 1ère immunisation) recevant du sang d'un donneur Rh (+). Cette fixation peut avoir 2 conséquences: ✔ Hémolyse intravasculaire aiguë – cf. cours «Les hématies » B1ABM (rares dans le cas des Ac irréguliers). L'immun complexe formé active le complément jusqu'au stade de formation du complexe d'attaque membranaire lysant les hématies du donneur dans le système circulatoire. Exemple: anti-JKa (Ac perfide et dangereux) ✔ Hémolyse intratissulaire – cf. cours « les hématies» B1ABM (le plus souvent avec des Ac irréguliers de type IgG). Les Ac irréguliers se comportent comme des opsonines et facilitent la phagocytose des hématies du donneur au niveau du foie ou de la rate. Exemple : anti-D L’hémolyse dépend de l’Ac, de l’Ag et de la capacité phagocytaire des phagocytes. Du fait des 2 possibilités, hémolyse intravasculaire ou intratissulaire, la traduction clinique est très variable : accident hémolytique immédiat transfusion sans bénéfice. La prévention des accidents post-transfusionnels nécessite : • le groupage du sang du receveur – groupage ABO et Rh standard (ABO-RH1) pour une transfusion – phénotypage standard -Rhésus complet et Kell - (RH-KEL1) chez les femmes en âge de procréer (prévention de la maladie hémolytique du nouveau-né). – phénotypage étendu à d’autres systèmes (Kidd, Duffy, ...) pour les polytransfusés • la recherche des anticorps irréguliers anti-érythrocytaires (RAI) • une épreuve de compatibilité au laboratoire (EDC) (sérum du malade + GR à transfuser + antiglobuline : test de COOMBS indirect ). – Cette analyse complète la RAI , et peut mettre en évidence des Ac anti- “ privés ”, c’est à dire des Ac dirigés contre des Ag rarement rencontrés dans la population. – L’EDC s’applique avec un résultat de RAI positif ou douteux et en cas d’antécédent de réaction hémolytique même mineure. • le contrôle ultime au lit du malade : épreuve de Beth-Vincent avec le sang du patient et le sang à transfuser les résultats doivent être identiques. B1ABM CM © 47 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités 3.2 - Chez les fœtus ou nouveau-né dont la mère possèdent des Ac irréguliers Pendant la grossesse, les Ac irréguliers IgG de la mère peuvent traverser le placenta et se fixer sur les hématies (s'ils possèdent l'Ag spécifique) de son enfant : maladie hémolytique du nouveau-né (MHNN) . Exemple: Mère Rhésus (-) possédant des Ac irréguliers anti-D (IgG), enceinte d'un enfant Rhésus(+). Les Ac irréguliers anti-D (IgG) traversent le placenta et vont détruire les hématies (AgD) de l'enfant Rhésus (+) L'enfant est atteint de la maladie hémolytique du nouveau-né (MHNN) MHNN : anémie hémolytique plus ou moins sévère associé à un ictère prononcé (présence importante de bilirubine libre dans le sérum) pouvant dans les cas très grave provoquer la mort de l'enfant. Parfois à la naissance, une exanguinotransfusion avec du sang compatible est nécessaire. D'autres Ac peuvent être responsables de MHNN : anti-c, anti-C, anti-K Si l'Ac irrégulier est un Ac anti-plaquettaire fœtale, l'enfant est alors atteint de thrombopénie. Remarque: seul les IgG irréguliers sont dangereux, car eux seuls traversent la barrière placentaire. Surveillance du conflit fœto-maternel lorsqu'il est décelé : Recherche et à dosage des Ac immuns irréguliers dans le sérum de la mère (épreuve sérique – Réaction de Coombs indirecte) dans le sang du fœtus. Les Ac recouvrent les hématies fœtales (épreuve globulaire – réaction de Coombs directe). Prévention d'une allo-immunisation fœto-maternelle Tests obligatoires lors de la déclaration de grossesse: Groupage sanguin ABO – Phénotype rhésus complet et Kell (K) Recherche d’agglutinines irrégulières (RAI) N.B.Toute parturiente Rhésus(-) susceptible de former des Ac irréguliers immuns anti-D par immunisation fœto-maternelle, reçoit très rapidement une injection d'Ac anti-D après l'accouchement. Si des hématies fœtales porteuses de l'Ag D sont présentes dans la circulation maternelle, les Ac anti-D injectés les détruisent et évitent ainsi l'allo-immunisation. 48 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 4 - Recherche des agglutinines irrégulières (RAI) 4.1 - Généralités D’après les norme iso15189, l’analyse « RAI » consiste à dépister puis à identifier des Ac dirigés contre les Ag érythrocytaires autres que les Ag A, A1 et B. Une étape de dépistage est requise et au terme de laquelle le laboratoire pourra répondre « dépistage positif » ou « dépistage négatif ». Suite à un dépistage positif une identification doit être mise en œuvre. Cette recherche est importante: - chez les receveurs de sang ou d'organe (homme ou femme) - chez les femmes enceintes et éventuellement chez les nouveaux-nés chez qui on suspecte une MHNN. 4.2 - Techniques de recherche des agglutinines irrégulières (AI) Les Ac irréguliers sériques sont pour la plupart incomplets, leur mise en évidence par une réaction d'agglutination nécessite un artifice agglutination indirecte (artificielle). Deux techniques d'agglutination active indirecte sont utilisées en parallèle: - réaction de COOMBS indirecte : artifice = anti-globuline humaine (AGH) L'AGH polyvalente utilisée autrefois est actuellement remplacée par une anti-IgG et une antiC3d. - traitement préalable des hématies par une enzyme protéolytique (cette méthode est de plus en plus abandonnée car les AI mis en évidence par cette technique sont peu dangereux) puis agglutination. cf. fiches techniques 2 et 3 du chapitre 2 Les contrôles qualité interne (CQI) : Le système analytique sera contrôlé en utilisant des échantillons de contrôle comportant des anticorps (natifs ou réactifs) de spécificité et de titre connus avec au minimum un anticorps de titre 4 dans la technique d'utilisation et sur une hématie comportant l'antigène correspondant d'expression « hétérozygote ». 4.2.1 - Dépistage : Principe : La présence d'AI est recherchée dans le sérum d'un patient -par agglutination active indirecte (COOMBS indirect et test enzymatique), -à l'aide de 3 séries d'hématies de groupe O et de phénotypes connus (les Ag des 3 séries d'hématies doivent correspondre à l'ensemble des AI recherchés). B1ABM CM © 49 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités Les 3 lots d' hématies tests de groupe O doivent permettre la détection des Ac correspondants aux Ag RH1 (D), RH2 (C), RH3 (E), RH4 (c), RH5 (e), KEL 1 (K), KEL 2 (Cellano k), KEL 4 (Kpb), FY1 (Fya), FY 2 (Fyb), JK1 (Jka), JK2 (Jkb), MNS1 (M), MNS2 (N), MNS3 (S), MNS4 (s), LE1 (Lea), LE2 (Leb), P1, LU1 (Lua) LU2 (Lub). Les phénotypes RH suivants doivent être obligatoirement représentés sur la gamme de dépistage : - RH : 1, 2, -3, -4, 5 (DCe) - RH : 1, -2, 3, 4, -5 (DcE) - RH : -1, -2, -3, 4, 5 (dce) Une expression du phénotype « homozygote » doit être respecté pour les Ag FY1, JK1, JK2, MNS3 et recommandée pour les Ag FY2 et MNS4 Interprétation: L'absence d'agglutination avec les 3 séries d'hématies (= panel de dépistage) permet de conclure à l'absence d'AI dans le sérum du patient La présence d'une agglutination avec une ou plusieurs séries d'hématies permet conclure à la présence d'une ou plusieurs AI Dans ce cas, il faut poursuivre la recherche par l'identification précise de l'AI. 4.2.2 - Identification Si le dépistage d'AI est positif, l'identification de ou des AI selon le même principe que précédemment, mais en utilisant 10 séries d'hématies phénotypées de groupe O (=panel d'identification). L’ensemble de ces hématies de groupe O doit comporter les antigènes suivants : Ag RH1 (D), RH2 (C), RH3 (E), RH4 (c), RH5 (e), RH8 (Cw), KEL 1 (K), KEL 2 (Cellano k), KEL3 (Kpa), KEL 4 (Kpb), FY1 (Fya), FY 2 (Fyb), JK1 (Jka), JK2 (Jkb), MNS1 (M), MNS2 (N), MNS3 (S), MNS4 (s), LE1 (Lea), LE2 (Leb), P1, LU1 (Lua) LU2 (Lub). Les phénotypes suivants doivent être représentés au moins sur 2 hématies : KEL1, FY1 ; -2, JK 1 ; -2, JK-1 ;2, MNS 3, -4, MNS -3 ;4, P-1. Les AI identifiés pourront ensuite être dosés. (cf fiche technique 7 du chapitre 2) La durée légale de validité des AI identifiée est le 3 jours. 4.3 - Recherche des agglutinines irrégulières maternelles sur les hématies fœtales Principe : La présence d'AI maternels déjà fixés sur les hématies fœtales est recherchée - par la réaction de Coombs directe ou test direct à l'anti-globuline (TDA) Une agglutination des hématies fœtales en présence d'anti-globuline (anti-IgG et anti-C3d) atteste de la sensibilisation des hématies fœtales par les AI maternels. Les AI seront ensuite élués puis identifiés . cf. fiches techniques 4 et 7 chapitre 2 . 50 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie T Activités technologiques Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 2 est de COOMBS indirect ou test indirect à l'antiglobuline (TIA) 1 - Principe La présence d'Ac irréguliers est recherchée dans le sérum d'un patient -par agglutination active indirecte (artificielle) utilisant des anti-globulines humaines (AGH) -à l'aide d'un panel d'hématies phénotypées. 1ére étape : les GR sont sensibilisés par les AI éventuels présents dans le sérum du patient 2ème étape : lavages → élimination des Ig non spécifiquement fixés à l'Ag érythrocytaire. 3ème étape : agglutination des GR sensibilisés par des AGH ☞ Importance des lavages : la réaction de Coombs n'est spécifique que si les GR sont débarrassées de toutes traces d'Ig non fixées spécifiquement sur l'Ag. Remarques : - Variantes : Coombs à basse force ionique (BFI). Augmentation de la fixation des Ac sur les Ag et diminution du temps de sensibilisation. Coombs sur hématies trypsinées. Augmentation de l’accessibilité des Ag. - Inconvénient : Certains Ac irréguliers ne sont pas détectés par cette technique B1ABM CM © 51 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2 Schéma immunologique Globules rouges de phénotype connu panel de dépistage ou panel d'identification SÉRUM À TESTER Les Ac irréguliers (Anti-D, anti-K, anti-Jka etc..) présent dans le sérum à tester se fixent sur les GR phénotypés possédant les Ag spécifiques : GR sensibilisés. LAVAGES EN EAU PHYSIOLOGIQUE + CENTRIFUGATION Élimination des Ac non spécifiques, différents des Ac irréguliers. Le culot est repris en eau physiologique AJOUT D’AGH (ANTIGLOBULINE HUMAINE) Antiglobuline humaine polyvalente Sérum de cheval anti-Ig humaines (Anti-IgG, IgM …) , actuellement remplacée par une anti-IgG+antiC3d Agglutination active indirecte (artificielle) 52 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 2 - Technique 2.1 - Réactifs Hématies phénotypées de groupe O • panel de dépistage : 3 séries d'hématies dont l'éventail des Ag couvre l'ensemble des AI recherchés : dépistage des AI ou • panel d’identification: 10 séries d'hématies identification des AI (si le dépistage est +) Sérum anti-globuline humaine (AGH) : anti-IgG + anti-C3d Contrôle de qualité interne (CQI) : • CQI + : hématies [O, Rh+] (5 % en tampon à basse force ionique) • CQI - : hématies [O, Rh -] (5 % en tampon à basse force ionique) • sérum anti-D salin (ne contenant que des IgG anti-D en milieu salin NaCl) Hématies phénotypées • panel de dépistage : 3 séries d'hématies dont l'éventail des Ag couvre l'ensemble des AI recherchés : dépistage des AI ou • panel d’identification: 10 séries d'hématies identification des AI (si le dépistage est positif) 2.2 - Mode opératoire Cf. page 54 B1ABM CM © 53 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2 54 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 3 - Résultats et interprétations 3.1 - Contrôles de qualité interne - CQI (+) : la présence d’une agglutination vérifie que : * la présence de l’Ag et l’Ac spécifique est bien repérée par un agglutinat * les différents temps de la réaction (sensibilisation, lavage et action de l’AGH) se déroulent parfaitement * la bonne qualité de l’AGH. - CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs dues à l’AGH. En absence d’Ag, les Ac ne conduisent pas à une agglutination. 3.2 - Lecture des réactions - Une agglutination révèle la présence de l’Ac correspondant à l’un des Ag présents sur les hématies testées. Avec le panel de dépistage, l’absence de toute agglutination signifie l’absence d’AI. Dans le cas contraire, la présence d’une ou plusieurs agglutinations permet d’affirmer la présence d’AI qu’il faut identifier avec le panel d’hématies d’identification (cf. exercices) En cas de AI présents, la comparaison obtenus avec les hématies de dépistage permet déjà de donner une orientation de diagnostic. La lecture du panel de d’identification permet d’identifier le ou les AI probable(s) ou Attention : l’interprétation doit aussi tenir compte du phénotype du patient. (Ex : un sujet D-, C+, c-, E+, e- ne peut pas posséder des anti-C) L’AI identifiée est ensuite titrée. Le sérum est alors conservé par congélation en vue de titrage ultérieurs. B1ABM CM © 55 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2 En savoir plus ROBERT ROYSTON AMOS ("ROBIN") COOMBS (19212006) : un médecin immunologiste britannique 56 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 3 Test enzymatique (papaïne) 1 - Principe La présence d'Ac irréguliers est recherchée dans le sérum d'un patient - par agglutination active indirecte (artificielle) utilisant un artifice enzymatique (traitement des hématies par une enzyme protéolytique) - à l'aide d'un panel d'hématies phénotypées (et traitées). 1ère étape : les GR sont traités par une enzyme protéolytique (papaïne, broméline …) à 37°C. 2ème étape : lavages élimination des fragments éliminés par le traitement ainsi que les enzymes 3ème étape : les GR traités sont sensibilisés par les AI éventuels présents dans le.sérum du patient. ☞ Importance des lavages : Le traitement par une enzyme élimine des petits fragments à la surface des hématies. Ces fragments et les enzymes doivent être éliminés pour éviter toute interférence (éventuelle dénaturation des Ac présents dans le sérum testé). Les AI éventuellement présents dans le sérum du patient pourront atteindre beaucoup plus facilement les Ag portés par les hématies (augmentation de l’accessibilité de certains sites antigéniques, diminution du potentiel zeta, diminution de l’encombrement stérique.) REMARQUES : ➢ Avantages : • Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Rhésus. • Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Kidd par la papaïne. • Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Lewis par la ficine. ➢ Inconvénient – altération de la puissance antigénique : • Ag M N S s Fya Fyb détruits par tout traitement enzymatique. • Ag Fya Fyb détruits ( S s affaiblis ) par la papaïne. • Ag M N affaiblis par tout traitement enzymatique. B1ABM CM © 57 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 3 Schéma immunologique Globules rouges de phénotype connu GR panel identification : list I, II, III 37°C TRAITEMENT ENZYMATIQUE Papaïne ou Broméline ou Trypsine Démasquage de certains Ag. (Destruction de certains Ag) Globules rouges traités LAVAGES EN EAU PHYSIOLOGIQUE + CENTRIFUGATION Élimination des débris et fragments protéiques, et enzymes Les GR, une fois lavés sont repris en eau physiologique. 37°C SÉRUM À TESTER Recherche des Ac irréguliers (Anti D, anti K, anti Jka etc..) Ac de la classe des IgG (Ac chaud) Agglutination active indirecte (artificielle) 58 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 2 - Technique 2.1 - Réactifs Enzyme protéolytique : trypsine ou papaïne ou broméline ou ficine ..... Les hématies des panels sont traitées par les enzymes (en respectant la procédure indiquée par le fabriquant), lavées en eau physiologique puis remise ne suspension à 40% (test sur rhésuscope) ou à 10 % (test en tube). Contrôles de qualité (CQI) : – CQI (+) : hématies [O, Rh+] (40% ou 10% en eau physiologique) – CQI (+) : hématies [O, Rh -] (40% ou 10% en eau physiologique) Sérum anti-D salins (ne contenant que des IgG anti-D en milieu salin NaCl) 2.2 - Mode opératoire Cf. page 60. 3 - Résultats et interprétations 3.1 - Contrôles de qualité - CQI (+) : la présence d’une agglutination vérifie : * la présence de l’Ag et l’Ac spécifique est bien repérée par un agglutinat * les différents temps de la réaction (traitement enzymatique efficace, température de sensibilisation correcte) se déroulent parfaitement * la bonne qualité l’enzyme. - CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs dues un traitement enzymatique trop important. Les Ac en absence d’Ag ne conduisent pas à une agglutination. 3.2 - Lecture des réactions - Une agglutination révèle la présence de l’Ac correspondant à l’un des Ag présents sur les hématies testées. Avec le panel de dépistage, l’absence de toute agglutination signifie l’absence d’AI. Dans le cas contraire, la présence d’une ou plusieurs agglutination permet d’affirmer la présence d’AI qu’il faut identifier avec le panel d’hématies d’identification (cf exercices) En cas de AI présents, la comparaison obtenus avec les hématies de dépistage permet déjà de donner une orientation de diagnostic. La lecture du panel de d’identification permet d’identifier le ou les AI probable(s) ou Attention : l’interprétation doit aussi tenir compte du phénotype du patient. (Ex : un sujet D-, C+, c-, E+, e- ne peut pas posséder des anti-C) L’AI identifiée est ensuite être titrée Le sérum est alors conservé par congélation en vue de titrage ultérieurs. B1ABM CM © 59 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 3 60 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie T Activités technologiques Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 4 est de COOMBS direct ou test direct à l’antiglobuline (TDA) 1 - Principe La présence d'Ac irréguliers est recherchée sur des hématies déjà sensibilisées par des Ac présents dans le sérum d’un patient : -par agglutination active indirecte (artificielle) utilisant des anti-globulines humaines (AGH) monospécifiques (détectant les IgG et la fraction C3 du complément. 1ére étape : lavages des hématies sensibilisées en solutions salines (élimination des Ig non spécifiquement fixés à l'Ag érythrocytaire). 2ème étape : agglutination des GR sensibilisés par des AGH ☞ Importance des lavages : la réaction de Coombs n'est spécifique que si les GR sont débarrassées de toutes traces d'Ig non fixées spécifiquement sur l'Ag. À savoir Cette technique permet de révéler la présence : •d’agglutinines irrégulières (AI) d’origine maternelle sur les GR fœtaux (cf MHNN) •d’auto-Ac sur les GR d’un patient atteint d'anémie hémolytique auto-immune – cf cours hématologie B2ABM) B1ABM CM © 61 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 4 Schéma immunologique Lavages des hématies déjà sensibilisées par des Ac en eau physiologique + centrifugation Élimination des Ac non spécifiques, différents des Ac irréguliers. Le culot est repris en eau physiologique Ajout d’AGH AGH = Antiglobuline humaine monospécifique: Sérum de cheval anti-Ig humaines (Anti-IgG, anti-C3…) Agglutination active indirecte (artificielle) 62 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 2 - Technique Le sang à examiner peut être: -du sang du cordon ou du nouveau né, recueilli sur anticoagulant, déposé au froid et porté au laboratoire immédiatement après le prélèvement - du sang d'un patient possédant des allo-Ac (cas d'une transfusion incompatible) ou des auto-Ac (cas d'une maladie auto-immune provoquant une anémie hémolytique=AHAI). GR du patient sont mis en suspension saline à 50 %. 2.1 - Réactifs Sérum anti-globuline humaine (AGH) : sérum polyspécifique ou monospécifique. Contrôles de qualité : – CQI (+) : hématies O Rh+ ( 50 % en eau physiologique) – CQI (-) : hématies O Rh – sérum anti-D salins (ne contenant que des IgG anti-D) 2.2 - Mode opératoire Cf. page 64 3 - Résultats et interprétations 3.1 - Contrôles de qualité internes et témoin - CQI (+) : la présence d’une agglutination vérifie : * la présence de la présence de GR sensibilisés par des Ac est bien repérée par un agglutinat * les différents temps de la réaction (lavage et action de l’AGH) se déroulent parfaitement * la bonne qualité de l’AGH. - CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs dues à l’AGH. Les Ac en absence d’Ag ne conduisent pas à une agglutination. - Témoin contrôle : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction. Les GR sensibilisés ne doivent pas agglutiner en absence d’AGH. 3.2 - Lecture des réactions Si les témoins sont corrects : •Une agglutination pour le test R signifie que les GR sont recouvertes par un Ac que le contexte biologique identifiera comme un Ac d’origine maternelle. B1ABM CM © 63 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 4 Dans 4 tubes à hémolyse, verser : Sensibilisation des GR témoins Lavage Suspension à 20 % de GR pour technique en plaque Sérum anti-D Réaction de Coombs directe Réaction T contrôle - GR témoins GR du patient 50 % eau Ψ Eau Ψ CQI (+) CQI (-) 2 gouttes 2 gouttes 1 goutte de 1 goutte de GR [O, Rh +] GR [O, Rh -] Incuber à 37°C – 30 min - 1 goutte 1 goutte - - 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL Centrifuger 3 min à 800g Jeter l’eau du lavage dans la Javel et décoller le culot en grattant le tube sur le portoir Refaire ainsi 2 autres lavages dans 4 mL d'eau physiologique Puis déposer sur chaque culot du dernier lavage : 3 gouttes 3 gouttes 3 gouttes 3 gouttes Eau Ψ Poursuivre comme indiqué dans le tableau jaune (Technique en plaque) ci-dessous. 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL Suspension à 5 % Eau Ψ de GR pour Poursuivre comme indiqué dans le tableau bleu (Technique en tubes) technique en tube ci-dessous. Eau Ψ : Eau physiologique Réaction Agglutination des GR sensibilisés et lavés par l’AGH Technique en plaque T contrôle CQI (+) CQI (-) Suspensions à 20 % 1 goutte 1 goutte 1 goutte 1 goutte AGH 1 goutte - 1 goutte 1 goutte Eau Ψ - 1 goutte - - Mélanger à l’aide d’un agitateur Laisser reposer 5 min sur la paillasse et observer la présence éventuelle d’agglutination. Agglutination des GR sensibilisés et lavés par l’AGH Technique en tubes (dans 4 nouveaux tubes identifiés) Réaction T contrôle CQI (+) CQI (-) Suspensions 1 goutte 1 goutte 1 goutte 1 goutte à 5% AGH 1 goutte - 1 goutte 1 goutte Eau Ψ - 1 goutte - - Agiter pour mélanger Laisser reposer 5 min sur la paillasse et observer la présence éventuelle d’agglutination. 64 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 5 P rocédure d'identification des anticorps irréguliers (AI) et exercices d'application 1 - Importance des informations préalables Les informations concernant le contexte de la recherche ou l’identification des agglutinines irrégulières chez le patient permettront d’identifier au mieux la ou les agglutinines irrégulières les plus probables. Avant tout dépistage, il faut connaître si possible : • le groupe ABO-RH1, le phénotype standard RH-KEL1 et éventuellement le phénotype étendu précisant la présence des Ag érythocytaires appartenant aux autres systèmes érythocytaires (ex: Duffy, Kidd, Lewis...). • s’il s’agit d’une personne non transfusée ou sans enfant à absence d’AI immuns présence éventuelles d’AI naturels (agglutinine froide, auto-Ac ou autres Ac naturels irréguliers). • s’il s’agit d’une femme avec 1 enfant, il y a une probabilité non négligeable de trouver 1 agglutinine irrégulière, en général (non systématique). • S’il s’agit d’une femme multipare (plusieurs enfants) ou s’il s’agit d’une personne polytransfusée il y a une probabilité non négligeable de trouver plusieurs agglutinines irrégulières. La fréquence des agglutinines irrégulières : Ac irréguliers les plus fréquemment rencontrés : Anti-D, anti-E, anti-c, anti-Jka, anti-K (En général les Ac anti Ag du système Rhésus, Kell, Duffy et Kidd). B1ABM CM © 65 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5 2 - Dépistage des agglutinines irrégulières (DSAI) 2.1 - Technique (cf. fiches n°2 et 3 ) Un panel de dépistage est utilisé. Ce panel est constitué généralement 3 lots d'hématies, l'ensemble de ces lots d'hématies devant posséder l'ensemble des Ag spécifiques des Ac irréguliers recherchés. Le sérum du patient est testé sur chacun de ces lots d'hématies : test de Coombs indirect et éventuellement test à la papaïne*(* non obligatoire -GBEA arrêté 26 avril 2002). Exemple : Résultat Lots de GR Panel 1 de 2 dépis 3 -tage Auto D C c E e K k + + - + - - + - + - + + - - + - + - + + + Fya Fyb Jka Jkb M N S s Lea + + + + + + + + + + + + + + - + + - - + + - Leb P1 Cw Lua Lub Kpa + + + + S + - + - + + + Papaïne * 37°C Présence (+) ou absence (-) des Ag à la surface des hématies du lot Kell Duffy Kidd MNs Lewis P Cw Luthéran Coombs indirect 37°C Rhésus + - contrô -le 2.2 - Interprétation 2.2.1 - Auto-contrôle Un autocontrôle positif signale la présence d’un auto-anticorps qui doit être confirmée par la réalisation d’un test de Coombs direct. (cf. fiche 4 ) Il est alors nécessaire d’adsorber l'auto-anticorps (incubation du sérum avec les hématies du patient) pour déceler et identifier un éventuel allo-anticorps masqué en renouvelant la RAI après adsorption ; 2.2.2 - Dépistage des agglutinines irrégulières (AI) Si l'auto-contrôle est négatif : → Des résultats négatifs [absence (-) d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la papaïne), avec les 3 lots d'hématies, prouvent l'absence d'agglutinine irrégulière (AI). → Des résultats positifs [présence (+) d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la papaïne), avec un lot au moins d'hématies, prouveraient la présence d'agglutinines irrégulières, qu'il faudra identifier puis titrer. 66 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques 3 - Identification des agglutinines irrégulières 3.1 - Technique (cf. fiches n°2 et 3 ) Un panel d'identification comprenant 10 lots d'hématies est utilisé. L'ensemble de ces lots doit posséder l'ensemble des Ag spécifiques des Ac irréguliers recherchés. Cependant chaque lot possède moins d'Ag que le panel de dépistage. Exemple : PANEL D’IDENTIFICATION Lots de GR 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 Auto contrôle D + C c E e K + - - + + k + + + + - + + - + + + + + + + + + W + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + Fya Fyb Jka Jkb M N S s Lea + + + + + - + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + - + + + + - Papaïne* 37°C Résultat Coombs indirect 37°C Présence (+) ou absence (-) des Ag à la surface des hématies du lot Kell Duffy Kidd MNs Lewis P Cw Luthéran Rhésus Leb P1 Cw Lua Lub Kpa + + + + - + + + + + + S + + S - + + - + + + + + + W + + + + Importance des techniques employées pour l’identification des agglutinines irrégulières Il faut savoir que la majorité des Ag érythrocytaires peuvent êtres reconnus par Ac irréguliers par le test de Coombs indirect, alors que certains Ag érythrocytaires sont détruits ou affaiblis par la réaction à la Papaïne et donc ne peuvent être reconnus par les Ac irréguliers correspondants. Par exemple : Ag Fya et Fyb sont détruits par la papaïne. Ag M et N ainsi que S et s peuvent éventuellement être affaiblis. B1ABM CM © 67 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5 3.2 - Interprétation 3.2.1 - Auto-contrôle ➔ Un autocontrôle positif signale la présence d’un auto-anticorps, qu'il faudra confirmer puis éliminer (cf. 2.2.1) pour refaire une RAI. ➔ Un auto-contrôle négatif et des résultats positifs à tous les lots d'hématies [présence (+) d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la papaïne) doit orienter vers la recherche d’un anticorps dirigé contre un antigène de grande fréquence, dit « public ». Si l'auto-contrôle est négatif, et si tous les résultats aux tests de Coombs indirect (et papaïne) ne sont pas tous positifs, procéder à l'identification des AI. L'identification des AI est alors un jeu logique qui s'effectue en 3 temps. 3.2.2 - Premier temps : identification de tous les AI possibles • Tenir compte des résultats négatifs obtenus avec les GR du panel d’identification en éliminant les Ac correspondant aux Ag présents sur les GR tests. Procéder par élimination, en rayant les Ag des hématies n’ayant pas réagit avec le sérum du patient. Les Ac spécifiques de ces Ag sont ainsi éliminés. Noter le ou les Ac spécifiques des Ag restants : AI possibles Remarques particulières : En général, on peut éliminer les Ac anti-Fya et/ou Fyb et Jka et/ou Jkb uniquement si on dispose d’hématies homozygotes. on peut éliminer les Ac anti-M et/ou N et Set/ou s uniquement si on dispose d’hématies homozygotes. On peut se servir des résultats obtenus avec les hématies de dépistage pour l’identification. 3.2.3 - Deuxième temps : identification des AI les plus probables • Tenir compte des résultats positifs obtenus avec les GR du panel d’identification en recherchant l’Ag commun aux GR ayant donné des résultats positifs. L’Ac le plus probable correspond à l’Ag commun aux GR tests donnant un résultat positif. (Ă confronter aux renseignements concernant le patient) Cependant, dans certains cas, il faut tenir compte des éventuelles disparités de réaction entre les deux tests (Coombs indirect ou papaïne), qui peuvent alors s’expliquer par des disparitions ou affaiblissements des Ag par le traitement à la papaïne. 3.2.4 - Troisième temps : élimination des Ac spécifiques aux Ag du patient Si et seulement si l'absence d'auto-Ac a été démontré, il est alors possible d'éliminer les Ac spécifiques aux Ag du patient. Ex: Si le patient présente le phénotype : D+; C+, c- ; E- , e+ , éliminer les Ac anti-D, anti-C, anti-e. 68 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie B1ABM Activités technologiques CM © 69 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5 70 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie B1ABM Activités technologiques CM © 71 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5 72 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie B1ABM Activités technologiques CM © 73 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5 Illustration 3: Agglutination en tube. A: négatif - B: positif 74 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 6 T itrage des anticorps irréguliers de type IgM1 1 - Généralités Les anticorps irréguliers peuvent être de type IgM (immun ou naturels) ou IgG. Les Ac de type IgM sont généralement des Ac complets. Leur mise en évidence repose alors sur une réaction d’agglutination active directe. Ce titrage est mis en œuvre en particulier pour vérifier le titre en Ac d'un sérum test. 2 - Application : titrage des Ac naturels irréguliers anti-A1 2.1 - Principe Les Ac naturels (IgM) irréguliers du système ABO sont titrés par une technique de dilution en série d’un sérum et à l’aide d’une agglutination directe active. Le titre en Ac anti-A1 est exprimé en UI/mL. Dans ce cas, le titrage des anticorps du sérum à titrer nécessite une comparaison avec un sérum étalon de titre connu 2.2 - Mode opératoire 2.2.1 - Matériel et réactifs Suspension de globules rouges A1 à 2% en eau physiologique. Sérum à titrer (Sx) : 120 µL en tube à hémolyse Sérum étalon anti-A1(anti-A1 étalon) : 120 µL en tube à hémolyse. Le titre de ce sérum est connu et donné par l’OMS. Microplaque à fond conique Tubes à hémolyse Pissette d’eau physiologique Distributeur de particules calibrées 25µL. Pipette automatique. 1 Attention : les Ac de type IgM peuvent être naturels réguliers (ex : anti-A), naturels irréguliers (ex:anti-A1) ou encore immuns. B1ABM CM © 75 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 6 2.2.2 - Technique deux titrages seront entrepris : sérum Sx et sérum étalon de titre ..........UI/mL Réaliser 2 séries de dilution : 1 série de dilution par sérum – Dilution de base de 1 et de raison 1/2 – -Diluant : eau physiologique. – Volume final après dilution du sérum : 50 µL – Volume de suspension érythrocytaire : 25 µL Compléter le tableau suivant Cupule n° Diluant (µL) Sérum étalon ou sérum x (µL) Volume à redistribuer (µL) Dilution Hématies A1 (µL) 1 2 3 4 5 6 7 8 50 - 1/1 25 25 Lecture de la plaque S étalon Résultats S étalon Lecture de la plaque Sx Résultats Sx Recouvrir d’un parafilm et mélanger. Centrifuger 3 minutes à 1 500 rpm. Observer les voiles d'agglutination ou les boutons de sédimentation. Remettre en suspension par agitation. Noter la présence de voile d'agglutination ou de bouton de sédimentation. 2.3 - Interprétation Rôle de la cupule 8 : ................................................................ Le titre d'Ac anti-A1 d'un sérum correspond à la plus grande dilution du sérum donnant encore un voile d'agglutination . Titre d'Ac anti-A1 en dilution (d) et en inverse (Fd) • du sérum étalon : .................... • du sérum inconnu :................. Le titre en Ac anti-A1 d'un sérum peut aussi s'exprimer en UI/mL Titre d'Ac anti-A1 en UI/mL du sérum inconnu : – sachant que le sérum étalon a un titre d'Ac anti-A1 de ……… UI/mL (cette valeur sera donnée en TP) – à l’aide de la formule suivante (à démontrer) [titre étalon] = [titre X] Fd étalon 76 CM © Fd X B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 7 T itrage des anticorps irréguliers de type IgG 1 - Généralités Les Ac irréguliers sont en majorité incomplets (IgG), leur mise en évidence par une réaction d'agglutination nécessite un artifice agglutination indirecte (artificielle). Le GBEA et les normes ISO 15189 préconisent d'utiliser le test indirect à l'antiglobuline (TIA) ou test de Coombs indirect. 2 - Titrage des Ac irréguliers anti-D 2.1 - Principe Les Ac immuns irréguliers anti-D (IgG) sont titrés par une technique de dilution en série d’un sérum et à l’aide d’une agglutination indirecte active (antiglobuline humaine). Le titre en Ac anti-D est exprimé en UI/mL. Dans ce cas, le titrage des anticorps du sérum à titrer nécessite une comparaison avec un sérum étalon de titre connu 2.2 - Mode opératoire 2.2.1 - Matériel et réactifs. Suspension de globules rouges O Rh+ à 2% en eau physiologique. Sérum du patient à titrer (Sx) : 120 µL en tube à hémolyse Sérum étalon anti-D (anti-D étalon) : 120 µL en tube à hémolyse. Le titre de ce sérum est connu et donné par l’OMS. Anti-globuline humaine (AGH) Microplaque à fond conique Tubes à hémolyse Pissette d’eau physiologique Distributeur de particules calibrées 25µL. Pipette automatique. B1ABM CM © 77 Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 7 2.2.2 - Technique. Réaliser une série de dilution du sérum à tester de base de 1 et de raison ½ – Diluant : eau physiologique. – Volume final après dilution du sérum : 50 µL Compléter le tableau suivant Cupule n° 1 8 9 10 Diluant (µL) 75 50 50 Sérum sérum x (µL) - 50 - Volume à redistribuer (µL) - - - Dilution 1/1 Hématies Rh+ (µL) 25 2 3 4 5 6 7 25 25 25 Recouvrir d’un parafilm. Agiter 1 min et incuber à 37°C pendant 20 min. AGH (µL) 50 - - 50 Recouvrir d’un parafilm et mélanger. Centrifuger 3 minutes à 1 500 rpm. Observer les voiles d'agglutination ou les boutons de sédimentation. 2.3 - Interprétation Donner le rôle des cupules 8, 9 et 10 Donner le titre d'Ac anti-D en dilution (d) et en inverse (Fd) du sérum à tester. 78 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques - Chapitre 3 Techniques en gel filtration Généralités Ces techniques ont l'avantage d'être automatisables. 1 - Principe Le mélange hématies-sérum se déroule au sein d’un gel. – Les hématies n’ayant fixé aucun Ac traversent et sédimentent au fond du micro tube (Le diamètre des hématies est inférieur aux mailles et pores du gel utilisé). – Les immun complexes correspondant à des agglutinats (édifice multiparticulaire d’Ag réunis par des ponts d’Ac) spécifiques aux Ag) restent bloqués dans les mailles du gel. • Une réaction négative se traduit par une sédimentation des GR libres dans le fond du micro tube. • Une réaction fortement positive se traduit par une rétention des hématies agglutinées, dans la partie supérieure du micro tube. • Une réaction faiblement positive se traduit une dissémination des hématies agglutinées, à l’intérieur du micro tube. La réaction Ag-Ag est accélérée et révélée après centrifugation. GR non agglutinés GR agglutinés Gel avec un certain « maillage » B1ABM CM © 79 Chapitre 3 – Techniques en gel filtration – Généralités 2 - Différents types de gel – Gels neutres immunologiquement : Dextran préparé dans un tampon neutre. – Gels contenant des Ac connus : • Ac anti-A ou Ac anti-B ou Ac anti-D (système ABO et Rhésus). • Ac anti-D, anti-E, anti-e, anti-C, anti-c (phénotypage Rhésus et Kell). Dans ce type de gel, la formation de l’agglutinat se fait au cours de la centrifugation. – Gels contenant un artifice : • Anti-globuline humaine (test de Coombs) 3 - Procédures standardisées Diamed® Groupage ABO – Épreuve globulaire uniquement. •Carte ID ABO/Rh. •Gel contenant des Ac agglutinants anti-A, anti-B et anti-A + B. •Suspension d’hématies à grouper, préparées à 5% en tampon ID diluent 1 (broméliné). •Réalisation du test à température ambiante. Groupage ABO – E preuve sérique uniquement. •Carte ID NaCl/enz. •Gel neutre. •Suspension d’hématies tests (ID diacell A1, A2, B et O préparées à 5%.) •Mélange des GR tests + sérum à tester à la surface du gel. •Réalisation du test à température ambiante. Détermination du phénotype Rhésus complet et Kell. •Carte ID Diaclon Rh. •Gel contenant des Ac agglutinant anti-C, anti-c et anti-E etc … (Ac monoclonaux en général). •Suspension d’hématies à grouper, préparées à 5% en tampon ID diluent 2 (Eau physiologique). •Réalisation du test à température ambiante. Recherche d’agglutinines irrégulières. •Carte combinée AGH/Enz (3 micro tubes contenant le gel + AGH et 3 micro tubes contenant le gel neutre). •Carte combinée ID liss/Coombs. •Carte Enz NaCl/Enz. •Utilisation du sérum à tester. •Utilisation de GR de panels de dépistage et / d’identification (ID diacell List I, II et III pour le tests de Coombs et ID diacell list Ip, IIp, IIIp pour le test à la papaïne). Avantages et inconvénients. •Grande sensibilité. •Petite quantité de réactif nécessaire. •Nombre de manipulation réduit. •Nécessité de standardiser les gels. 80 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Chapitre 3 – Techniques en gel filtration – Fiche 1 G roupage ABO - RH1 Système en minigel – Système Diamed® 1 - Matériel et réactifs − Carte « ID ABO/Rh » possédant six microtubes contenant des gels A, B, AB, D, DCE et ctl : è gel A contenant des Ac anti-A è gel B contenant des Ac anti-B è gel AB contenant des Ac anti A+anti-B è gel D contenant des Ac anti-D è gel DCE contenant des Ac anti-D+anti-C+anti-E è gel ctl neutre immunologiquement. − un tube à hémolyse contenant environ 1mL de diluent ID2 (basse force ionique) − 2 − 2 pastettes et 1 pipette automatique de 10 µL − gants. tubes à hémolyse 2 - Mode opératoire A partir du tube de sang fourni, recueilli sur EDTA et centrifugé : − − − − préparer une suspension globulaire à environ 5 % (soit environ 1/20) en tampon ID2 dans un tube à hémolyse. mélanger et incuber 10 min à température ambiante. enlever la pellicule d’aluminium de la carte délicatement de manière à ne pas souiller les microtubes entre eux. déposer à la surface de chaque gel, 10 µL de suspension globulaire à 5%. Attention : ne pas toucher le bord des microtubes avec la pointe de pipette. − centrifuger la carte dans la centrifugeuse ID spécifique. 3 - Lecture et interprétation Réaliser un tableau de résultat, dans lequel seront schématisé l'aspect des gels et l'interprétation correspondante. Interpréter l'ensemble des résultats et proposer des tests complémentaires. B1ABM CM © 81 Chapitre 23– Techniques en gels filtration – fiche 1 Illustration 4: Un automate permettant la réalisation des groupages sanguins en gel filtration (Classic Plus ID-GelStation -Diamed) Illustration 5: Un exemple de résultats Groupe ABO1 - RH1 82 CM © B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Chapitre 3 – Techniques de gel filtration – Fiche 2 E xercices – Interprétations de résultats obtenus en minigel Système Diamed® 1 - Étude du cas 1 Analyser les gels suivants, concernant une patiente, 32 ans, déjà mère de 3 enfants et enceinte d'un 4ème enfant. Pour chaque gel, indiquer la présence ou non de composés additionnels et préciser la composition du dépôt versé sur chaque gel. A A1 B A2 Simonin B1ABM AB D B DCE I II ctl C III c I Coombs E II Coombs CM © III e Kell IP IIP ctl IIIP Papaïne 83 Chapitre 3 – Techniques en gel filtration – fiche 2 2 - Étude du cas 2 Un patient doit subir seconde transfusion sanguine. . Interpréter les résultats obtenus sur les cartes de groupage et phénotypage correspondantes. Analyser les résultats obtenus pour le dépistage des agglutinines irrégulières, ainsi que pour l’identification. A B A1 A2 AB B D DCE ctl C c E e I II III I II III IP Coombs 1 2 3 1 8 Coombs 84 4 3 9 7 8 5 9 10 Enzyme 11 Coombs CM © IIP ctl IIIP Enzyme 6 4 Coombs Enzyme Coombs 7 2 Kell 5 6 Enzyme Ctl 10 11 Ctl Enzyme B1ABM Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques Rhésus Kell Duffy D C c E e K k Fya Fyb MNs Lewis P Cw Luthéran M N S s Lea Leb P1 Cw Lua Lub Panel 1 de 2 dépista 3 ge 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 contrôle + + - - + - + + - + + - + + - - + - + - + + + + + + + + + - + + + - + + - + + + + S + - + - + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + S + + S + + + - + + - + + + + + + + W + + + PANEL D’IDENTIFICATION Panel d'hématies n°00689 + + + - + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + W + + + + + - + + + + + + + - Coombs Papaï- 37°C ne 37°C Proposer des examens complémentaires éventuels. 3 - Étude du cas 3 Dépistage d'une maladie hémolytique chez un nouveau-né : – recherche des Ag érythrocytaires A,B et D – test de Coombs direct (ou test direct à l'antiglobuline). • Pour chaque gel utilisé ci-dessous, indiquer la présence ou non de composés additionnels et préciser la composition du dépôt versé sur chaque gel. • Analyser les résultats obtenus et conclure. 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