Chez l’homme, on compte huit acides aminés essentiels : le tryptophane, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la thréonine, la valine, la leucine et l'isoleucine. Deux autres, l'histidine et l'arginine, sont dits semi-essentiels car seuls les nourrissons ont besoin d'un apport exogène (on les trouve dans le lait maternel). Astuce: pour mémoriser les acides aminés essentiels, on a recours à des formules mnémotechniques. 1 Le très Leu Thr lyrique Tristan fait vachement méditer Iseult Lys Trp Val Ile 2 Mets le dans la valise, il Met Leu Val-Lys, Phe fait trop Ile Phe Trp Mét d'histoires d'argent His-Thr Arg Acides β et γ aminés H2N – CH2 – CH2 – COOH α β β- alanine H2N – CH2 – CH2 – CH2 – COOH α γ β Acide γ- amino-butyrique (GABA) Composée de 4 Lysines Forme cationique Zone acide Forme neutre Zwitterion Forme anionique Zone basique Chromatographie de partage (sur papier ou sur couches minces) Spectrophotométrie Concentrateur Filtre (longueur d’onde unique) Détecteur Afficheur Source de lumière Monochromateur (prisme) (échantillon) Principe de base d’un spectrophotomètre ε Absorbance des acides aminés aromatiques Électrophorèse Électrophorégramme Dispositif Comportement électrophorétique La charge de la particule est fonction du pHi et du pHm du solvant: - Si le pHi < pHm forme anionique (aa-) migre vers l’anode - Si le pHi > pHm forme cationique (aa+) migre vers la cathode - Si le pHi = pHm forme zwitterion (aa0) aucune migration Électrophorèse Principe: c’est une méthode de séparation qui se base sur la différence de charge électrique. En effet, une solution aqueuse contenant un mélange d’acides aminés est déposée sur un papier spécial ou une membrane d’acétate de cellulose, un champ électrique est appliqué à ce gel qui a été préalablement immergé dans une solution tampon de pH fixe. Grace à leurs différents pHi, les acides aminés auront des charges différentes et migreront dans des directions opposées avec des vitesses différentes selon le pH du système tampon (pHm) et le type de support utilisé. Pour révéler la position des aa, on fait un traitement avec la ninhydrine Remarque: la vitesse de migration sera proportionnelle à la valeur de la charge électrique portée par l’aa, elle sera d’autant plus forte (en valeur) que l’écart entre le pHi et le pHm est plus grand. - Pour déterminer la nature des acides aminés, on peut procéder à une électrophorèse, dans les mêmes conditions, d’aa témoins et on compare avec les aa inconnus. Chromatographie échangeuse d’ions Généralités : La chromatographie est une méthode séparative qui permet l’identification et le dosage des différents composés d’un mélange. Le principe est basé sur les différences d’affinité des composés du mélange avec la phase stationnaire et la phase mobile. Il existe différents types de chromatographie suivant la méthode de séparation utilisée : - d’adsorption ou partage (liquide-solide) - de partage (liquide-liquide) - d’échange d’ions - d'exclusion Chromatographie échangeuse d’ions Définition de l’échangeuse d’ions Elle consiste à un échange réversible d’ions entre la phase mobile et la phase stationnaire. Cette dernière est porteuse de groupements ionisés fixes et d’ions mobiles assurant l’électroneutralité. En effet, les échangeurs d’ions (phase stationnaire) sont des macromolécules insolubles ayant la propriété d’échanger de façon réversible certains de leurs ions en contact avec d’autres ions provenant de l’échantillon à séparer. En fait, on distingue 2 types d’échangeurs: - Résine échangeuse de cations - Résine échangeuse d’anions Chromatographie échangeuse d’ions Résines cationiques 1.fortement acide : -SO3- Na+ 2.faiblement acide : -COO- Na+ Résines anioniques 3.fortement basique : -CH2-N+(CH3)3 Cl 4.faiblement basique –N+H(R2) Cl - - Chromatographie échangeuse de cations Gradient de pH Dispositif et procédure Activation et fixation (rétention) Les aa sont mélangés dans une solution à pHm < pHi de tous les aa, donc ils seront tous chargés positivement (+) et retenus par la résine Élution Un gradient de pH croissant est appliqué. À chaque fois que le pH atteint la valeur du pHi d’un aa, ce dernier devient zwitterion et est alors détaché et élué. Propriétés chimiques des acides aminés Elles sont dues à la présence d’un groupement COOH, NH2 et d’une chaîne latérale 1) Propriétés dues à la fonction COOH a) Formation d’esters : en milieu acide, les aa réagissent avec les alcools pour former des esters. H2N – CH - COOH + R’-OH H2N – CH – CO-O-R’ + H2O R R b) Formation d’amides : elle correspond à la condensation d’une fonction carboxylique avec une fonction amine. - Si le NH2 provient d’un aa --- liaison peptidique. H2N – CH - COOH R + H2N – CH - COOH R H2N – CH - CO -NH – CH - COOH R R - Si un NH2 se combine avec le COOH radicalaire d’un aa dicarboxylique (Asp/Glu), il y a naissance d’une forme atoxique : Asn/Gln H2N – CH - COOH H2N – CH - COOH CH2 CH2 COOH + H2N CO-NH2 Aspartate (Asp) Asparagine (Asn) c) Formation d’alcools aminés : la fonction COOH est réduite en alcool primaire (CH2OH) sous l’action de LiBH4 ou NaBH4. Cette technique s’appelle la méthode de Fromageot. H2N – CH - COOH R LiBH4 H2N – CH – CH2OH R Cette méthode est utilisée dans l’identification de l’aa Ct d) Formation d’amines : la décarboxylation par méthodes chimiques enzymatique (décarboxylase) des acides aminés donne des AMINES. H2N – CH - COOH décarboxylase R ou H2N – CH2 + CO2 R His Histamine : vasodilatateur puissant libérée au cours des réactions allergiques Asp β-alanine : fait partie de la structure du co-enzyme A Glu GABA : neurotransmetteur Lys cadavérine : résponsable de l’odeur nauséabonde des cadavres 2) Propriétés dues à la fonction NH2 a) Réaction de désamination (Van slyke) : Sous l’action de l’acide nitreux (HNO2) NH2 OH R– CH - COOH + HNO2 R– CH - COOH + N2 + H2O b) Réactions de N-arylation et N-alkylation : Réaction de SANGER : c’est la réaction entre la fonction amine de l’aa et le Dinitro-2-4-fluorobenzène (DNFB) produisant ainsi un composé coloré (jaune). NH2 DNFB DNFB + R– CH COOH (DNP-aa) Réaction de Dansylation : Sanger a développé par la suite une méthode beaucoup plus sensible en utilisant le Chlorure de dansyl. NH2 + R– CH COOH CH - COOH Chlorure de dansyl Dansyl-aa (DNS-aa) R Remarque : le DNS-aa obtenu est fortement fluorescent en lumière UV. Cette méthode est environ 100x plus sensible que celle de Sanger. Réaction d’EDMAN : c’est une méthode qui a recours au phényl-isothiocianate (PITC). + OH L’avantage de cette technique est qu’elle permet de séquencer un peptide en détachant l’aa N terminal, puis le suivant et ainsi de suite, c’est donc une méthode récurrente Remarque : les 3 méthodes (Sanger, Dansylation, Edman) sont des techniques qui permettent l’identification des acides aminés Nt des peptides (extrêmité NH2 libre) 3) Propriétés dues simultanément à la fonction NH2 et COOH : Désamination et décarboxylation simultanées (réaction à la Ninhydrine) Gel-filtration Chromatographie d’exclusion moléculaire SDS-PAGE Iso-électrofocalisation
