La république Algérienne Démocratique et populaire université des sciences et technologies Houari Boumediene. PRODUCTION DE PROTEINES D’ORGANISMES UNICELLULAIRE. Présenter par : Bendjoudi Anis Ayache Adam. PLAN 1- INTRODUCTION. 2- Les Types d’organisme unicellulaire. 3- La synthèse des protéines. 4-Le milieu de culture. 5- Modification génétique des microorganismes. 6-Les procédés de fermentations. 7- Les différents substrats. 8- La croissance des Micro-organismes. 9- Extraction et purification des protéines. 10- Les critères requis dans les P.O.U et domaines d’application 11- Conclusion. INTRODUCTION: unicellulaire MICROBES pluricellulaire MERDE • Les microorganismes unicellulaires sont des organismes constitués d’une seule cellule, il en existe des millions d’espèces, les scientifiques pensent qu’ils sont présent sur terre depuis 3.8millions d’années. • Parmi ces microorganismes unicellulaires on distingues : LES DIFFERENT MICRO-ORGANISMES UNICELLULAIRES. Aquatiques Sous le sol Aeriens Phytoplancton produit la majorité de l’oxygène sur la planète et se trouve à la base des chaînes alimentaire dans l’océan. Les décomposeurs unicellulaires, terminent la chaîne alimentaire et convertissent l’azote du sol en nutriments pour les plantes. , Les paramécies : sont des micro-organismes vivant dans l’air. On peut aussi le trouver dans d’autres milieux Synthèse protéique : - comme tout autre être vivant un microorganismes unicellulaire peut se déplacer se nourrir faire les échange gazeux et se reproduire c’est-à-dire qu’il peut combler ses besoins fondamentaux, et la fonction la plus fondamentale qui nous intéresse est sa capacité à synthétiser ses propres molécules protéique, et même si cette synthèse se fait par les deux étapes essentielles c’est-à-dire la transcription et la traduction elle n’est pas complètement identique à celle des eucaryotes en effet l’opération chez ces organismes est beaucoup plus simple : La synthèse protéiques chez les eucaryotes et procaryotes unicellulaire Eucaryotes Procaryotes unicellulaire , • Et c’est pour cela que les scientifiques ont décidé d’utiliser ces organismes comme ‘’usines a protéines’’. • Mais quelles sont les procédures utilisées pour exploiter ces organismes ? Etapes de la production : Modification génétique Etapes post-production: Isolement • Dans notre cas par filtration Purification • À fin d’obtenir une protéine partiellement pure, Commercialisation. • Cela dépend du produit. Milieu de culture des Microorganisme unicellulaire Pour pouvoir entamer une production à l’échelle industrielle d’une quelconque protéine qu’elle soit enzymatique (ex : ADN polymérase , Lactase, protéines a valeur nutritionnelle, enzymes…), hormonale(ex : hormone de croissance GHB, insuline…), ou autre servant dans n'importe quel domaine, il faut d’abord faire une culture du microorganisme unicellulaire spécifique qui produit la protéine en question, et il faut savoir que le rendement de production est essentiellement lié à la qualité du milieu de culture c’est pour ca qu’il est primordiale qu’il soit élaboré selon des critères strictes convenables au micro organisme en question car chaque M.O nécessite un milieu de culture spécifique pour sa croissance. Milieu de culture des Microorganisme unicellulaire • Prenons exemple de la spirulines Milieu de culture des Microorganisme unicellulaire Les micro-algues du groupe des spirulines sont connus pour élaborer toute une gamme de produits intéressants à intérêt pharmaceutique, cosmétique et plus particulièrement alimentaire. Sur le plan de la composition chimique, les spirulines contiennent environ 70 % de protéines. Ce taux est supérieur à toutes les autres protéines microbiennes (inférieur à 60 %) ou des plantes tels que le blé, le maïs ou le soja. Par ailleurs, la teneur en acides aminés essentiels est mieux équilibré que celles issues de plantes (déficience en lysine) ou de micro-organismes (déficience en acides aminés soufrés). De ce fait, leur assimilation par l’organisme humain et animal est presque totale. Milieu de culture des Microorganisme unicellulaire La culture à petites échelles se fait sur des bacs en plastique, aquariums munis de pompe à 02 (volume de 5 à 10 litres). Pour cela, nous utiliserons le milieu à base de fiente de volaille récente (30 g/1), de sirop de fer et de bicarbonate de sodium dans des conditions favorables : PH alcalin (9-11), Température relativement élevée(37°) et une intensité lumineuse assez importante. Milieu de culture. Modification génétique: Pour que le micro-organisme synthétise la protéine d’intérêt il faut parfois incorporer dans son génome le gène codant pour cette dernière. Par micro-injection: L'opération consiste à introduire directement le gène étranger dans la cellule à modifier, à l'aide d’un micromanipulateur monté avec un microscope. On maintient la cellule à transformer avec une microaiguille et on introduit le gène accompagné de son complexe promoteurterminateur dans le noyau, à l’aide d’une micro-pipette. La cellule est alors génétiquement modifiée. Après l’injection, la cellule est libérée et mise en culture sur un milieu approprié. Etapes intermédiaire : • Il faut juste savoir qu’avant la fermentation on peut avoir des étapes intermédiaire qui vari d’un micro-organisme à un autre : • exemples : Forte Hydratation, longue exposition à la lumière pour les organismes chlorophylliens… La fermentation FERMENTATION Discontinue (batch) Fed bath (bath alimenté) Continue (système ouvert) Fermentation Discontinue ( Bach) le fermenteur est un système clos, fermé. Au temps zéro de la fermentation, la solution de nutriment stérile est inoculée avec des microorganismes (bactéries, levures). L’incubation se réalise dans des conditions d'agitation, de température, de pression partielle en oxygène et de PH régulés. Au cours de l'incubation, la quantité de microorganismes dans le fermenteur, la concentration en biomasse, en substrat et en produit varie constamment, conséquence du métabolisme microbien. Fed Bath ( Bath alimenté) le substrat est apporté au fur et à mesure de sa consommation par les microorganismes. Ce système est employé dans la production de la pénicilline. En effet, celle-ci est soumise à une répression catabolique lors de la présence d'une forte concentration de substrat carboné (le glucose). On procédé à l'ajout du substrat au fur et à mesure de sa consommation afin d'éviter l'accumulation de substrat dans la réaction. Fermentation continue ( Système ouvert) La solution de nutriment est apportée en continue au réacteur mais une quantité équivalente de solution fermentée est prélevée. Le volume est donc constant. On distingue 2 grands types de fermenteurs: Le réacteur à écoulement piston: il est caractérisé par un rapport longueur /largeur très élevé. Le réacteur est cylindrique (10 à 15 mètres de long). La solution de nutriment pénètre à une extrémité du réacteur et la biomasse cellulaire ainsi que la production du produit collecté à l'autre extrémité du réacteur. . Dans ce type de réacteur la turbulence est nulle. Il n'y a aucun mélange, pas d'agitation, pas d'homogénéité. Un élément qui entre dans le réacteur progresse sans mélange avec la molécule qui la précède ou qui la suit. Ceci génère des gradients de concentration à l'intérieur du réacteur. Plus on se situe loin par rapport à l'entrée du réacteur, plus la concentration de substrat est faible et plus la concentration du produit est élevée. L'inconvénient d’un tel type de réacteur est la difficulté de réguler un PH. . - Le réacteur infiniment mélangé: l'homogénéité du contenu du réacteur est parfaite. Tout élément qui pénètre dans le réacteur est homogénéisé au contenu du réacteur. La concentration d'un composé donné dans le réacteur est le même en tout point du réacteur. La concentration d'un composé donné dans l'efflue du réacteur est la même qu'à la concentration de ce composé à l'intérieur du réacteur. Les différents substrat utilisé dans les différent procédés de fermentation : On peut utiliser des différents substrat notamment: -La coque d'arachide, résidu du traitement industriel de l'arachide au Sénégal. • Les Déchets de Dattes. • Des fraises HORS-SOL -L’orchidée (Fleure riche protéines) - Du méthane , éthanol… La croissance : Lorsque l’inoculum est placé dans un bioréacteur il passe par 6 phases de croissance: 1- Latence 2- Accélération de croissance 3- Croissance exponentielle 4- Décélération de croissance 5- Phase stationnaire 6- Phase de déclin . Système fermé Système ouvert Extraction : • Comme il s’agi d’un organisme unicellulaire les protéines synthétisé seront diffuse au saint de l’étuve, donc aucun extraction n’est requise, dans ce cas on procéderas à une filtration : Retenu Méthode Taille de pores Microfiltration 100nm à 10µm Ultrafiltration 10 to 100nm Particules fines, virus, grosses protéines Nanofiltration 1 to 10 nm Purification protéines, élimination virus Osmose inverse 0.1 to 1 nm Purification d’eau Cellules et débris de cellules Purification : Il existe plusieurs techniques de fractionnement, qui reposent sur les variations de solubilité des protéines en fonction de la force ionique, de la constante diélectrique du solvant ou du pH. Le relargage (en anglais, salting out) des protéines à force ionique élevée varie suivant les protéines. Il est donc possible, par un accroissement progressif de la concentration saline (ex. sulfate d'ammonium), de rédiger une précipitation fractionnée des protéines, sans pour autant prétendre à obtenir des protéines pures. Les protéines ont une solubilité minimale au point isoionique (valeur du pH pour laquelle la charge nette est nulle). Utilisant cette propriété et les variations de solubilité en fonction de la force ionique, on peut séparer des protéines de point isoélectrique différent. Il est également possible de réaliser un fractionnement par les solvants organiques. Les critères requis dans la synthèse des P O U La valeur du produit résultant d'une culture destinée à l'obtention de P. O. U. est actuellement bien définie par la détermination d'un certain nombre de critères qui sont notamment : 1) le rendement global de la culture (poids du Produit final/poids du substrat) 2) le taux des différents constituants chimiques ou biochimiques du produit (original et final) 3) la composition en acides aminés 4) la digestibilité, le coefficient d'efficacité protéique ( « Protein efficiency ratio») et l'utilisation protéique nette («Net protein utilisation ») 5) la recherche des toxines 6) la valeur alimentaire pour l'animal Importance et domaines d’application des P.O.U: Comme additif alimentaire. Comme complément alimentaire ( Dans la musuclation ) Co des aliment thérapeutique ( Ex : contrôle de l’obésité) Importance et domaines d’application des P.O.U: Dans la fabrication de médicament naturels (Perte ou gain du poids, réduction du taux de cholestérol ,pour l’hypertension et la réduction du stress, insuline naturelle… etc) Pour la recherche scientifique ( Les DNA polymérase, atp synthétase) Dans les produit cosmétique ( Les antirides…) Conclusion Pour conclure, les micro-organismes unicellulaires ce sont avérés comme une opportunité qui a ouvert plusieures portes dans la biologie moléculaire non seulement dans le milieu de la recherche et la compréhension des mécanismes cellulaires mais notamment le milieu industriel permettant la production de molécules révolutionnant le monde de la médecine, de l’alimentation et bien d’autres, et ce grâce à des procédés simples gérable et économiques et a retombé écologiques. L’Algérie a vu ces 10 dernière année une évolution assez remarquable dans ce domaine surtout dans le côté alimentaire. La république Algérienne Démocratique et populaire université des sciences et technologies Houari Boumediene. PRODUCTION DE PROTEINES D’ORGANISMES UNICELLULAIRE. Présenter par : Bendjoudi Anis Ayache Adam.
