REPUBLIQUE DU BENIN ****** MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ******** UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI ********* FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES *********** MEMOIRE En vue de l’obtention du Diplôme de MASTER de Biologie Cellulaire-Immunologie Thème : EFFETS PROTECTEURS DE L’AIL ET DE LA VITAMINE C SUR LA FONCTION REPRODUCTRICE DES RATS MALES EXPOSES AU NITRATE DE PLOMB Présenté par : DOSSOU AGOIN. B. Gérard Sous la direction de DIRECTEUR DU MEMOIRE EDORH A. Patrick MEMBRES DU JURY MOUTAIROU Kabirou : Président du Jury Professeur Titulaire des Universités (C.A.M.E.S) GBANKOTO Adam : Examinateur YESSOUFOU Akadiri : Rapporteur FAST/UAC EDORH A. Patrick : Directeur du mémoire Soutenue publiquement le 27/11/2016 Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 1 REMERCIEMENTS A ma famille, pour les sacrifices consentis, la compréhension et surtout pour la patience démontrée, recevez ma reconnaissance et ma gratitude. A mon Directeur de mémoire, Pr EDORH A. Patrick, mes mots ne sauraient traduire la reconnaissance et l’estime que j’ai à votre égard. Professeur, vous êtes un exemple à méditer aussi bien pour vos qualités humaines que professionnelles. A mon Co-directeur, Dr KINSICLOUNON Gilles, infinie reconnaissance pour vos multiples efforts et précieux conseils prodigués pendant la réalisation de ce travail. Aux responsables de la formation de Biologie Cellulaire-Immunologie, mes remerciements pour cette chance d’initiation à la recherche scientifique que vous offrez aux étudiants. Mes hommages aux membres du Jury pour avoir accepté de juger de la qualité de ce travail. A toute l’équipe de la polyclinique LAB/Campus en particulier à Angélique, Nadège et Jérolle, mes remerciements pour votre accompagnement. A toute l’équipe du LaRBiTE (Laboratoire de Recherche en Biochimie et Toxicologie de l’Environnement), infinie reconnaissance. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 2 ACRONYMES, SIGLES ET ABREVIATIONS ABP : Protéine de liaison des androgènes ADN : Acide Désoxyribonucléique ERO : Espèces Réactives d’Oxygène FSH : Hormone Folliculo-stimulante GnRH : Gonadolibérine ISBA : Institut des Sciences Biomédicales Appliquées LH : Hormone Lutéinique Pb : Plomb SOD : Superoxyde Dismutase TT : Testosterone Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 3 Liste des Figures Figures Titres Pages Figure 1 : Représentation de l’appareil reproducteur du rat mâle ……….…………………...13 Figure 2 : Coupe d’un testicule………………………………………………………………..14 Figure 3 : Régulation neuro-endocrine de la spermatogénèse………………………………...17 Figure 4 : Déséquilibre entre pro/antioxydant favorisant le stress oxydant…………………..21 Figure 5 : Formule développée de la vitamine C……………………………………………...23 Figure 6 : Photo de rats en cage…………………………………………………………….....27 Figure 7 : Photo de bulbes d’ail frais……………………………………………………….....27 Figure 8 : Photo de l’Immuno-analyseur Multi-paramétrique Mini-vidas……………………32 Figure 9 : Principe du fonctionnement du Mini vidas…………………...................................33 Figure 10 : Variation de la mobilité des spermatozoïdes en fonction de l’exposition……….....37 Figure 11 : Variation de la vitalité des spermatozoïdes en fonction de l’exposition…………...38 Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 4 Liste des Tableaux Tableau I : Chronologie de la spermatogénèse chez le rat ……………………………16 Tableau II : Description générale de la cartouche (Mini-vidas)………………………..32 Tableau III : Poids corporel, poids des testicules et IGS des rats de l’étude …………...36 Tableau IV : Profil des hormones sexuelles chez les rats de l’étude……………............39 Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 5 RESUME Les métaux toxiques sont très répandus dans l’environnement. Leur accumulation dans l’organisme induit plusieurs troubles fonctionnels en particulier sur le système reproducteur. Le but de la présente étude est d’évaluer l’effet protecteur de l’ail et de la vitamine C sur la fonction reproductrice mâle. Pour ce faire, vingt-cinq rats mâles (25) ont été répartis en cinq groupes. Les rats sont exposés au nitrate de plomb et aux différents traitements pendant 28 jours comme suit : le groupe I a servi de contrôle ; le groupe II est exposé au nitrate de plomb à 600 mg/Kg de poids corporel ; les groupes III et IV sont d’abord traités respectivement par la vitamine C à 1666 mg/Kg de poids corporel et par l’extrait aqueux d’ail à 500 mg/Kg de poids corporel avant d’être exposés à la même dose de nitrate de plomb ; le groupe V est traité par le mélange ail/vitamine C respectivement à 500 mg/Kg et à 1666 mg/Kg puis exposé à la même dose de nitrate de plomb. L’exposition des rats au nitrate de plomb induit une baisse de la mobilité, de la vitalité et du taux de testostérone (p<5%). Le traitement par l’extrait aqueux d’ail accroît l’indice gonadosomatique (IGS), la mobilité, la viabilité des spermatozoïdes, les taux de FSH, LH et de testostérone. Le traitement de l’intoxication au nitrate de plomb par la vitamine C diminue l’IGS, la mobilité des spermatozoïdes et est sans effet sur la vitalité, les taux de FSH et de testostérone. L’association ail/vitamine C augmente la vitalité, le taux de FSH et de testostérone. Ces résultats suggèrent que l’extrait aqueux d’ail possède un puissant effet protecteur contre les effets néfastes du plomb sur la reproduction mâle tandis que cet effet est moins marqué pour l’association ail/vitamine C. Par contre, l’utilisation de la vitamine C à dose élevée a un effet délétère sur la fonction reproductrice des rats mâles. Mots clés : Nitrate de plomb-Ail-Vitamine C-Fonction reproductrice- Rats ABSTRACT Toxic metals are widespread in the environment. Their accumulation in the body induces several functional disorders particularly on the reproductive system. The aim of this study is to evaluate the protective effect of garlic and vitamin C on male reproductive function. To do this, twenty-five male rats (25) were divided into five groups. Rats are exposed to lead nitrate and various treatments for 28 days as follows: group I served as a control; Group II is exposed to lead nitrate at 600 mg / Kg body weight; III and IV are first processed respectively by vitamin C to 1666mg / Kg body weight and the aqueous extract of garlic to 500 mg / kg body weight before being exposed to the same dose of nitrate lead ; Group V is treated with the garlic / vitamin C mixture respectively 500 mg / kg and 1666 mg / Kg and then exposed to the same dose of lead nitrate. Exposure of rats to lead nitrate induces a decrease in mobility, vitality and testosterone levels (p <5%). Treatment with aqueous garlic extract increases gonadosomatic index (IGS), mobility, sperm viability, levels of FSH, LH and testosterone. The treatment of lead poisoning nitrate with vitamin C reduces the IGS, sperm motility and has no effect on sperm vitality, levels of FSH and testosterone. Garlic / Vitamin C association increases vitality, FSH and testosterone. These results suggest that the aqueous extract of garlic has a powerful protective effect against the harmful effects of lead on male reproduction while this effect is less pronounced for association garlic / vitamin C. Conversely, the use of high dose of vitamin C has a deleterious effect on reproductive function in male rats. Keywords: Lead -Ail-Vitamin C- Reproductrice Function-Rats Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 6 SOMMAIRE INTRODUCTION ................................................................................................................ 8 OBJECTIF PRINCIPAL ....................................................................................... 11 OBJECTIFS SPECIFIQUES.................................................................................. 11 ARTICULATION I RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES : ............................................... 12 ARTICULATION II : MATERIEL ET METHODES ...................................................... 26 ARTICULATION III : RESULTATS ............................................................................... 36 ARTICULATION IV : DISCUSSION .............................................................................. 42 CONCLUSION ET SUGGESTIONS ................................................................................ 47 REFERENCES ................................................................................................................... 47 Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 7 INTRODUCTION Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 8 INTRODUCTION La fertilité des hommes a connu une baisse progressive au cours de ces dernières décennies (Vigeh et al., 2011). L’étude de Carlsen et al. (1992) a mis en évidence la détérioration de la qualité du sperme des hommes en âge de procréer de 1930 à 1990. Selon de récentes données épidémiologiques, environ 15 à 20% des couples en désir d’enfants sont confrontés à l’infertilité (Methorst et al., 2014) . D’après l’OMS, dans la moitié de ces cas, des facteurs masculins sont en cause et des altérations quantitative et/ou qualitative des spermatozoïdes sont généralement présentes. Quarante pour cent (40%) des cas d’infertilité masculine sont de type idiopathique (Oehninger, 2000 ; Methorst et al., 2014 ;). Selon Sheweita et al. (2005), l’infertilité idiopathique est due à des facteurs comportementaux, diététiques et environnementaux. La chaleur, l’irradiation et l’exposition aux métaux lourds sont des causes environnementales susceptibles d’altérer la qualité du sperme (Wu et al., 2012). Ainsi, parmi les métaux lourds, le plomb a fait l’objet de plusieurs études en lien avec ses effets nocifs sur le système reproducteur mâle des mammifères. Le plomb est un métal toxique retrouvé dans les batteries, le gasoil, les peintures, les canalisations d’eaux, les insecticides et certains cosmétiques. L’exposition des individus au plomb provoque des intoxications dont la gravité est variable selon la dose et la durée d’exposition (Ramah et al., 2015). Les effets nocifs du plomb sur le système reproducteur mâle sont observés chez l’homme et sur les modèles animaux tels que le rat et la souris (Wu et al., 2012 ; Obidike et al., 2012). Le plomb affecte la reproduction masculine en perturbant la spermatogénèse, les sécrétions des glandes accessoires et le fonctionnement de l’axe hypothalamo-hypophysaire (Vigeh et al., 2011; Rodamillans et al.,1988). L’exposition des rats ou des souris mâles au plomb induit également une altération de leur fonction reproductrice. Cette altération est caractérisée par la diminution du poids des testicules, la baisse de la qualité des spermatozoïdes (nombre, motilité, morphologie et viabilité des spermatozoïdes) et la perturbation des sécrétions hormonales gonado-hypophysaires (LH, FSH, Testostérone) (Ayindé et al., 2012 ; Riaz et al., 2011). Une des principales hypothèses actuelles concernant l’infertilité masculine idiopathique est une atteinte liée au stress oxydant (Lanzafame et al., 2009) . En effet, 30 à 40% des hommes infertiles présentent des taux élevés d’espèces réactives d’oxygène dans Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 9 leur liquide séminal (Lanzafame et al., 2009). Le stress oxydant est caractérisé par un déséquilibre entre les molécules pro-oxydantes et antioxydantes en faveur des entités oxydantes (Flora et al., 2011). Le contrôle du stress oxydant associé à l’exposition au plomb nécessite l’augmentation de la capacité antioxydante de l’organisme (Flora et al., 2012). Les stratégies utilisées pour accroitre cette capacité antioxydante sont les suivantes : élimination tissulaire, la prévention de l’interaction du plomb avec les biomolécules (chélation) et la stimulation des défenses antioxydantes cellulaires par la supplémentation en antioxydants exogènes (Asadpour et al., 2013). La chélation par les vitamines (B, C, E) et les composés thiols est la stratégie la plus souvent utilisée pour traiter le stress oxydatif induit par le plomb (Hsu et al., 2013 ; Flora et al., 2012). La vitamine C est une vitamine hydrosoluble retrouvée dans les fruits et les légumes. Elle possède une activité antioxydante ( Ayindé et al., 2012). La vitamine C a montré au cours des précédents travaux, un effet dose-dépendant positif sur la qualité du sperme (motilité, viabilité, concentration des spermatozoïdes) des individus souffrant d’infertilité idiopathique (Edmund et Edmund, 2012). Par ailleurs, l’ail ou Allium sativum est une plante utilisée pour ses vertus alimentaires et médicinales. Les études réalisées sur l’ail ont permis de mettre en évidence la présence de deux classes d’antioxydants notamment les flavonoïdes et les composés soufrés (Valente et al., 2014). Au Bénin, l’exposition des populations aux métaux lourds en particulier au plomb est documentée par plusieurs travaux. En effet, nombres d’auteurs ont démontré la contamination des eaux de boissons, des céréales, des animaux, des légumes et même des plantes médicinales par les métaux lourds (Montcho et al., 2014 ; Koumolou et al., 2013 ; Kinsiclounon et al.,2013 ; Edorh et al., 2009). Cette situation présente un réel danger pour l’homme du fait des phénomènes de bioaccumulation dans la chaîne alimentaire (CEDA, 1997). Par ailleurs, l’enquête épidémiologique réalisée à Sô-ava par Kinsiclounon et al. (2013) a mis en évidence au sein de la population des signes cliniques évocateurs d’une intoxication chronique au plomb. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 10 Eu égard à toutes ces situations de contamination et d’intoxication de la population par le plomb, il est nécessaire d’évaluer l’effet protecteur de substances antioxydantes contre les effets néfastes du plomb sur la fonction reproductrice masculine. C’est donc dans cette optique que la présente étude a été initiée et a pour : OBJECTIF PRINCIPAL Caractériser les effets protecteurs de l’ail (Allium sativum) et de la vitamine C sur la fonction reproductrice des rats mâles exposés au nitrate de plomb. OBJECTIFS SPECIFIQUES 1- Déterminer l’effet de l’ail, de la vitamine C et de l’association ail/vitamine C sur l’indice gonadosomatique (IGS), 2- Analyser l’effet de l’ail, de la vitamine C et de l’association ail/vitamine C sur la qualité des spermatozoïdes, 3- Caractériser l’effet de l’ail, de la vitamine C et de l’association ail/vitamine C sur les niveaux de sécrétion des hormones sexuelles (FSH, LH, Testostérone). Les hypothèses qui sous-tendent ce travail sont les suivantes : - l’ail, la vitamine C et l’association ail/vitamine C augmentent l’indice gonadosomatique - l’ail, la vitamine C et l’association ail/vitamine C préservent la qualité des spermatozoïdes. - l’ail, la vitamine C et l’association ail/vitamine C restaurent le taux des hormones sexuelles gonado-hypophysaires. Ce mémoire est organisé en quatre articulations. La première articulation regroupe les rappels bibliographiques portant sur l’organisation et les fonctions de l’appareil reproducteur mâle, l’impact des métaux lourds sur la santé reproductrice du mâle ; stress oxydant, infertilité idiopathique et antioxydants. La seconde est axée sur le cadre, le matériel, et la méthodologie d’étude. Les troisième et quatrième articulations abordent respectivement les résultats obtenus et leur discussion. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 11 ARTICULATION I : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 12 ARTICULATION I : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 1) Organisation et fonctions de l’appareil reproducteur chez le rat mâle L’appareil reproducteur du rat mâle est composé des testicules et des organes génitaux annexes. Les principaux organes génitaux annexes sont les conduits spermatiques (épididyme, canal déférent, urètre), les glandes annexes (vésicules séminales, la glande coagulante, la prostate) et des organes génitaux externes (le scrotum et le pénis). Sur le plan fonctionnel, le système génital joue deux fonctions essentielles à savoir la production et le transport des spermatozoïdes (spermatogénèse) et la sécrétion d’hormones sexuelles. (AitHammadouche, 2013). La figure 1 ci-dessous présente l’organisation générale de l’appareil reproducteur chez le rat Wistar mâle. Figure 1 : Représentation de l’appareil reproducteur du rat mâle (Popesko et al., 1992). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 13 1-1) Les testicules Les testicules sont des organes de forme ovoïde de 2 cm de longueur. Ils sont doués d’une double fonction exocrine et endocrine. Les testicules sont essentiellement composés de tubules séminifères contournés contenant des cellules germinales associées à des cellules somatiques appelées cellules de Sertoli. C’est dans les tubules séminifères que se déroule la spermatogénèse ou la production des spermatozoïdes. L’espace interstitielle entre les différents tubules contient des endocrinocytes interstitielles ou cellules de Leydig responsables de la production de testostérone (Marieb, 2008). Figure 2 : Coupe d’un testicule (Terriou et Barry, 2000 modifié) 1-2) Les organes génitaux annexes Les conduits spermatiques sont représentés par l’épididyme, le canal déférent et l’urètre. Ces conduits assurent le transport des spermatozoïdes vers le milieu extérieur et leur maturation fonctionnelle. Cette maturation a lieu précisément dans l’épididyme. La maturation épididymaire consiste en l’acquisition de la mobilité flêchante, de l’aptitude à se fixer à la zone pellucide, à féconder et à assurer un développement normal du fœtus (Marieb, 2008). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 14 Les glandes annexes assurent la production du plasma spermatique. Ce milieu permet l’activation des spermatozoïdes. Quant aux organes génitaux externes, ils permettent d’une part la réalisation de la spermatogénèse à une température moyenne inférieure à la température corporelle (scrotum) et d’autre part d’introduire les spermatozoïdes dans les voies génitales de la femme par l’intermédiaire du pénis. (Marieb, 2008). 1-3) Régulation des fonctions testiculaires Les testicules des mammifères adultes ont deux fonctions : la spermatogénèse et la production d’hormones sexuelles. La spermatogénèse est un processus dynamique et synchrone se déroulant dans les tubules séminifères contournés des testicules avec l’aide des cellules de Sertoli qui aboutit à la formation de spermatozoïdes à partir de spermatogonies (D’Cruz et al., 2010). La spermatogénèse est décomposée en trois grandes phases notamment la mitose ou la phase proliférative, la méiose et la spermiogénèse (Hess et Renato de Franca., 2008). Chez le rat, la phase proliférative porte sur les spermatogonies (A, In et B) qui se divisent par des mitoses classiques. Les spermatogonies B se divisent pour donner deux spermatocytes primaires ou pré-leptotène. La phase méiotique consiste en la division réductionnelle puis équationnelle des spermatocytes primaires pour donner des spermatides. Enfin la spermiogénèse représente la différenciation des spermatides en spermatozoïdes après formation de l’acrosome, du flagelle et un remodelage chromatinien (Hess et Renato de Franca., 2008). Le temps nécessaire à la transformation d’une spermatogonie en spermatozoïde est d’environ 50 jours chez un rat mâle. Le tableau I ci-dessous montre la chronologie des différentes phases de la spermatogénèse chez un rat mâle. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 15 Tableau I : Chronologie de la spermatogénèse chez le rat Phase de multiplication goniale Méiose Prophase 17,5 Jours Fin Ière division >0,5 jour IIème division >0,5 jour Spermiogénèse 10,5 jours Pré-leptotène 3,5 jours Leptotène 1 jour Zygotène 2 jours Pachytène 11 jours Diplotène <1 jour 19 jours 20,5 jours Source : Geoffroy-Siraudin, 2010 La spermatogénèse est régulée par l’axe hypothalamo-hypophysaire et par les interactions entre les cellules de Sertoli avec les cellules germinales et celles de Leydig. La figure 3 ci-dessous décrit la régulation de la spermatogénèse par l’axe hypothalamohypophysaire-gonadique. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 16 Figure 3 : Régulation neuro-endocrine de la spermatogénèse (Geoffroy-Siraudin., 2010 modifié) En effet, l’hypothalamus sécrète de manière pulsatile la GnRH qui induit la sécrétion de FSH et de LH par l’adénohypophyse. La LH stimule la production de testostérone par les cellules de Leydig. La FSH pour sa part se lie à ses récepteurs sur les cellules de Sertoli et conduit cette dernière à sécréter l’ABP. L’ABP se lie avec une forte affinité à la testostérone et la concentre dans les tubes séminifères. Cette dernière va agir sur les cellules de Sertoli et entrainer la maturation des cellules germinales. Différents mécanismes de rétrocontrôle opèrent dans le contrôle de l’activité de l’axe hypothalamo-hypophysaire. D’une part, la LH hypophysaire provoque l’augmentation de la production de testostérone par les cellules interstitielles. En réponse, cette hausse du taux de testostérone circulant par un rétrocontrôle négatif inhibe la libération de LH par l’hypophyse. D’autre part, la libération de FSH stimule les cellules de Sertoli qui à leur tour sécrètent de l’inhibine. L’inhibine provoque en retour une inhibition de la libération de FSH par l’adénohypophyse (Geoffroy-Siraudin, 2010). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 17 2) Impact des métaux lourds sur la santé reproductrice du mâle Les métaux lourds sont généralement perçus comme étant des éléments chimiques qui présentent une toxicité ou une écotoxicité potentielle. Le terme "métal lourd" recouvre un ensemble distinct de métaux ou de métalloïdes. Plusieurs critères sont proposés pour caractériser ces métaux : la densité, le poids atomique, le numéro atomique, les propriétés chimiques et la toxicité. En résumé, on peut retenir qu’un métal lourd peut être considéré comme : - tout métal ayant une densité située entre 3,5 et 7 g/cm3 - tout métal pouvant être toxique pour les systèmes biologiques - tout métal ayant un numéro atomique élevé, en général supérieur à celui du calcium (Z=20) (Duffus, 2002). On distingue deux types de métaux lourds, les métaux lourds essentiels tels que le zinc et le magnésium et les métaux toxiques comme le plomb, le cadmium, l’arsenic et le mercure. Les métaux toxiques sont des métaux qui ne sont pas nécessaires au bon fonctionnement de l’organisme (Manfo et al., 2014). Les métaux lourds sont des constituants naturels de la croûte terrestre. Ils y sont retrouvés à de faibles teneurs. Cependant, la teneur en métaux lourds dans les compartiments de l’environnement augmente en raison des activités anthropogéniques (Wilson et Pyatt, 2007). L’extraction minière et la transformation industrielle des minerais en composants essentiels à la fabrication de matériels électroniques, des véhicules sont des activités humaines responsables de l’accumulation des métaux lourds dans l’environnement (Manfo et al., 2014). Une fois dans les écosystèmes, les métaux lourds interfèrent avec les processus vitaux chez les plantes et les animaux par le phénomène de la bioaccumulation (Lam et al., 2013). La bioaccumulation désigne la capacité de certains organismes (végétaux, animaux, fongiques et microbiens) à absorber et concentrer des substances chimiques (utiles ou toxiques) présentes dans l’environnement dans tout leur organisme ou dans une partie (tissus). La bioaccumulation des métaux lourds par l’homme peut provoquer l’atteinte de seuils toxiques et entrainer des pathologies (Miquel, 2001). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 18 Plusieurs problèmes sanitaires sont liés à l’exposition aux métaux tels que l’insuffisance rénale, l’hépatotoxicité, les effets adverses neurocognitifs, aussi bien que la perturbation de la fonction reproductrice. Généralement, les substances toxiques pour la reproduction sont des agents chimiques ou des conditions physiques susceptibles d’altérer la fertilité ou la capacité d’un individu à concevoir une progéniture viable (Thorsrud et Faqi, 2011). L’évaluation de la fertilité d’un individu nécessite la connaissance des paramètres suivants : - Paramètres liés à la qualité du sperme (volume du sperme, la viscosité du sperme, concentration des spermatozoïdes, la motilité, la viabilité et la morphologie des spermatozoïdes) - Paramètres liés aux fonctions sécrétoires de la prostate et de la vésicule séminale - Paramètres associés à la fonction endocrine dans la reproduction (LH, FSH, Testostérone). Selon plusieurs travaux, l’exposition des hommes aux métaux lourds provoque des effets néfastes sur leur aptitude à se reproduire par la perturbation des paramètres précédemment mentionnés. En effet, cette exposition entrainerait la diminution de la taille des testicules, la baisse de la qualité du sperme et la perturbation du fonctionnement de l’axe neuroendocrinien. L’intoxication chronique par le plomb peut aboutir dans certains cas à une perte de la libido ou à une impotence. (Pizent et al., 2012). Cas du plomb Le plomb est un élément métallique de numéro atomique 82 et de poids atomique 207,2 g. C’est l’un des premiers métaux utilisés par l’Homme dans l’histoire de l’humanité en raison de ses nombreuses propriétés. Les caractéristiques uniques du plomb telles que sa flexibilité, sa malléabilité, sa ductilité, son faible point de fusion et sa résistance à la corrosion ont favorisé son utilisation dans les industries de fabrication d’automobiles, de peintures, de céramiques (Geoffroy-Siraudin, 2010). L’accumulation du plomb dans les systèmes biologiques et dans les compartiments inertes de l’environnement sont les conséquences directes de son usage massif. Le caractère non biodégradable du plomb est le principal facteur expliquant sa persistance prolongée dans l’environnement (Manfo et al., 2014 ; Flora et al., 2012). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 19 L’exposition des populations au plomb est liée aux activités industrielles, domestiques et au mode d’alimentation. Les principales activités industrielles associées à la libération du plomb dans l’environnement sont l’extraction minière, la métallurgie des métaux non ferreux, la fabrication d’accumulateurs et la récupération de métaux. Les peintures, les activités de loisirs (fabrication de plomb de chasse ou de pêche, poterie), la tuyauterie et les soudures de canalisations sont des éléments du milieu domestique exposant les individus au plomb. Par ailleurs, la consommation des aliments contaminés tels que les légumes, les coquillages, les graines et les fruits contaminés au plomb expose également les populations. (Ait Hammadouche, 2013). Les voies de pénétration du plomb dans l’organisme sont pulmonaire, digestive et secondairement cutanée. L’absorption du plomb par la voie digestive se fait majoritairement par un mécanisme actif par compétition avec le fer, le magnésium, le zinc et d’autres cations divalents. C’est un transport saturable comme le prouve la baisse de la quantité de plomb absorbée quand sa quantité dans l’estomac croît (Ait Hammadouche, 2013). Après absorption, le plomb se distribue dans les compartiments tissulaires où il interfère avec plusieurs systèmes de l’organisme tels que le système nerveux, le système rénal, hématopoïétique et reproducteur. Les effets du plomb sur le système reproducteur mâle ont été étudiés aussi bien chez les hommes que chez les rats. L’exposition des mammifères au plomb provoquerait des effets sur la production des spermatozoïdes et les sécrétions d’hormones sexuelles. En effet, chez les hommes, plusieurs travaux montrent que pour des plombémies sanguines supérieures ou égale à 40 µg/dl, on note une réduction du nombre de spermatozoïdes, une baisse de la mobilité et une augmentation des anomalies morphologiques des spermatozoïdes, en particulier au niveau de la tête (Telišman et al., 2000). Cependant, certaines études n’ont pas retrouvé de corrélation entre l’exposition au plomb et la modification des paramètres spermatiques chez les travailleurs, ou chez les lapins aux fortes doses (Vigeh et al., 2011 ; Bonde et al., 2002). Les travaux portant sur l’influence du plomb sur les sécrétions hormonales sexuelles soulignent que le plomb agit sur l’axe hypothalamo-hypophyso-testiculaire de manière dose et durée dépendante (Ait Hammadouche, 2013 ; Hachfi et al., 2008). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 20 Sokol et al. (2002) ont montré que l’exposition des rats aux faibles doses de plomb induit une augmentation de la sécrétion de LH et de GnRH. De plus selon, Gustafson et al. (1989), les hommes présentant des plombémies variant entre 5 à 40 µg/dl montrent une augmentation de la production de testostérone. Ainsi selon ces auteurs, l’exposition au plomb provoque un déséquilibre hormonal caractérisé par une augmentation de LH, de FSH et une perturbation des mécanismes de rétrocontrôle. Toutefois selon d’autres auteurs, l’exposition des rats à l’acétate de plomb provoque plutôt une diminution de la sécrétion de LH et de testostérone (Asadpour et al., 2013 ; Ayindé et al., 2012). La toxicité du plomb sur le système reproducteur procède par plusieurs mécanismes notamment la baisse de l’expression des isoformes des canaux K+ et Ca++ situés dans les testicules et dans les spermatozoïdes, la diminution de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline et de la Na+/K+ ATPase et induction du stress oxydant. Notons que dans le cadre de l’infertilité idiopathique, le principal mécanisme de toxicité des métaux régulièrement mentionné est le stress oxydant (Methorst et al., 2014 ; Vigeh et al., 2011). 3) Stress oxydant, infertilité idiopathique et antioxydants Le stress oxydant caractérise le déséquilibre entre la production des espèces réactives d’oxygène (ERO) et la capacité de l’organisme à les détoxifier (système antioxydant). La figure 4 ci-dessous schématise le déséquilibre entre les agents oxydants et les défenses antioxydantes. Figure 4 : Déséquilibre entre pro/antioxydant favorisant le stress oxydant (Bouldjadj, 2009) Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 21 Les ERO sont des espèces chimiques possédant un électron périphérique non apparié les rendant instables. Ces espèces chimiques sont capables de modifier les biomolécules de leur voisinage par oxydation. Elles induisent ainsi des réactions d’oxydation en chaine qui provoquent des dommages cellulaires, tissulaires et organiques (Bouldjadj, 2009). L’anion superoxyde (O2-), le radical hydroxyle (OH.) et le peroxyde d’hydrogène (H202) sont les principaux ERO présents dans le liquide séminal. Les ERO sont des produits intermédiaires du métabolisme cellulaire. Elles joueraient un rôle dans les processus physiologiques des spermatozoïdes lorsqu’elles sont générées à des concentrations normales. En effet, les ERO participent à la compaction de l’ADN, au remodelage des membranes, à l’acquisition de la mobilité rectiligne, à la capacitation et à la réaction acrosomique (Methorst et al., 2014). Cependant, le niveau des ERO peut augmenter anormalement au cours des pathologies du système reproducteur mâle, suite à la consommation du tabac, de l’alcool, des phtalates et de l’exposition aux métaux lourds (Methorst et al., 2014 ; Agarwal et Sekhon, 2010). Les dommages causés par les ERO sur les spermatozoïdes sont : la peroxydation lipidique, la diminution de la mobilité et l’apoptose. Cette présence excessive des ERO dans l’environnement des spermatozoïdes entraine une baisse de la qualité du sperme et expose donc les individus au risque d’infertilité (Methorst et al., 2014). Les organismes disposent de systèmes de protection contre les effets néfastes du stress oxydant. Ces systèmes sont appelés systèmes antioxydants. On appelle antioxydants au sens large, l'ensemble des molécules susceptibles d'inhiber directement la production, de limiter la propagation ou de détruire les espèces actives de l'oxygène (Favier, 2003). L’organisme humain dispose de trois systèmes antioxydants interdépendants luttant contre le stress oxydant : les antioxydants endogènes, les antioxydants diététiques et les protéines de liaisons des métaux (Makker et al., 2009). En andrologie, les antioxydants possèdent beaucoup de fonctions telles que : - la protection des spermatozoïdes - la capture et élimination des ERO - la prévention contre la fragmentation de l’ADN - l’augmentation de la qualité du sperme des fumeurs - le blocage de la maturation prématurée des spermatozoïdes (Makker et al., 2009). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 22 Dans le sperme, les antioxydants sont présents dans le liquide séminal et dans les spermatozoïdes. Le liquide séminal contient principalement trois antioxydants enzymatiques notamment la SOD (Superoxyde dismutase), la catalase et la glutathion peroxydase/réductase. On y retrouve également des antioxydants non enzymatiques tels que la vitamine C, la vitamine E, la taurine, l’urée, l’albumine etc… Les spermatozoïdes contiennent essentiellement des antioxydants enzymatiques dont le principal est la SOD (Makker et al., 2009). Les antioxydants diététiques jouant un rôle dans la fertilité masculine sont la vitamine C, la vitamine E, les bêta-carotènes, les caroténoïdes et les flavonoïdes. (Sheweita et al., 2005). Les principales protéines de liaison des métaux sont l’albumine, les métallothionéines, la transferrine, la ferritine et la myoglobine. Ces dernières agissent en inactivant les métaux de transition, véritables catalyseurs de la production de radicaux libres (Greco et al., 2005). Les chélateurs de métaux notamment la transferrine, la lactoferrine et la céruloplasmine présents dans le sperme préviennent la peroxydation lipidique de la membrane des spermatozoïdes assurant l’intégrité de ces derniers (Sanocka et Kurpisz, 2004). 3-1) La vitamine C Encore appelée acide ascorbique, la vitamine C se retrouve dans les fruits, les légumes et les boissons. La figure 5 ci-dessous montre la formule développée de la vitamine C. Figure 5 : Formule développée de la vitamine C (Jehl et Madet, 2004). Cette vitamine est de nature hydrosoluble et joue un rôle de cofacteur dans les réactions d’hydroxylation et d’amidation. Elle est également utilisée dans la synthèse du collagène, des protéoglycanes et des composants de la matrice extracellulaire des tissus conjonctifs (Edmund et Edmund, 2012). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 23 L’acide ascorbique possède une activité antioxydante grâce à la présence de la fonction ène-diol qui la rend fortement réductrice. Dans l’organisme, la vitamine C participe à la régénération de la vitamine E (Edmund et Edmund, 2012). La vitamine C a été associée dans nombre d’études à l’amélioration de la qualité du sperme des individus. Notons que lors de la plupart de ces travaux la vitamine C était associée à d’autres vitamines ou substances antioxydantes. Elle agirait donc en synergie avec d’autres vitamines ou substances antioxydantes (Edmund et Edmund, 2012). La consommation journalière de 200 mg de vitamine C contribue à augmenter le nombre, la motilité et la morphologie des spermatozoïdes (Dawson et al., 1992). Cependant, Abel et al. (1983) ont démontré qu’une supplémentation des individus avec des doses élevées de vitamine C induit des effets néfastes sur la mobilité des spermatozoïdes. 3-2) Allium sativum Communément appelé ail, Allium sativum est une espèce végétale utilisée pour ses vertus alimentaires ou médicinales. Elle appartient à la famille des amaryllidaceae ou au genre Allium. On distingue généralement deux types d’ail, l’ail blanc et l’ail noir. Il est généralement prêté à l’ail blanc un rôle thérapeutique tandis que l’ail noir est indiqué comme aliment (Block, 2010). Les bulbes d’ail représentent la partie la plus utilisée de cette plante. Elles contiennent en pourcentage 84,09 % d’eau, de 13,38 % de matières organiques et 1,53 % d’éléments inorganiques. Les principales substances inorganiques que l’on retrouve dans ces bulbes sont les composés soufrés et le fer (Abdel Fattah et Edrees, 1972). Il existe quatre types de préparations des bulbes d’ail. On distingue l’homogénat d’ail, l’ail en poudre, extrait éthanolique d’ail et l’huile d’ail. Le type de préparation utilisé est déterminant pour son efficacité pharmacologique. La forme fraiche de l'ail est souvent décrite comme possédant la plus importante valeur thérapeutique (Valente et al., 2014). L’allicine est considérée comme le principal principe actif de l'ail mais d’autres composés tels que les acides aminés soufrés (S-allcystéine, S-allylmercaptocystéine, Sméthylcystéine, diallyldisulfure, sulfoxyde) joueraient un rôle déterminant dans les activités de pharmacologique de cette plante (Hammami et El-May, 2012 ; Sobenin et al., 2012). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 24 L’ail possède des effets antihypertenseur, hypocholestérolémiant, hypoglycémiant. Allium sativum influe également sur le système reproducteur mâle des mammifères (Valente et al., 2014). En effet, l’ail a fait l’objet de nombreuses études en andrologie qui ont abouti à des conclusions divergentes. Certains auteurs pensent qu’Allium sativum a une influence bénéfique sur la fonction reproductrice tandis que d’autres pensent le contraire. Ces divergences dans les conclusions seraient liées à la préparation d’ail utilisée et à un manque de standardisation des protocoles expérimentaux (Valente et al., 2014). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 25 ARTICULATION II : MATERIEL ET METHODES Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 26 ARTICULATION II : MATERIEL ET METHODES 2) Matériel 2-1-1) Cadre Cette recherche a été réalisée au Laboratoire de Recherche en Biochimie et Toxicologie de l’Environnement (LaRBiTE) sise à l’Université d’Abomey-Calavi et au Laboratoire (LAB/Campus) de l’Institut de Recherche pour la Santé et le Développement (IRSaD). 2-1-2) Matériel biologique Au cours de ce protocole expérimental, il a été utilisé un modèle animal et des bulbes d’ail frais.Le modèle animal utilisé est le rat blanc de laboratoire, espèce rattus norvegicus, souche Wistar (Figure 6). Les rats sont obtenus à l’animalerie de l’Institut des Sciences Biomédicales Appliquées (ISBA) et ont un poids compris entre 150 et 180 g. Toutes les procédures ont respecté les normes locales en vigueur sur le traitement des animaux de laboratoire selon la ligne directive 407 de l’OECD (2006). Les bulbes d’ail (Figure 7) ont été achetés au marché communal d’Abomey-Calavi. Figure 6 : Photo de rats en cage Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Figure 7: Photo de bulbes d’ail frais Page 27 2-1-3) Matériel technique Le matériel technique est composé de : - Nitrate de plomb - Microscope photonique (Olympus) - Une balance électronique (Denver Instrument) - Immunoanalyseur multiparamétrique (Mini-vidas) - Une centrifugeuse (Globe Medical England) - Un appareil photo-numérique 2-2) Méthodes La présente étude est de type expérimental. Elle est réalisée sur des rats mâles de souche Wistar. Les travaux se sont déroulés pendant 28 jours et ont porté sur 25 rats mâles adultes, sains de différence de poids n’excédant pas 20% en moyenne. Les différents traitements sont administrés aux rats par voie orale. Ces rats ont été répartis en cinq groupes de 5 rats chacun. Les différents groupes se présentent comme suit : - Groupe Contrôle (C) : lot témoin de 5 rats recevant chaque jour de l’eau distillée - Groupe Plomb (Pb) : lot intoxiqué de 5 rats recevant chaque jour du nitrate de plomb à 600 mg/Kg de poids corporel (Kinsiclounon et al., 2014). - Groupe Plomb + Ail (PbA): lot traité de 5 rats recevant chaque jour du nitrate de plomb à 600 mg/Kg de poids corporel et de l’extrait aqueux d’ail à 500 mg/Kg de poids corporel (Kinsiclounon et al., 2014) - Groupe Plomb + Vitamine C (PbV) : lot traité de 5 rats recevant chaque jour du nitrate de plomb à 600 mg/Kg de poids corporel et de la vitamine C à 1666 mg/Kg de poids corporel - Groupe Plomb +Vitamine C+ Ail (PbAV) : lot traité de 5 rats recevant chaque jour du nitrate de plomb à 600 mg/Kg de poids corporel, de l’extrait aqueux d’ail à 500 mg/Kg de poids corporel et de la vitamine C à 1666 mg/Kg de poids corporel. Au bout des 28 jours de traitement, les animaux sont anesthésiés par du chloroforme. Le sang est collecté par ponction rétro-orbitale. Il est recueilli dans des tubes secs et laisser à Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 28 température ambiante pour faciliter la coagulation. Les tubes sont ensuite centrifugés puis le sérum est recueilli dans des microtubes et conservés à -20°C pour les utilisations ultérieures. Les principales étapes de l’étude sont les suivantes : Préparation des extraits aqueux d’Allium sativum et de vitamine C. Détermination de l’effet de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur l’indice gonadosomatique Analyse de l’effet de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur la qualité des spermatozoïdes Evaluation de l’effet de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur les taux des hormones gonado-hypophysaire 2-2-1) Préparation de l’extrait aqueux d’Allium sativum L’extrait aqueux d’ail est préparé selon la méthode d’Asadpour et al. (2013). Brièvement, 50 grammes de bulbes d’ail fraiches sont homogénéisés avec 100 ml d’eau distillée glacée. Le mélange homogénéisé est filtré trois fois puis centrifugé à 2500 tours pendant 10 minutes. Le surnageant est recueilli puis filtré. La concentration de la solution d’ail est déterminée par la formule suivante : Concentration (mg/ml) = poids des bulbes d’ail (g)/ volume d’eau distillée (ml) La dose de la préparation (ml) à administrer selon le dosage (mg/Kg) se calcule par la formule ci-après Dose (ml)= dosage (mg/Kg)* poids corporel des rats (Kg)/ Concentration (mg/ml) 2-2-2) Préparation de la solution de vitamine C La dose de la solution de vitamine C administrée aux rats est déterminée en se basant sur les notions de Dose Sans Effet d’exposition (DSE) et des facteurs d’incertitude lors de l’extrapolation des doses des animaux aux humains (Renwick, 1993) En effet, la quantité de vitamine recommandée à un homme en bonne santé de 60Kg est de 1000 mg par jour. La dose par Kg de poids corporel est donc de 16,67 mg. Cette dose représente la Dose Journalière Admissible. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 29 La dose sans effet d’exposition est la dose maximale à laquelle un rat puisse être exposé sans provoquer de troubles physiologiques sur son organisme. Le chiffre 100 quant à lui désigne le facteur d’incertitude considérée au cours de l’extrapolation inter-espèce. La dose de vitamine C administrée au rat dans cette étude correspond à la DSE. La dose administrée au rat est calculée par la formule suivante. DSE= DJA* 100 En pratique, la solution de vitamine C (Vitamine C 1000 ; Juvamine) est préparée quotidiennement en dissolvant la quantité nécessaire de vitamine dans un volume correspondant d’eau distillée. Cette solution est conservée dans un flacon recouvert de papier d’aluminium pour éviter sa dégradation par la lumière. 2-2-3) Détermination de l’effet de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur l’indice gonadosomatique Caractérisation de l’IGS L’indice gonadosomatique (IGS) représente le rapport du poids des testicules d’un rat (g) sur son poids corporel à la fin de la période d’étude. Cet indice est calculé par la formule suivante : IGS (%)= Poids des testicules (g)/ Poids corporel (g)*100 2-2-4) Analyse de l’influence de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur la qualité des spermatozoïdes La qualité d’un spermatozoïde est appréciée par l’analyse des paramètres spermatiques tels que la mobilité et la viabilité. Préparation de la suspension de spermatozoïdes La suspension de spermatozoïdes provient de la partie distale ou caudale de l’épididyme. L’épididyme caudal est prélevé puis coupé en tranches fines par des ciseaux. Ces tranches sont incubées dans une boîte de pétri contenant 1 ml de NaCl à 9% à 37°C puis homogénéisées. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 30 2-2-4-1) Détermination de la mobilité des spermatozoïdes Un aliquot (40 µl) de l’homogénat précédemment préparé est déposé sur une lame puis observé entre lame et lamelle à l’objectif x 40. Le pourcentage de spermatozoïdes immobiles de l’échantillon est obtenu après comptage de 100 spermatozoïdes (Fernandes et al., 2011) Pourcentage de spermatozoïdes immobiles = Nombre de Spermatozoïdes immobiles / 100 2-2-4-2) Viabilité des spermatozoïdes La viabilité des spermatozoïdes est déterminée en ajoutant à un tube contenant 40 µl de la suspension de sperme fraichement préparée, 10 µl d’éosine Y. Le contenu du tube est homogénéisé, puis un aliquot du mélange est observé entre lame et lamelle à l’objectif x 40. La détermination de la viabilité des spermatozoïdes repose sur le comptage différentiel de 100 spermatozoïdes par observation de la proportion de spermatozoïdes non coloré (viable) par rapport à ceux colorés (non viable). La viabilité est exprimée en pourcentage. Pourcentage de viabilité (%) = Nombre de spermatozoïdes viables/ 100 2-2-5) Caractérisation de l’effet de l’ail, de la vitamine C et de l’association ail/vitamine C sur les taux de sécrétion des hormones sexuelles L’effet du traitement par l’ail, la vitamine C et l’association ail/vitamine C sur les taux de FSH, LH et testostérone a été évalué grâce aux dosages hormonaux. Ces dosages ont été réalisés par l’immuno-analyseur multiparamétrique Mini-vidas. La figure 8 ci-dessous montre en photo le Mini-Vidas. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 31 Figure 8 : Photo de l’immuno-analyseur multi-paramétrique Mini-vidas Principe du dosage Le principe de ce dosage associe la méthode immuno-enzymatique sandwich à la détection finale en fluorescence (ELFA). Cette méthode a été semi-automatisée grâce au Mini-vidas. Deux éléments sont essentiels dans cette technique : le cône et la cartouche. Le cône est sensibilisé au moment de sa fabrication par des anticorps d’une spécificité définie. La cartouche quant à elle est composée de 10 puits recouverts par une feuille d’aluminium scellée et étiquetée. Le tableau II ci-dessous présente une description générale de la cartouche utilisée par le Mini-vidas. Tableau II : Description générale de la cartouche (Mini-vidas) Puits 1 2-3-4-5 6 7-8 9 10 Réactifs Puits Echantillon Puits vides Conjugué : immunoglobulines monoclonales de souris de spécificité connue marquées à la phosphatase alcaline+ azoture de sodium Tampon de lavage : Phosphate de sodium +azoture de sodium Tampon de lavage : diéthanolamine +azoture de sodium Cuvette de lecture avec substrat : 4-Méthyl-ombelliferyl+diéthanolamine+azoture de sodium Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 32 Un cône à usage unique sert à la fois de phase solide et de système de pipetage. Les autres réactifs de la réaction immunologique sont prêts à l'emploi et pré répartis dans une cartouche. Toutes les étapes du test sont réalisées automatiquement par l'instrument. Elles sont constituées d'une succession de cycle d'aspiration/refoulement du milieu réactionnel. L’échantillon est prélevé dans le cône. Les antigènes (hormones) sont fixés par leurs anticorps spécifiques adsorbés sur le cône. L’échantillon est transféré dans le puits contenant l’anticorps spécifique de l’hormone marqué à la phosphatase alcaline. Des étapes de lavages éliminent les composés non fixés. Enfin, lors de la révélation le substrat, le 4-méthylombelliferyl phosphate est aspiré puis refoulé dans le cône, l’enzyme du conjugué hydrolyse le substrat en 4-méthyl-ombelliferone dont la fluorescence est mesurée à 450 nm (Figure 9). Figure 9: Principe du fonctionnement du Mini-vidas. Mode opératoire En pratique, la réalisation des dosages hormonaux par le Mini-Vidas comprend plusieurs phases distinctes : saisie des identifiants, prélèvement des échantillons, réaction automatique et lecture des résultats. La saisie des identifiants consiste à entrer dans l’appareil les données relatives à chaque échantillon (contrôle, test). La phase suivante réside au prélèvement de 200µl de chaque échantillon et à son introduction dans le puits 1 de chaque cartouche. Les cartouches et les cônes sont placés respectivement dans les blocs à cartouche et à cône de l’appareil. Après une dernière vérification de la concordance entre les données saisies et les échantillons Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 33 présents dans les cartouches, l’analyse automatique est lancée. Les résultats sont affichés par l’appareil après quarante-minutes d’analyse. 2-2-6) Analyses statistiques Les résultats sont présentés sous la forme de moyenne et d’écart-type. Les graphiques sont réalisés par Excel 2010 permettant une meilleure visualisation des résultats. L’analyse des variances des différents groupes a été faite par ANOVA suivi du post hoc test de Tukey pour les comparaisons multiples des moyennes. La significativité des différences est fixée à p<0,05. Les tests statistiques ont été réalisés par le logiciel statistique R 3.2.5 Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 34 ARTICULATION III : RESULTATS Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 35 ARTICULATION III : RESULTATS & DISCUSSION 3-1) Effets de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur l’indice gonadosomatique (IGS) Tableau III : Poids corporel, Poids des testicules et IGS des rats de l’étude Groupes Poids Corporel (g) Poids des Testicules (g) Contrôle (C) Plomb (Pb) Plomb + Vit C(PbV) Plomb + Ail (PbA) Plomb +Ail+Vit C (PbAV) 211,4±8,08 191±5,26 212±7,40 2,80±0,14 2,47±0,13 2,09±0,28 Indice Gonadosomatique (IGS) (%) 1,33±0,08 1,28±0,04 0,99±0,13ab 217±5,70 238,2±12,52 2,76±0,05 2,92±0,19 1,27±0,02c 1,21±0,03c y Dans chaque colonne les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas statistiquement significatives A l’analyse du tableau III, aucune variation significative de l’IGS n’a été notée dans le groupe Pb par rapport au groupe contrôle (p>0,05). Par contre, l’IGS du groupe PbV est inférieur à ceux des groupes C, Pb, PbA et PbAV. Les IGS des groupes PbA et PbAV sont comparables à ceux des groupes Pb et C. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 36 3-2) Effets de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur la qualité des spermatozoïdes 3-2-1) Effets de l’ail, de la vitamine C, et de l’association ail/vitamine C sur la mobilité des spermatozoides 80 70 60 Mobilité(%) bc a ab 50 abcd 40 30 20 10 0 Contrôle (C ) Plomb (Pb) Plomb + Vit C(PbV) Plomb + Ail (PbA) Plomb +Ail+Vit C (PbAV) Groupes Figure 10 : Variation de la mobilité des spermatozoïdes en fonction de l’exposition Dans chaque colonne les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas statistiquement significatives De l’analyse de la figure 10, il ressort que l’intoxication des rats par le nitrate de plomb entraine une diminution significative de la mobilité des spermatozoïdes. En effet, cette mobilité passe de 70,6% ±2,40 dans le groupe C à 61,6% ±2,70 dans le groupe Pb. Le traitement par la vitamine C des rats du groupe PbV provoque une baisse de la mobilité des spermatozoïdes non seulement par rapport au contrôle mais aussi par rapport au groupe Pb. La mobilité des spermatozoïdes des rats intoxiqués au plomb traités par l’extrait aqueux d’ail est plus élevée que celle du groupe Pb. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 37 L’association ail/vitamine C induit une forte chute de la mobilité des spermatozoïdes. Cette mobilité est inférieure à celle des autres groupes de l’étude. 3-2-2) Effets de l’ail, de la vitamine C, et de l’association ail/vitamine C sur la vitalité 80 abc 70 Vitalité(%) 60 a a Plomb (Pb) Plomb + Vit C(PbV) ad 50 40 30 20 10 0 Contrôle (C ) Plomb + Ail (PbA) Plomb +Ail+Vit C (PbAV) Groupes Figure 11 : Variation de la vitalité des spermatozoïdes en fonction de l’exposition Dans chaque colonne les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas statistiquement significatives L’exposition des rats du groupe Pb au plomb entraine une baisse de la vitalité des spermatozoïdes comparativement au groupe contrôle (figure11). La vitalité des spermatozoïdes des rats intoxiqués du groupe PbV est similaire à celle du groupe Pb. Le traitement de l’intoxication par l’extrait aqueux d’ail augmente la vitalité des spermatozoïdes du groupe PbA. Celle-ci passe de 55,8% ±2,70 pour le groupe Pb à 63,6%±2,6 dans le groupe PbA. Toutefois elle est inférieure à celle du groupe contrôle. La vitalité des spermatozoïdes du groupe PbAV est comparable à celle des groupes Pb et PbV mais inférieure à celle des groupes C et PbA. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 38 3-3) Effets de l’ail, de la vitamine C et de l’association ail/vitamine C sur les taux d’hormones sexuelles (FSH, LH, TT) Le tableau IV résume le profil des hormones sexuelles gonado-hypophysaires des rats de l’étude. Tableau IV : Profil des hormones sexuelles chez les rats de l’étude Groupes FSH (mUI/ml) LH (mUI/ml) TT (ng/ml) Contrôle (C) 0,30±0,02 0,25±0,03 1,736±0,04 Plomb (Pb) 0,35 ±0,03 0,26±0,02 0,61±0,05a Plomb + Vit C(PbV) 0,34±0,05 0,32±0,04ab 0,59±0,03a Plomb + Ail (PbA) 0,38±0,01a 0,38±0,03abc 0,77±0,04abc Plomb+Ail+VitC (PbAV) 0,43±0,05abc 0,30±0,02d 0,73±0,03abc Dans chaque colonne les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas statistiquement significatives 3-3-1) Effets de l’ail, de la vitamine C, et de l’association ail/vitamine C sur le taux de FSH Le tableau IV montre que le taux de FSH des rats du groupe Pb est de 0,35 ±0,03 mUI/ml. Ce taux de FSH n’est pas significativement différent de celui du groupe C (0,30 ±0,02 mUI/ml). Le traitement par la vitamine C (0,34 ±0,05 mUI/ml) des rats intoxiqués n’entraine également pas de variation marquée du taux de FSH comparativement aux groupes C (0,30±0,02 mUI/ml) et Pb (0,34±0,05 mUI/ml). L’extrait aqueux d’ail induit une augmentation significative du taux de FSH (0,38 ±0,01 mUI/ml) par rapport au contrôle (0,30±0,02 mUI/ml). Le taux de FSH du groupe PbAV traité par l’ail et la vitamine C (0,43±0,05 mUI/ml) est significativement supérieur à ceux des groupes C, Pb (0,36±0,03 mUI/ml) et PbV (0,34 ±0,05 mUI/ml). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 39 3-3-2) Effets de l’ail, de la vitamine C, et de l’association ail/vitamine C sur le taux de LH Le niveau de LH plasmatique des rats intoxiqués au plomb (Pb) est de 0,26±0,02 mUI/ml (Tableau IV). Ce taux est voisin de celui du groupe contrôle (0,25±0,03 mUI/ml). La vitamine C induit une hausse du niveau de LH (0,32±0,04 mUI/ml) dans le groupe PbV par rapport à ceux des groupes C (0,25±0,01 mUI/ml) et Pb (0,26±0,02 mUI/ml) Le taux de LH du groupe PbA (0,38 ±0,03 mUI/ml) est élevé. Ce taux est supérieur à ceux des groupes C (0,25 ±0,03 mUI/ml), Pb (0,26 ±0,02 mUI/ml) et PbV (0,32 ±0,04 mUI/ml). L’association ail/vitamine C (0,30 ±0,02 mUI/ml) n’induit pas de modification significative du taux de LH par rapport au contrôle (0,25±0,03 mUI/ml). 3-3-3) Effets de l’ail, de la vitamine C, et de l’association ail/vitamine C sur le taux de testostérone L’intoxication des rats du groupe Pb entraine une chute significative du taux de testostérone par rapport au groupe contrôle. En effet le taux de testostérone passe de 1,736 ng/ml ±0,04 pour le groupe contrôle à 0,61 ±0,05 ng/ml pour le groupe Pb. Le traitement de l’intoxication par la vitamine C n’induit pas de variation du taux de testostérone (0,59±0,03 ng/ml) par rapport au groupe Pb. Les traitements par l’extrait aqueux d’ail ou par l’association ail/vitamine ont provoqué une augmentation du taux de testostérone par rapport au groupe Pb. En effet, le taux de testostérone passe de (0,61 ±0,05 ng/ml) dans le groupe Pb à 0,77±0,04 ng/ml et 0,73 ±0,03 ng/ml respectivement dans les groupes PbA et PbAV. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 40 ARTICULATION IV : DISCUSSION Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 41 ARTICULATION IV : DISCUSSION L’exposition environnementale ou professionnelle aux métaux lourds entraine des effets délétères sur le système reproducteur mâle des mammifères, responsables de l’infertilité idiopathique. La présente étude avait pour objectif d’évaluer l’effet protecteur de l’ail et de la vitamine C sur la fonction reproductrice des rats Wistar mâles exposés au nitrate de plomb. Cette évaluation a résidé dans l’appréciation des effets de l’ail, de la vitamine C et de l’association ail/vitamine C sur les paramètres suivants : l’Indice Gonadosomatique (IGS), la qualité des spermatozoïdes et le taux des hormones sexuelles gonado-hypophysaires. Effets de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur l’indice gonadosomatique (IGS) La variation absolue ou relative du poids des organes reproducteurs représente le premier indice qui permet d’identifier une substance comme potentiellement toxique pour le système reproducteur (Zenick et al., 1994). Au cours de nos travaux, l’intoxication des rats par le nitrate de plomb n’a pas provoqué de variation significative de l’indice gonadosomatique. Ramah et al. (2015), Asadpour et al. (2013) et Ronis et al. (1998) avaient aussi observé un pareil constat. La présence de la barrière hémato-testiculaire protégeant les cellules germinales de l’épithélium des tubules séminifères contre la pénétration des sels de métaux expliquerait ce constat (Ramah et al., 2015). Par ailleurs, la durée de l’expérimentation (28 jours) pourrait également expliquer l’absence d’effet de l’intoxication au nitrate de plomb sur l’IGS (Hachfi et al., 2008). Le traitement des rats intoxiqués au plomb par la vitamine C a entrainé une baisse significative de l’IGS. Cette baisse de l’IGS serait liée à la diminution de la masse des cellules germinales en raison du stress oxydant induit par les fortes doses de vitamine C (Abel et al., 1983) Les traitements de l’exposition au nitrate de plomb par l’ail et l’association ail/vitamine C n’ont pas eu d’incidence significative sur le poids relatif des testicules. Asadpour et al. (2013) au cours de leurs travaux avaient montré que l’administration des Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 42 extraits aqueux d’ail n’affecte pas l’indice gonadosomatique des rats mâles intoxiqués à l’acétate de plomb. Effets de l’ail, de la vitamine C et de l’association ail/vitamine C sur la qualité des spermatozoïdes Cette étude a prouvé que le nitrate de plomb entraine une diminution significative de la mobilité et de la vitalité des spermatozoïdes chez les rats mâles intoxiqués. Ces résultats concordent avec ceux de Ramah et al. (2015), Asadpour et al. (2013), Ayindé et al. (2012) qui ont également observé l’action néfaste du plomb sur la qualité des spermatozoïdes. Le plomb baisse la mobilité et la vitalité des spermatozoïdes en induisant le stress oxydant probablement dans l’épididyme (Ramah et al., 2015). Ce stress favorise la production du peroxyde d’hydrogène (H202) qui diffuse à travers les membranes. Cette espèce réactive d’oxygène (ERO) provoque l’inhibition d’enzymes essentiels à la survie des spermatozoïdes avec pour conséquence la diminution de leur mobilité et de leur vitalité (Asadpour et al., 2013). La mobilité des spermatozoïdes du groupe traité par la vitamine C est significativement réduite par rapport à celle du groupe exposé uniquement au plomb. Cette diminution de la mobilité des spermatozoïdes serait due à l’aggravation du stress oxydant causée par l’action du plomb et de la vitamine C à la dose de l’étude. En revanche, Ayindé et al. (2012) ont observé que la vitamine C induit une augmentation de la mobilité des spermatozoïdes chez les rats intoxiqués au plomb. Cette discordance des conclusions serait liée à la différence des doses de vitamine C utilisées. Le traitement à l’ail des rats intoxiqués induit une augmentation partielle de la mobilité et de la vitalité des spermatozoïdes. Ce résultat est en accord avec ceux d’Ayoka et al. (2016) et d’Adsapour et al. (2013). Ce constat souligne la possible activité de l’extrait aqueux d’ail qui agirait en stimulant l’activité des enzymes antioxydants et en diminuant la peroxydation lipidique dans les testicules (Omurtag et al., 2005). L’association ail/vitamine C entraine une baisse de la mobilité des spermatozoïdes par rapport au groupe exposé uniquement au plomb. Cette association ail/vitamine C a un effet délétère sur la mobilité des spermatozoïdes. Ce constat peut s’expliquer par l’effet paradoxal des antioxydants qui pour des doses élevées démontrent plutôt un effet pro-oxydant (Favier, 2003). Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 43 Effets de l’extrait aqueux d’ail, de la vitamine C et de l’association ail/vitamine C sur les taux des hormones sexuelles gonado-hypophysaire. L’intoxication des rats par le nitrate de plomb n’a pas induit de modification significative du taux de FSH et de LH. Concernant l’influence du plomb sur les taux de LH, Riaz et al. (2011), Hachfi et al. (2008) avaient obtenus des résultats similaires. Contrairement à ces résultats, Taiwo et al (2010) avaient mis en évidence que le plomb provoque une baisse du taux de LH. Aussi, Hachfi et al. (2008), Pinon-Lataillade et al. (1995) avaient-ils observé que l’exposition au plomb n’influe pas sur le niveau de FSH respectivement chez les rats et souris. Tandis que Daku et al. (2016) ont remarqué plutôt une baisse du taux de FSH. Ces différences seraient liées aux doses de plomb administrées, à la durée d’exposition et à la voie d’exposition (Vigeh et al., 2011). L’administration de la vitamine C aux rats ne provoque pas de variation du niveau de FSH chez les rats traités. Toutefois, elle induit une hausse du taux de LH. L’induction de la sécrétion de LH mais aussi de la FSH par la vitamine C a été observée au cours des travaux de Fernandes et al. (2011). Cet effet de la vitamine C s’expliquerait par son rôle de neurotransmetteur vitaminergique stimulant la libération de LH et de FSH par l’adénohypophyse (Karanth et al., 2001). Le traitement des rats par l’ail a induit une augmentation de la sécrétion de LH et de FSH dans les groupes traités après intoxication au plomb. Ce résultat concorde avec celui d’Ayoka et al (2016). Aussi, Hammami en 2008, avaient-ils constaté une augmentation de la sécrétion de LH chez les rats mâles après une consommation chronique d’ail frais ajouté à leurs menus. L’’association ail/vitamine C entraine la hausse taux de FSH tout en ayant pas d’effet sur le niveau de la LH. L’exposition des rats au plomb a provoqué une significative diminution du taux de testostérone. Ce constat confirme celui de Daku et al. (2016) et d’Ayindé et al. (2012). Cette action du plomb suggère que le plomb exerce principalement sa toxicité au niveau testiculaire. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 44 L’extrait aqueux d’ail et l’association ail/vitamine C ont induit une élévation partielle du taux de testostérone en comparaison avec le groupe contrôle. Ayoka et al. (2016), Asadpour et al. (2013) ont également observé que l’extrait aqueux d’ail provoque une restauration partielle du niveau de testostérone chez les rats préalablement exposés au plomb. Cet effet positif de l’extrait aqueux d’ail sur le taux de testostérone serait liée à la présence de composés antioxydants tels que les flavonoïdes, les tannins et les composés soufrés (Ayoka et al., 2016). En résumé au cours de ces travaux, nous avons montré chez les rats exposés au nitrate de plomb que l’ail a une influence positive sur la qualité des spermatozoïdes et les paramètres hormonaux. Par ailleurs, la vitamine C a montré des effets délétères sur la qualité des spermatozoïdes tandis que l’effet associatif de la vitamine C et de l’ail sur les paramètres spermatiques et hormonaux est mitigé. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 45 CONCLUSION ET b SUGGESTIONS Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 46 CONCLUSION ET SUGGESTIONS Cette étude avait pour but de caractériser les effets protecteurs de l’ail et de la vitamine C sur la fonction reproductrice des rats mâles exposés au nitrate de plomb. Plusieurs hypothèses ont orienté la réalisation de ces travaux. La première postulait que l’ail, la vitamine C et l’association ail/vitamine C augmentent l’indice gonadosomatique (IGS). Les résultats de nos travaux ont montré qu’aucun des traitements n’augmentent l’IGS. Ainsi on déduit que cette première hypothèse n’est pas vérifiée. La seconde hypothèse de l’étude affirme que l’ail, la vitamine C et l’association ail/vitamine C préservent la qualité des spermatozoïdes. De nos résultats, il est a observé que seul le traitement par l’ail a préservé la qualité des spermatozoïdes. Cette hypothèse est donc partiellement confirmée. Enfin, la troisième hypothèse de nos travaux affirme que les traitements par l’ail, la vitamine C et l’association ail/vitamine C restaurent les niveaux des hormones sexuelles. Globalement, compte tenu des résultats qui se dégagent de nos travaux, les traitements par l’ail et l’association ail/vitamine C ont restauré le taux de testostérone. Ces résultats confirment donc partiellement notre hypothèse. Ces travaux ont rencontré lors de leur réalisation plusieurs difficultés en occurrence le manque de matériel technique (cellule de Neubauer, microscope muni d’appareil photographique etc…) et de moyens financiers. En perspective, et dans le désir d’approfondir cette recherche, il serait judicieux de prolonger la durée d’exposition au plomb (03 mois), de doser le plomb dans le sang, les testicules ou dans d’autres organes reproducteurs, d’évaluer l’influence du plomb sur les systèmes antioxydants et d’autres paramètres spermatiques (concentration des spermatozoïdes, morphologie). En outre, il sera nécessaire d’évaluer l’impact du plomb sur les testicules, l’axe hypothalamo-hypophysaire et d’objectiver l’effet protecteur de l’ail sur des coupes histologiques de cet organe. Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 47 REFERENCES Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 48 1- Abdel-Fattah AF., Edrees M., (1972). A study on the composition of garlic skins and the structural features of the isolated pectic acid. Journal of the Science of Food and Agriculture; 23: 871-877. 2- Abel BJ., Carswell G., Elton R., (1983). Randomised trial of clomiphene citrate treatment and vitamin C for male infertility. 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Gérard Page 55 TABLE DES MATIERES REMERCIEMENTS ............................................................................................................ 2 ACRONYMES, SIGLES ET ABREVIATIONS ................................................................. 3 Liste des Figures ................................................................................................................... 4 Liste des Tableaux ................................................................................................................ 5 RESUME .............................................................................................................................. 6 INTRODUCTION ................................................................................................................ 8 OBJECTIF PRINCIPAL ....................................................................................... 11 OBJECTIFS SPECIFIQUES.................................................................................. 11 ARTICULATION I RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES : ............................................... 12 1) Organisation et fonctions de l’appareil reproducteur chez le rat mâle ............................ 13 1-1) Les testicules ................................................................................................................ 14 1-2) Les organes génitaux annexes ...................................................................................... 14 1-3) Régulation des fonctions testiculaires .......................................................................... 15 2) Impact des métaux lourds sur la santé reproductrice du mâle .......................................... 18 Cas du plomb........................................................................................................ 11 3) Stress oxydant, infertilité idiopathique et antioxydants ................................................... 21 3-1) La vitamine C ............................................................................................................... 23 3-2) Allium sativum............................................................................................................. 24 ARTICULATION II : MATERIEL ET METHODES ...................................................... 26 2-1) Matériel ........................................................................................................................ 27 2-1-1) Cadre .................................................................................................................. 27 2-1-2) Matériel biologique ............................................................................................ 27 2-1-3) Matériel technique .............................................................................................. 28 2-2) Méthodes ...................................................................................................................... 28 2-2-1) Préparation de l’extrait aqueux d’Allium sativum ............................................. 29 2-2-2) Préparation de la solution de vitamine C............................................................ 29 2-2-3) Détermination de l’effet de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur l’indice gonadosomatique ................................................................ 30 Caractérisation de l’IGS ................................................................................................ 30 2-2-4) Analyse de l’influence de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur la qualité des spermatozoïdes ............................................................................. 30 Préparation de la suspension de spermatozoides......................................................... 30 Réalisé par DOSSOU AGOIN B. Gérard Page 56 2-2-4-1) Détermination de la mobilité des spermatozoïdes....................................... 31 2-2-4-2) Viabilité des spermatozoïdes ....................................................................... 31 2-2-5) Caractérisation de l’effet de l’ail, de la vitamine C et de l’association ail/vitamine C sur les taux de sécrétion des hormones sexuelles .................................. 31 Principe du dosage ........................................................................................................ 32 Mode opératoire ........................................................................................................... 33 2-2-6) Analyses statistiques .......................................................................................... 34 ARTICULATION III : RESULTATS ............................................................................... 36 3-1) Effets de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur l’indice gonadosomatique (IGS) ....................................................................................................... 36 3-2) Effets de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur la qualité des spermatozoïdes .................................................................................................................... 37 3-2-1) Effets de l’ail, de la vitamine C, et de l’association ail/vitamine C sur la mobilité.......................................................................................................................... 37 3-2-2) Effets de l’ail, de la vitamine C, et de l’association ail/vitamine C sur la vitalité ....................................................................................................................................... 38 3-3) Effets de l’ail, de la vitamine C et de l’association ail/vitamine C sur les taux d’hormones sexuelles (FSH, LH, TT) ................................................................................. 39 3-3-1) Effets de l’ail, de la vitamine C, et de l’association ail/vitamine C sur le taux de FSH................................................................................................................................ 39 3-3-2) Effets de l’ail, de la vitamine C, et de l’association ail/vitamine C sur le taux de LH.................................................................................................................................. 40 3-3-3) Effets de l’ail, de la vitamine C, et de l’association ail/vitamine C sur le taux de testostérone .................................................................................................................... 40 ARTICULATION IV : DISCUSSION .............................................................................. 42 Effets de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur l’indice gonadosomatique (IGS) ......................................................................................... 42 Effets de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur la qualité des spermatozoides ................................................................................................ 33 Effets de l’ail, de la vitamine C et de l‘association ail/vitamine C sur les niveaux des hormoes sexuelles ........................................................................................... 33 CONCLUSION ET SUGGESTIONS ................................................................................ 47 REFERENCES ................................................................................................................... 47 Réalisé par DOSSOU AGOIN B. 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