REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIREUNIVERSITE ECHAHID HAMMA LAKHDAR D’EL-OUED FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE DEPARTEMENT DE BIOLOGIE Spécialité : Biodiversité et physiologie Végétale Module: biotechnologie et substances Naturelles végétales Productin de l'insuline par géné génétique Présent par: Meftah wafa Toaba samiha Derigé par : HAMADA.S Plan de travail I. Introduction II. Définition III.L’origine IV. Le role de l'insuline dans le corps humain V. Biologie de l’insuline VI. Fabrication au sein du corps humain (biosynthèse) VII.Fabrication artificielle VIII.Production de l'hormone insuline humaine par E.coli IX. Conclusion Inroduction L'être humain produit dans son corps une substance, l'insuline, qui lui permet de réguler la quantité de sucre dans son sang. Pour cela, il dispose d'un gène, qui "explique" à son corps comment faire cette insuline. Chez certaines personnes, ce gène ne fonctionne pas correctement : ces personnes ne fabriquent donc pas d'insuline, et deviennent malades : c'est ce que l'on appelle le diabète. On peut facilement soigner les diabétiques : il suffit de leur faire une piqûre d'insuline. Le problème, c'est que seule l'insuline fabriquée par les êtreshumains marche. Alors comment faire? On ne peut pas élever des êtres humains pour leur prendre leur insuline afin de soigner les diabétiques, bien sur.. Avec la transgénèse, c'est assez facile , chez l'homme, le gène qui lui permet de fabriquer de l'insuline, et je le mets dans une bactérie. Ensuite, je n'ai plus qu'à cultiver les nouvelles bactéries transgéniques ainsi obtenues : grâce au gène humain que je leur ai injecté, ces bactéries sont devenues capables, exactement comme l'homme, de fabriquer de l'insuline humaine! Il n'y a plus qu’à la récupérer pour soigner les malades. » Définition de l'insuline L'insuline est une hormone polypeptidique produite dans certaines cellules du pancréas de tout être humain sain (cellules appelées îlots de Langerhans), est responsable du taux de sucre sanguin Origine C'est une hormone synthétisée par les cellules bêta du pancréas . Elle est en fait sécrétée dans ces cellules sous forme de pro-insuline, c'est à dire une forme inactive qui est destinée seulement à être stockée dès sa synthèse et utilisée seulement quand cela est nécessaire. Dès que l'insuline est sollicitée dans l'organisme, la proinsuline se transforme dans la cellule en une petite protéine appelée peptide C, et en insuline. C'est elle qui nous intéresse. L'insuline active est donc à ce moment libérée dans le sang et va se fixer sur des récepteurs des cellules du foie, des muscles, et du tissu adipeux (la graisse). La fixation sur ces récepteurs active immédiatement la partie du métabolisme des glucides que l'insuline contrôle LE ROLE DE L'INSULINE DANS LE CORPS HUMAIN L’insuline possède des rôles multiples et complexes. Son rôle primordial est la régulation de la glycémie si elle vient à manquer c’est le diabète et toutes ces complications qui apparaissent. L’insuline possède avant toute chose un rôle hypoglycémiant c'est-à-dire qu’elle fait baisser le taux de sucre dans le sang, même si cette action est primordiale elle en possède bien d’autres toutes plus importantes les une que les autres. Le transport du glucose dans les cellules se fait au moyen de transporteurs, certains comme ceux du cerveau et du foie (organes qui nécessitent une consommation constante de glucose) ne sont pas contrôlés par l’insuline. Mais les muscles et les tissus adipeux (amas de cellules graisseuses) possèdent des transporteurs contrôlés par l’insuline s'il y a une carence en insuline, il y a hyperglycémie par conséquent le glucose ne peut pas pénétrer dans les cellules hépatiques et musculaires. L’insuline stimule l’activation des enzyme (protéine accélérant les réactions chimiques au sein du corps humain) nécessaires à l’assimilation du glucose dans les cellules et de la production d’énergie (glycolyse). Elle stimule également la glycogenogenèse, qui est la synthèse du glycogène dans le foie et les muscles, le glycogène permet de stocker le glucose. Biologie de l’insuline (Structure) C'est en 1955 que Sanger découvre la structure moléculaire de l'insuline. Celui ci a constaté qu'elle était : constituée de deux chaînes polypeptidiques A et B reliées par deux ponts disulfures et un autre intrachaîne A. La chaîne A possède vingt-et-un acides aminés tandis que la chaine B en contient trente Ponts disulfures inter brins lient A7-B7 et A20-B19 Le pont disulfure intra chaîne A lie A6-A11 2 hélice α sur la chaine A et 1 autre sur la B structurent l’insuline dans l’espace. La proline B28 sert à la stabilisation de l’hexamère L’asparagine en A21 est essentielle à l’activité biologique La chaîne A a un caractère acide et la chaîne B a un caractère neutre Sa formule chimique est : C257H383N6577S6 Fabrication au sein du corps humain (biosynthèse) Le gène de l’insuline se trouve sur le Chromosome 11 humain Synthèse dans le réticulum endoplasmique de la préproinsuline (107 AA) Toujours dans le RE, élimination du « signal peptide » N-terminal (23 AA) pour former la Proinsuline (84 AA en une seule chaîne enroulée). A ce moment apparait le pliage et la formation des ponts disulfures, puis elle est transportée vers l’appareil de Golgi élimination du Peptide C qui se trouve au milieu de la chaîne de la proinsuline (33 AA, Connecting peptide), reliant la partie C-terminale de la chaîne B à la partie N-terminale de la chaîne A. L’insuline (51 AA) restante est excrétée avec le peptide C la sécrétion de l’insuline se fait sous forme de monomère (forme active) Le peptide C a une demivie plus longue que celle de l’insuline (=quelques minutes donc reste plus longtemps dans le sang), il n’a aucun rôle thérapeutique mais est utilisé pour doser l’insuline L’insuline est stockée sous forme d’hexamère ou plutôt 3 dimères autour d’un atome de zinc (grâce à la présence d’histidines) dans les granules de sécrétion des cellules β des ilots de Langherans. FABRICATION ARTIFICIELLE Insuline animale. Dans les années 80, l’insuline utilisée pour soigner le diabète était porcine ou bovine, en effet pour cela, l’on abattait les animaux et l’on prélevait le pancréas pour en extraire l’insuline. Mais cette insuline de porc est différente d’un acide aminé par rapport à l’insuline humaine et celle du bœuf, elle, diffère de trois acides aminés par rapport à notre insuline ! Pour que cette insuline animale soit utilisable pour l’homme sans risque de rejet elle doit être purifiée le plus possible. Cette purification est effectuée grâce à un procédé appelé chromatographie, dans ce cas présent elle consiste à séparer l’insuline utilisable par l’homme et d’autres substances non appropriées pour l’homme. Quand cette insuline n’est pas assez purifiée, lors de son utilisation le corps humain cherchera à se « défendre » contre cette insuline et sécrètera alors des anticorps destinés à supprimer cette hormone extérieure. Cette insuline animale n’était pas une solution durable pour lutter contre le diabète car elle nécessitait une purification et comportait des risques de rejet. Les scientifiques ont longuement travaillé sur une autre manière de fabriquer de l’insuline utilisable par les diabétiques. Actuellement synthèse uniquement par génie génétique, avec 2 type de production : production séparée des chaînes A et B puis assemblage ou production de la pro-insuline puis élimination du peptide C. Les souches productrices : peuvent être des levures : Saccharomyces cerevisiae (labo Novo Nordisk) ou des bactéries : Escherichia coli (labos Lilly et Aventis). E.coli Saccharomyces cerevisiae Procaryote Bacille à Gram - Eucaryote Avantages - Procaryote le plus connu sa génétique est très bien connue. De nombreux vecteurs plasmidiques ont été construits et sont donc disponibles afin d'insérer et d'exprimer un gène étranger au sein de la bactérie. Elle est par ailleurs facile à utiliser, se prête très bien à la culture de masse en fermenteur. Enfin, les taux d'expression obtenus sont élevés, c'est-à-dire qu'elle permet de produire des quantités appréciables de protéines (jusqu'à plusieurs grammes par litre) son matériel génétique est simple et elle ne présente aucune toxicité. Bons vecteurs d'expression disponibles aujourd'hui. Les taux d'expression des protéines sont relativement bons (de l'ordre de la centaine de milligrammes par litre). La levure est capable de fabriquer des protéines complexes et de réaliser des modifications post-traductionnelles (glycosylations simples, carboxylations, acylations...). - Assure la maturation des ARNm et des protéines - Facile à cultiver. E.coli Saccharomyces cerevisiae Procaryote Bacille à Gram - Eucaryote Inconvénients sécrétant mal les protéines, il est souvent nécessaire de "casser" la bactérie afin de récupérer la protéine (ce qui induit des problèmes de purification, ou de solubilisation et de renaturation..., quelquefois au détriment des rendements). E. coli n'effectue pas les modifications posttraductionnelles des protéines (en particulier la glycosylation, la carboxylation, etc.), qui constituent souvent une condition sine qua non d'activité de la protéine. Enfin E. coli étant une entérobactérie, il est donc nécessaire de s'assurer de l'absence d'endotoxines dans les protéines purifiées. Plasmides instables Pas de réplication pour la plupart des plasmides procaryotes les protéines synthétisées sont souvent obtenues à l'intérieur du cytoplasme et nécessitent de casser la cellule afin de les récupérer. La sécrétion est possible, mais en général au détriment des rendements : elle fonctionne bien pour des petits polypeptides tels que l'insuline, mais beaucoup moins bien pour de grandes protéines. Bioinformatique de l'hormone insuline humaine par E.coli La synthèse de l'insuline par E.coli fournit les trois facteurs suivants: Préparation du gène de l'insuline représenté dans la partie d'ADN portant le plan d'installation de l'insuline Préparation de cellules bactérienne E.coli comme lieu vital pour le travail des gènes La préparation du vecteur porteur du gène de l'insuline est constituée des plasmides trouvés dans les cellules bactérienne L’idée de mettre en œuvre ces techniques dépend des grandes étapes suivantes: Préparation de la reformulation de l'ADN en intégrant le gène insuline avec le support L’introduction d’ADN redessiné dans les cellules bactériennes E.coli et dissolvante de gène insuline optimisation de la culture de la souche sélectionnée purification de l’insuline humaine produite تحضير الخلية البكتيرية كمقر حيوي لعمل جين األنسولين تحضير البالسميد دمج مورثة األنسولين في البالسميد البكتيري ادخال DNAمعاد الصياغة ضمن الخلية البكتيرية عزل النسائل البكتيرية الحاوية على بالسميدات معادة الصياغة اإلكثار من النسائل المرغوبة تنقية األنسولين المنتج صياغة األنسولين التجاري Préparation de l'ADN recyclé: Les plasmides sont isolés du type de Un gène d'insuline humaine est vecteur d'expression à partir de synthétisé par sa structure cellules E.coli ; puis les gènes de la chimique, où les deux segments série A ou B sont traités avec distincts de l'ADN codé des séries l'enzyme de coupe interne spécifiée. A et B sont synthétisés. Ajoutez à Cette enzyme ouvre l'anneau ADN en chaque gène un lien fabriqué un point spécifique d'une pièce de contenant l’emplacement de la monnaie située dans l'enzyme coupe interne spécifiée. ß.galactosidase . La forme plasmidique devient linéaire dans deux endothéliums. En même temps, sous l'effet de l'enzyme de coupe interne spécifique, la chaîne A ou la série B est extraite des nucléotides. Peut se lier au plasmide au niveau du trou qui lui est appliqué . Le plasmide ouvert est lié à la série A ou B sous l’activité ADN de la ligase. Nous obtenons un ADN modifié codant pour cette dernière pour une protéine de combinaison composée de l'enzyme ß.galactosidase et de la chaîne synthétique A ou B selon le cas. Cet ADN est réécrit dans les cellules E.coli La culture : Les neutrophiles bactériens contenant les plasmides sont isolés et replantés. Les bactéries vont être mises ensuite dans un petit bioréacteur appelé fermenteur. Sous la présence de solution nutritive elles vont se multiplier très rapidement de manière exponentielle. Puisque une bactérie se divise toutes les 20 minutes cela fait un total d’environ 4.7×1021 bactéries en 24 heures. Fermentation : C’est durant cette période que les bactéries vont produire de l’insuline. Les personnes chargées de la production vont également s’occuper de transférer les bactéries dans des cuves (les fermenteurs) toujours plus volumineux. Cependant plus le fermenteur est grand, plus il devient difficile de maintenir des conditions idéales, (la température, le taux de sucre) de manière égale dans l’ensemble de la cuve. Purification : Une fois la phase de fermentation terminés, il faut récupérer le produit fabriqué par la bactérie. Pour ce faire il faut séparer à l’aide d’une centrifugeuse l’insuline de la bactérie. Les bactéries vont être détruites à l’aide d’un produit désinfectant. Juste après on procède à un clivage enzymatique où l’insuline va pouvoir être concentrée. Suite à quoi on va purifier le produit via un processus de chromatographie à échange d’ion pour finir par une dia filtration ou une ultrafiltration. Principe d'expérience L'insuline génétiquement modifiée a d'abord été synthétisée par l'expression séparée des chaînes A et B(insulineß.galactosidase) En raison de son caractère exotique, la cellule bactérienne génère une sensibilité à laquelle on peut associer en équilibrant la persistance de la synthèse avec son induction immunitaire. Cela se fait en soustrayant (insulineß.galactosidase) au centre de l'implant cette dernière étant traitée avec du CNBr (bromure Cyanogen), qui décompose la liaison peptidique après la méthionine Il a été ajouté intentionnellement aux chaînes A et B pour permettre la séparation les chaînes de ß.galactosidase. Puisque ß.galactosidase contient d'autres acides aminés de méthionine, cette dernière se décompose en petits morceaux Les chaînes A et B restent intactes Formulation : Les chaînes A et B sont mélangées et rebranchées dans une réaction qui forme les ponts croisés du bisulfure, ayant pour résultat une insuline humaine synthétique et pure. Du zinc est ajouté afin de fournir les conditions d’activation et de cristallisation de l’hormone, nous obtenons ainsi de l’insuline commerciale sous forme de cristallisé. Une série de tests sont effectués sur des animaux perturbés par la préparation précédente, afin de prouver leur efficacité. Des tests humains sont également en cours L'hormone est ensuite utilisée dans des flacons spéciaux multidoses conclusion Le diabète de type 1 est dû à la destruction de cellules du pancréas endocrine qui produisent une hormone polypeptidique hypoglycémiante : l’insuline. Les personnes atteintes de diabète, et présentant un défaut de production d’insuline, doivent recourir à des injections de cette hormone pour réguler leur glycémie. Historiquement, l’insuline utilisée en thérapeutique a d’abord été extraite de pancréas de porc et de boeuf. La demande de plus en plus importante d’insuline au niveau mondial et le risque sanitaire associé à l’utilisation de produits animaux ont conduit à mettre en place des techniques de production d’insuline par génie génétique. L’insuline humaine est maintenant produite à partir de souches bactériennes d’Escherichia coli transformées par un plasmide recombinant contenant le gène codant le précurseur de l’insuline
