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fabrication l'insuline

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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIREUNIVERSITE
ECHAHID HAMMA LAKHDAR D’EL-OUED
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
Spécialité : Biodiversité et physiologie Végétale
Module: biotechnologie et substances Naturelles végétales
Productin de l'insuline par
géné génétique
Présent par:
Meftah wafa
Toaba samiha
Derigé par :
HAMADA.S
Plan de travail
I. Introduction
II. Définition
III.L’origine
IV. Le role de l'insuline dans le corps humain
V. Biologie de l’insuline
VI. Fabrication au sein du corps humain (biosynthèse)
VII.Fabrication artificielle
VIII.Production de l'hormone insuline humaine par E.coli
IX. Conclusion
Inroduction
L'être humain produit dans son corps une substance, l'insuline, qui lui permet de réguler la
quantité de sucre dans son sang. Pour cela, il dispose d'un gène, qui "explique" à son corps comment
faire cette insuline. Chez certaines personnes, ce gène ne fonctionne pas correctement : ces personnes
ne fabriquent donc pas d'insuline, et deviennent malades : c'est ce que l'on appelle le diabète.
On peut facilement soigner les diabétiques : il suffit de leur faire une piqûre d'insuline.
Le problème, c'est que seule l'insuline fabriquée par les êtreshumains marche. Alors comment faire?
On ne peut pas élever des êtres humains pour leur prendre leur insuline afin de soigner les diabétiques,
bien sur..
Avec la transgénèse, c'est assez facile , chez l'homme, le gène qui lui permet de fabriquer de l'insuline,
et je le mets dans une bactérie. Ensuite, je n'ai plus qu'à cultiver les nouvelles bactéries transgéniques
ainsi obtenues : grâce au gène humain que je leur ai injecté, ces bactéries sont devenues capables,
exactement comme l'homme, de fabriquer de l'insuline humaine! Il n'y a plus qu’à la récupérer pour
soigner les malades. »
Définition de l'insuline

L'insuline est une hormone polypeptidique produite dans
certaines cellules du pancréas de tout être humain sain
(cellules appelées îlots de Langerhans), est responsable du
taux de sucre sanguin
Origine
C'est une hormone synthétisée par les cellules bêta du pancréas . Elle est en fait
sécrétée dans ces cellules sous forme de pro-insuline, c'est à dire une forme inactive
qui est destinée seulement à être stockée dès sa synthèse et utilisée seulement
quand cela est nécessaire. Dès que l'insuline est sollicitée dans l'organisme, la proinsuline se transforme dans la cellule en une petite protéine appelée peptide C, et en
insuline. C'est elle qui nous intéresse.
L'insuline active est donc à ce moment libérée dans le sang et va se fixer sur des
récepteurs des cellules du foie, des muscles, et du tissu adipeux (la graisse).
La fixation sur ces récepteurs active immédiatement la partie du métabolisme des
glucides que l'insuline contrôle
LE ROLE DE L'INSULINE DANS LE
CORPS HUMAIN
L’insuline possède des rôles multiples et complexes. Son rôle primordial est la régulation de
la glycémie si elle vient à manquer c’est le diabète et toutes ces complications qui
apparaissent.
L’insuline possède avant toute chose un rôle hypoglycémiant c'est-à-dire qu’elle fait baisser
le taux de sucre dans le sang, même si cette action est primordiale elle en possède bien
d’autres toutes plus importantes les une que les autres. Le transport du glucose dans les
cellules se fait au moyen de transporteurs, certains comme ceux du cerveau et du foie
(organes qui nécessitent une consommation constante de glucose) ne sont pas contrôlés par
l’insuline. Mais les muscles et les tissus adipeux (amas de cellules graisseuses) possèdent des
transporteurs contrôlés par l’insuline s'il y a une carence en insuline, il y a hyperglycémie par
conséquent le glucose ne peut pas pénétrer dans les cellules hépatiques et musculaires.
L’insuline stimule l’activation des
enzyme (protéine accélérant les
réactions chimiques au sein du corps
humain) nécessaires à l’assimilation du
glucose dans les cellules et de la
production d’énergie (glycolyse).
Elle stimule également
la glycogenogenèse, qui est la synthèse
du glycogène dans le foie et les
muscles, le glycogène permet de
stocker le glucose.
Biologie de l’insuline (Structure)




C'est en 1955 que Sanger découvre
la structure moléculaire de l'insuline.
Celui ci a constaté qu'elle était :
constituée de deux chaînes
polypeptidiques A et B
reliées par deux ponts disulfures et
un autre intrachaîne A.
La chaîne A possède vingt-et-un
acides aminés tandis que la chaine B
en contient trente
 Ponts disulfures inter brins lient
A7-B7 et A20-B19
 Le pont disulfure intra chaîne
A lie A6-A11
 2 hélice α sur la chaine A et 1
autre sur la B structurent
l’insuline dans l’espace.
 La proline B28 sert à la
stabilisation de l’hexamère
 L’asparagine en A21 est
essentielle à l’activité biologique
 La chaîne A a un caractère
acide et la chaîne B a un
caractère neutre
 Sa formule chimique est
: C257H383N6577S6
Fabrication au sein du corps humain
(biosynthèse)


Le gène de l’insuline
se trouve sur le
Chromosome 11
humain
Synthèse dans le
réticulum
endoplasmique de la
préproinsuline (107
AA)


Toujours dans le RE, élimination du «
signal peptide » N-terminal (23 AA)
pour former la Proinsuline (84 AA
en une seule chaîne enroulée). A ce
moment apparait le pliage et la
formation des ponts disulfures,
puis elle est transportée vers
l’appareil de Golgi
élimination du Peptide C qui se
trouve au milieu de la chaîne de la
proinsuline (33 AA, Connecting
peptide), reliant la partie C-terminale
de la chaîne B à la partie N-terminale
de la chaîne A. L’insuline (51 AA)
restante est excrétée avec le peptide
C


la sécrétion de l’insuline se
fait sous forme de
monomère (forme active)
Le peptide C a une demivie plus longue que celle
de l’insuline (=quelques
minutes donc reste plus
longtemps dans le sang), il
n’a aucun rôle
thérapeutique mais est
utilisé pour doser l’insuline

L’insuline est stockée sous
forme d’hexamère ou
plutôt 3 dimères autour
d’un atome de zinc (grâce à la
présence d’histidines) dans
les granules de sécrétion des
cellules β des ilots de
Langherans.
FABRICATION ARTIFICIELLE
Insuline animale.
Dans les années 80, l’insuline utilisée pour soigner le diabète était porcine ou bovine, en effet
pour cela, l’on abattait les animaux et l’on prélevait le pancréas pour en extraire l’insuline. Mais cette
insuline de porc est différente d’un acide aminé par rapport à l’insuline humaine et celle du bœuf,
elle, diffère de trois acides aminés par rapport à notre insuline !
Pour que cette insuline animale soit utilisable pour l’homme sans risque de rejet elle doit
être purifiée le plus possible. Cette purification est effectuée grâce à un procédé appelé
chromatographie,
dans ce cas présent elle consiste à séparer l’insuline utilisable par l’homme et d’autres
substances non appropriées pour l’homme. Quand cette insuline n’est pas assez purifiée, lors de
son utilisation le corps humain cherchera à se « défendre » contre cette insuline et sécrètera alors des
anticorps destinés à supprimer cette hormone extérieure.


Cette insuline animale n’était pas une solution durable pour lutter
contre le diabète car elle nécessitait une purification et comportait
des risques de rejet. Les scientifiques ont longuement travaillé sur une
autre manière de fabriquer de l’insuline utilisable par les diabétiques.
Actuellement synthèse uniquement par génie génétique, avec 2 type
de production : production séparée des chaînes A et B puis
assemblage ou production de la pro-insuline puis élimination du
peptide C. Les souches productrices : peuvent être des levures :
Saccharomyces cerevisiae (labo Novo Nordisk) ou des bactéries :
Escherichia coli (labos Lilly et Aventis).
E.coli
Saccharomyces cerevisiae
Procaryote
Bacille à Gram -
Eucaryote
Avantages
- Procaryote le plus connu
sa génétique est très bien connue.
De nombreux vecteurs plasmidiques ont été
construits et sont donc disponibles afin d'insérer et
d'exprimer un gène étranger au sein de la bactérie.
Elle est par ailleurs facile à utiliser, se prête
très bien à la culture de masse en fermenteur.
Enfin, les taux d'expression obtenus
sont élevés, c'est-à-dire qu'elle permet de produire
des quantités appréciables de
protéines (jusqu'à plusieurs grammes par litre)
son matériel génétique est simple et elle ne présente
aucune toxicité.
Bons vecteurs d'expression disponibles aujourd'hui.
Les taux d'expression des protéines sont relativement bons
(de l'ordre de la centaine de milligrammes par
litre).
La levure est capable de fabriquer des protéines complexes
et de réaliser des
modifications post-traductionnelles (glycosylations simples,
carboxylations,
acylations...).
- Assure la maturation des ARNm et des protéines
- Facile à cultiver.
E.coli
Saccharomyces cerevisiae
Procaryote
Bacille à Gram -
Eucaryote
Inconvénients
 sécrétant mal les protéines, il est souvent
nécessaire de "casser" la bactérie afin de
récupérer la protéine (ce qui induit des
problèmes de purification, ou de solubilisation et
de renaturation..., quelquefois au détriment des
rendements).
 E. coli n'effectue pas les modifications posttraductionnelles des protéines (en particulier la
glycosylation, la carboxylation,
etc.), qui constituent souvent une condition sine
qua non d'activité de la protéine.
 Enfin E. coli étant une entérobactérie, il est donc
nécessaire de s'assurer de
l'absence d'endotoxines dans les protéines
purifiées.
 Plasmides instables
 Pas de réplication pour la
plupart des plasmides
procaryotes
 les protéines synthétisées sont souvent obtenues à
l'intérieur du cytoplasme et nécessitent de casser la cellule
afin de les récupérer.
 La sécrétion est possible, mais en général au détriment
des rendements : elle
fonctionne bien pour des petits polypeptides tels que
l'insuline, mais beaucoup
moins bien pour de grandes protéines.
Bioinformatique de l'hormone
insuline humaine par E.coli
La synthèse de l'insuline par E.coli fournit les trois facteurs suivants:

Préparation du gène de l'insuline représenté dans la partie d'ADN portant le plan d'installation de
l'insuline

Préparation de cellules bactérienne E.coli comme lieu vital pour le travail des gènes

La préparation du vecteur porteur du gène de l'insuline est constituée des plasmides trouvés dans
les cellules bactérienne
L’idée de mettre en œuvre ces techniques dépend des grandes étapes suivantes:

Préparation de la reformulation de l'ADN en intégrant le gène insuline avec le support

L’introduction d’ADN redessiné dans les cellules bactériennes E.coli et dissolvante de gène insuline

optimisation de la culture de la souche sélectionnée

purification de l’insuline humaine produite
‫تحضير الخلية البكتيرية كمقر حيوي لعمل جين األنسولين‬
‫تحضير البالسميد‬
‫دمج مورثة األنسولين في البالسميد البكتيري‬
‫ادخال ‪ DNA‬معاد الصياغة ضمن الخلية البكتيرية‬
‫عزل النسائل البكتيرية الحاوية على بالسميدات معادة‬
‫الصياغة‬
‫اإلكثار من النسائل المرغوبة‬
‫تنقية األنسولين المنتج‬
‫صياغة األنسولين التجاري‬
 Préparation de l'ADN recyclé:
Les plasmides sont isolés du type de
Un gène d'insuline humaine est
vecteur d'expression à partir de
synthétisé par sa structure
cellules E.coli ; puis les gènes de la
chimique, où les deux segments série A ou B sont traités avec
distincts de l'ADN codé des séries l'enzyme de coupe interne spécifiée.
A et B sont synthétisés. Ajoutez à Cette enzyme ouvre l'anneau ADN en
chaque gène un lien fabriqué
un point spécifique d'une pièce de
contenant l’emplacement de la
monnaie située dans l'enzyme
coupe interne spécifiée.
ß.galactosidase . La forme
plasmidique devient linéaire dans
deux endothéliums.
En même temps, sous l'effet de l'enzyme de coupe interne
spécifique, la chaîne A ou la série B est extraite des nucléotides.
Peut se lier au plasmide au niveau du trou qui lui est appliqué .
Le plasmide ouvert est lié à la série A ou B sous l’activité ADN de la
ligase. Nous obtenons un ADN modifié codant pour cette dernière pour
une protéine de combinaison composée de l'enzyme ß.galactosidase et de
la chaîne synthétique A ou B selon le cas. Cet ADN est réécrit dans les
cellules E.coli
 La culture :


Les neutrophiles bactériens contenant
les plasmides sont isolés et replantés.
Les bactéries vont être mises ensuite
dans un petit bioréacteur appelé
fermenteur. Sous la présence de
solution nutritive elles vont se multiplier
très rapidement de manière
exponentielle. Puisque une bactérie se
divise toutes les 20 minutes cela fait un
total d’environ 4.7×1021 bactéries en 24
heures.
 Fermentation :


C’est durant cette période que les bactéries vont produire de
l’insuline. Les personnes chargées de la production vont
également s’occuper de transférer les bactéries dans des
cuves (les fermenteurs) toujours plus volumineux.
Cependant plus le fermenteur est grand, plus il devient
difficile de maintenir des conditions idéales, (la température,
le taux de sucre) de manière égale dans l’ensemble de la
cuve.
 Purification :




Une fois la phase de fermentation terminés, il faut récupérer le produit
fabriqué par la bactérie. Pour ce faire il faut séparer à l’aide d’une
centrifugeuse l’insuline de la bactérie.
Les bactéries vont être détruites à l’aide d’un produit désinfectant.
Juste après on procède à un clivage enzymatique où l’insuline va
pouvoir être concentrée.
Suite à quoi on va purifier le produit via un processus de
chromatographie à échange d’ion pour finir par une dia filtration ou
une ultrafiltration.
Principe d'expérience


L'insuline génétiquement modifiée a d'abord été synthétisée
par l'expression séparée des chaînes A et B(insulineß.galactosidase)
En raison de son caractère exotique, la cellule bactérienne
génère une sensibilité à laquelle on peut associer en
équilibrant la persistance de la synthèse avec son induction
immunitaire. Cela se fait en soustrayant (insulineß.galactosidase) au centre de l'implant



cette dernière étant traitée avec du CNBr
(bromure Cyanogen), qui décompose la
liaison peptidique après la méthionine Il a
été ajouté intentionnellement aux chaînes
A et B pour permettre la séparation les
chaînes de ß.galactosidase.
Puisque ß.galactosidase contient d'autres
acides aminés de méthionine, cette
dernière se décompose en petits
morceaux
Les chaînes A et B restent intactes
 Formulation :

Les chaînes A et B sont
mélangées et
rebranchées dans une
réaction qui forme les
ponts croisés du
bisulfure, ayant pour
résultat une insuline
humaine synthétique et
pure.



Du zinc est ajouté afin de fournir les conditions d’activation et
de cristallisation de l’hormone, nous obtenons ainsi de l’insuline
commerciale sous forme de cristallisé.
Une série de tests sont effectués sur des animaux perturbés
par la préparation précédente, afin de prouver leur efficacité.
Des tests humains sont également en cours
L'hormone est ensuite utilisée dans des flacons spéciaux multidoses
conclusion




Le diabète de type 1 est dû à la destruction de cellules du pancréas endocrine qui
produisent une hormone polypeptidique hypoglycémiante : l’insuline.
Les personnes atteintes de diabète, et présentant un défaut de production
d’insuline, doivent recourir à des injections de cette hormone pour réguler leur
glycémie.
Historiquement, l’insuline utilisée en thérapeutique a d’abord été extraite de
pancréas de porc et de boeuf. La demande de plus en plus importante d’insuline au
niveau mondial et le risque sanitaire associé à l’utilisation de produits animaux ont
conduit à mettre en place des techniques de production d’insuline par génie
génétique.
L’insuline humaine est maintenant produite à partir de souches bactériennes
d’Escherichia coli transformées par un plasmide recombinant contenant le gène
codant le précurseur de l’insuline
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