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Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 -1- Travaux Pratiques de la Licence de Biologie TRAVAUX PRATIQUES DE GÉNÉTIQUE Le but de l'expérience proposée est l'obtention et la localisation de mutations affectant les gènes impliqués dans le métabolisme du maltose chez Escherichia coli, une bactérie à gram négatif. • Le système utilisé sera celui d'une mutagenèse par insertion d'un transposon bactérien. • Les mutants seront sélectionnés : soit par leur phénotype [mal-] sur un milieu contenant un indicateur coloré, soit par leur résistance au bactériophage lambda (λ). À titre de référence, vous pouvez lire la revue consacrée au régulon Maltose parue dans Microbioloby and Molecular Biology Reviews en 1998 (volume 62, pages 204 à 229) et ‘network regulation of the Escherichia coli maltose system’ dans J Mol Microbiol Biotechnol en 2002. I) LE RÉGULON MALTOSE D'ESCHERICHIA COLI Le régulon maltose d'E. coli comprend huit principaux gènes (mal Q, P, T, G, F, E, K et lamB) dont les produits interviennent dans le métabolisme du maltose et des maltodextrines et un gène qui régule l'expression de ceux-ci (voir figures 1 et 2). malZ Maltodextrine glucosidase E. coli (9 min.) Figure 1. Le régulon maltose. Les positions des régions malA, malB et malS sur le chromosome d'E. coli sont données entre parenthèses. En présence de maltose, le produit du gène malT stimule l'expression de tous les gènes du régulon à l'exception de malT. Le transport du maltose et des maltodextrines met en jeu un système complexe qui comprend cinq protéines : les produits des gènes malE, malF, malG, malK et lamB. En plus de son rôle dans le transport, la protéine lamB est nécessaire à l'adsorption du bactériophage λ. Le métabolisme du maltose et des maltodextrines nécessite deux enzymes spécifiques : l'amylomaltase et la maltodextrine phosphorylase qui sont les produits des gènes malQ et malP respectivement (voir figures 1 et 2). École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 -2- Ces gènes sont regroupés en trois opérons. L'un de ceux-ci : malPQ est localisé dans une région qui a été appelée malA et qui est située à 76,5 minutes sur la carte d'E. coli. Les deux autres opérons malEFG et malK sont localisés dans une autre région : malB située à 91,4 minutes sur la carte d'E. coli (figure 6). La transcription de ces trois opérons est induite par le maltose et les maltodextrines et cette induction est sous la dépendance du gène régulateur malT localisé dans la région malA. Figure 2. Métabolisme de l'amidon et de ces dérivés chez E. coli. Les protéines impliquées sont représentées d'après le nom de leur gène (figure 1). TM : nombre d’hélices transmembranaires II) LA MÉTHODE DE MUTAGENÈSE Il existe chez les procaryotes comme chez les eucaryotes des séquences capables de se déplacer d'un site à un autre dans le génome. Ces séquences sont appelées éléments mobiles. Les transposons font partie de cette classe d'éléments. Chacun d'eux porte les gènes requis pour sa propre transposition, celle-ci étant éventuellement modulée par les fonctions de l'hôte. La transposition a pour conséquence l'insertion covalente dans l'ADN de l'hôte d'une séquence qui lui est étrangère, ce qui peut évidemment conduire à l'inactivation du ou des gènes ayant subi une telle insertion. École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 -3- Les éléments mobiles possèdent des tailles très variables, par exemple, chez les bactéries, de 768 pb pour IS1 à 37000 pb pour le bactériophage Mu. Le système utilisé en Travaux Pratiques fait appel aux propriétés cumulées d'un transposon bactérien dérivé de Tn10 et du bactériophage λ. 1- Les transposons bactériens La structure de Tn10 (9,3 kb) est représentée sur la figure 3. Ce transposon porte aux deux extrémités des séquences d'environ 1400 pb qui diffèrent l'une de l'autre par trois mutations ponctuelles. Ces séquences sont appelées IS10-gauche et IS10-droite. Les séquences IS (Insertion Sequence) sont elles-mêmes des éléments mobiles. Cette mobilité requiert la présence de deux séquences répétées inversées IR (Inverted Sequence) de 70 pb aux deux extrémités de l'IS. Elle nécessite en outre l'activité d'une protéine codée par IS-droite appelée transposase. La transposition peut permettre le déplacement de l'une ou l'autre IS, ou des deux IS, avec la séquence qu'elles encadrent. Seul ce dernier déplacement est aisément repérable grâce aux gènes de résistance (tétracycline). On peut remplacer ce gène de résistance par tout autre gène. Figure 3. Le transposon Tn10. Les extrémités IS10-Gauche et IS10-Droite encadrent les gènes tetR (répresseur de tetA), tetA (protéine membranaire nécessaire à la résistance), tetC et tetD (fonctions inconnues). Les demi-flèches à l'extrémité des éléments IS10 représentent les séquences répétées inversées. Les flèches grises dans les gènes tet indiquent le sens de transcription. La flèche pleine dans la région IS10-Droite indique le sens de la transcription du gène de la transposase et la flèche dégradée de la région IS10-Gauche celui de la transposase défective de cet élément. Dans le cadre des Travaux Pratiques (figure 4), le dérivé de Tn10 utilisé porte un gène de résistance à la kanamycine (Kanr). Figure 4. Transposon utilisé au cours des Travaux Pratiques. Le déplacement de tous les éléments mobiles bactériens est indépendant du système de recombinaison homologue. En outre, dans le cas de Tn10 et d'IS10, la transposition ne nécessite pas la réplication de l'élément mobile. A partir du Tn10 sauvage, décrit dans la figure 3, des mini-transposons ont été construits et intégrés dans les dérivés du bactériophage λ. Nous utiliserons, pendant les Travaux Pratiques, le bactériophage λ1105 (figure 5). 2- λ 1105 Le bactériophage λ est un bactériophage tempéré capable de lysogéniser Escherichia coli. Lors de ce processus, il intègre son ADN en un site unique du génome bactérien par l'intermédiaire École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 -4- de séquences appelées attB et attP. La séquence attB est présente sur l'ADN bactérien et attP sur l'ADN du phage. Le maintien de l'état lysogène nécessite la synthèse continue d'une protéine phagique codée par le gène cI. Le bactériophage λ peut également lyser la bactérie en se multipliant. Ce processus dépend de l'expression de gènes phagiques dont le gène P. Le bactériophage λ1105 porte une délétion du site attP (notée sur la figure 5 : b522) et une mutation ambre (non-sens) dans le gène P (P80am). En conséquence, ce phage ne peut lysogéniser, ni se multiplier dans une souche dépourvue de suppresseur de non-sens. Un tel virus ne pourra donc que se multiplier (sans pouvoir lysogéniser) dans une bactérie portant un suppresseur de non-sens. Dans λ1105, une partie de l'ADN phagique a été délétée et remplacée par de l'ADN dérivé des transposons Tn10 et Tn903. Dans ce fragment rapporté, on trouve : • le gène de la transposase de IS10-droite sous le contrôle d'un promoteur chimèrique appelé pTac. Ce promoteur est un promoteur hybride inductible par l'IPTG. • un mini-transposon (1,7 kb) portant à ses extrémités les séquences répétées inversées (IR) de IS903. Ces séquences encadrent le gène de résistance à la kanamycine, Kanr. Figure 5. Le bactériophage λ1105. 3- Utilisation de ce système La bactérie dont on veut effectuer la mutagenèse sera infectée par λ1105. Elle est dépourvue de suppresseur de non sens ambre. Le bactériophage λ1105 est défectif pour son site d'attachement attP (délétion b522) et muté dans un gène nécessaire à sa réplication (P80am), l'infection ne conduira donc ni à la lyse de la bactérie, ni à la multiplication du phage. Cependant, le phage λ1105 est École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 -5- toujours capable, dans certaines conditions de tuer la bactérie qu'il a infecté (gène kill). Cette bactérie ayant, d'autre part, été cultivée en présence de l'inducteur du promoteur de la transposase (IPTG), celle-ci sera pleinement exprimée. Dans ces conditions, la transposition sur le chromosome bactérien, de la séquence de 1,7 kb encadrée par les deux IR, sera possible et l'on pourra obtenir des bactéries [Kanr]. À la suite de cette manipulation, ne sera conservé du phage λ, que le mini-transposon qui sera intégré dans le chromosome bactérien. On peut considérer que ce type d'intégration se fait de façon aléatoire dans le chromosome. III) LES MILIEUX, LES SOLUTIONS LB : Luria Bertani, milieu complet permettant la croissance de tous les auxotrophes connus. MK1 : milieu Mac Conkey N °1, le mileu Mac Conkey est un milieu permettant de déterminer si une souche d'E. coli est capable ou non d'utiliser un sucre donné. Dans notre cas de figure, ce sucre est le maltose. Sur ce milieu des bactéries utilisant le sucre donnent des colonies rouges et les bactéries ne l'utilisant pas, des colonies blanches. L'origine de ces changements de couleur est due à des variations locales du pH. Le MK1 des Travaux Pratiques contient du maltose 1%, du citrate 2.10-2 M et de la kanamycine (25 µg/ml). Le citrate complexe les ions Mg2+ et Ca2+ nécessaires à l'adsorption du phage. Sur ce milieu, les réadsorptions parasites du phage sont donc inhibées. MK2 : milieu Mac Conkey N °2, milieu Mac Conkey maltose contenant de la tétracycline à 10 µg/ml et de l'acide nalidixique à 20 µg/ml. Ce milieu sera utilisé lors de la conjugaison. MK3 : milieu Mac Conkey N °3, milieu Mac Conkey maltose contenant de l'ampicilline à 50 µg/ml. Ce milieu sera utilisé pour le test de complémentation fonctionnelle. La kanamycine et la tétracycline sont deux inhibiteurs de la synthèse protéique. Le premier se fixe sur le ribosome alors que le second bloque la translocation du ribosome. L’acide nalidixique est un inhibiteur de la réplication de la bactérie en agissant sur la topoisomérase IV et l’ADN gyrase. Maltose : 20% (20g/100mL) ; Glucose : 1M ; IPTG : 1M ; Citrate : 1M ; kanamycine : 25mg/mL IV) GÉNOTYPES ET PHÉNOTYPES DES SOUCHES UTILISÉES HFR P4X TP1 TP2 HFR P4X : met-, srl::Tn10 F- : malPQ::Tn9, Δ malT, gyrA, thi-, thyAF- : ΔmalB, gyrA, thi- [mal+, TetR, nalS] [mal-, tetS, NalR] [mal-, tetS, NalR] V) PLASMIDES UTILISÉS Plasmides auto réplicatifs pMalFG pMalG pMalQ Gènes malF, malG malG malQ Taille 11318 pb 9669 pb 10633 pb Résistance apportée Ampicilline Ampicilline Ampicilline École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 -6- VI) POSITION DES DIFFÉRENTS ‘MARQUEURS’ SUR LA CARTE DU GENOME D’E. coli Figure 6. Carte du chromosome d'E. coli. La localisation de différents marqueurs utilisés durant les travaux pratiques est indiquée en minutes. Notez que ces marqueurs ne sont pas présents dans toutes les souches (cf. point IV) VII) TAILLE DES 8 GENES à CONSIDERER AUX LOCI malA ET malB Gène malT malP malQ malE malF malG malK lambB Taille en pb 2703 2391 2082 1186 1542 888 1113 1338 École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 -7- PREMIER JOUR Mutagenèse Avertissement : Ce cahier de protocoles expérimentaux est conçu comme une aide qui ne saurait vous dispenser de la tenue d’un cahier de manipulations. Il est recommandé de l’avoir lu avant de venir en TP !!! I) Présentation du TP II) Préparation des bactéries à mutagéniser Une culture de nuit de P4X en LB maltose 4‰, IPTG 10-3 M, sera centrifugée et reprise en MgSO4 10-2 M pour obtenir environ 109 à 1010 bactéries/ml (la concentration exacte de cette suspension bactérienne sera déterminée : voir ci-dessous). III) Mutagénèse 1) Transfection par le phage et transposition. 1-1) Préparer trois tubes de 1.5 mL selon le tableau suivant : Tube Bactéries T1 T2 T3 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml λ1105 à 3.108/ml 0,1 ml λ1105 à 3.107/ml LB 0,1 ml 0,1 ml N’oubliez pas de conserver une partie de la suspension de bactérie initiale que vous venez de répartir pour réaliser son dénombrement (III-3). 1-2) Mettre les 3 tubes à la température du laboratoire pendant 30 minutes sans agitation (préadsorption du phage). PENDANT ce temps, commencer le point 3) dénombrement. 1-3) Après ces 30 minutes, rajouter dans chacun des tubes 0,8 ml d'un mélange [LB, citrate 2.10-2 M, IPTG 10-3 M]. Attention à ne pas vortexer vos tubes pour ne pas stopper l’adsorption du phage. 1-4) Mettre à 37°C, sans agitation, pendant 60 minutes (expression de la résistance à la kanamycine). Pendant ce temps continuer le point 3 (dénombrement). 1-5) Préparer 2 tubes de cultures (tube de 14 mL) contenant 0,9 ml d’un mélange [LB, citrate 2.10-2 M, maltose 8‰, kanamycine 25 µg/ml], notés E1 et E2. 1-6) Mettre 0,1 ml de T1 et T2 respectivement dans E1 et E2. Mettre ces tubes à incuber à 37 °C avec agitation pour la nuit. 2) Étalements. 2-1) Etaler sur MK1 0,1 ml pour chacun des tubes T1, T2, T3. Pour T1 et T2, répéter les étalements pour étaler le maximum de la suspension (soit 3 boîtes supplémentaires pour T1 et T2). 2-2) Mettre les boîtes à incuber à 37°C (après les avoir retournées et convenablement identifiées !!). 3) Dénombrement des bactéries de la suspension initiale. 3-1) Effectuer une série de dilutions en cascade, jusqu’à 10-6 et 10-7 fois, dans du LB. Homogénéiser vos suspensions entre chaque dilution en vortexant 3-2) Préparer 4 boîtes de LB. Etaler 10 et 100 µl de chacune des dilutions 10-6 et 10-7, par boîte. Mettre les boîtes à incuber à 37°C (après les avoir retournées et identifiées). Pour étaler uniformément 10µl de suspension procéder comme suit : déposer 90µl de LB stérile sur boite puis immédiatement vos 10µl et étaler. École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 -8- DEUXIÈME JOUR I) Isolement de mutants résistants au phage Lambda Ces mutants seront appelés L (résistant à Lambda). 1- Dans 2 tubes de 1,5 ml, centrifuger 1 ml des cultures E1 et E2 (1 minute à 5000 rpm). Veiller à l’équilibrage de la centrifugation. 2- Éliminer les surnageants, resuspendre soigneusement les bactéries dans 1 ml de MgSO4 10-2 M. 3- Pour chacune des suspensions, réaliser dans un tube de culture (tube de 14 mL) le mélange suivant : 0,1 ml de bactéries en MgSO4 10-2 M + 0,1 ml de λvir à 2.1010/ml. 4- Homogénéiser et mettre à incuber à 37°C, 15 min sans agitation. 5- Au bout de 15 min, ajouter 0,8 ml de [LB, maltose 4‰]. Mettre à agiter à 37°C pendant 1h30. 6- Etalements : étaler sur MK1, 0,1 ml des suspensions. 7- Incuber les boîtes à 37°C après avoir retournées et notées les boîtes. II) Isolement et purification des mutants [mal-] ou mutants M Ces mutants seront appelés M (Maltose). 1- Dénombrer les colonies [mal-] et [mal+] sur chaque boîte. Sur le milieu Mac Conkey, les colonies [mal-] sont blanc-rosé alors que les colonies [mal+] sont rouge foncé. 2- Purification des [mal-] et test de sensibilité à λvir. A l’aide d’un cure-dent, resuspendre 8 colonies blanches, chacune dans un tube de 1,5 mL contenant 50 µl de milieu LB. Homogénéiser au vortex. 2-1) Test de sensibilité à λvir Procéder comme indiqué sur le schéma ci-dessous (figure 7) : • Faire une strie de λvir sur la surface d’une boîte de milieu LB en déposant uniformément avec un cône 20 µl de la suspension de phage fournie. Laisser sécher. • À l’aide d’un cône (5 µl), déposer d’un seul mouvement chaque suspension de colonie [mal-] perpendiculairement au dépôt de λvir. Ne surtout pas revenir en arrière. Vous pouvez déposer jusqu’à 4 colonies à tester par boîte. • Déposer de même et sur chaque boîte, deux souches témoins, l’une résistante (TP2) et l’autre sensible (P4X) au phage. • Laisser sécher les boîtes et les mettre à incuber à 37°C après les avoir retournées. 2-2) Purification des mutants [mal-] • Diviser le fond d’une boîte de milieu MK1 en quatre à l’aide d’un marqueur indélébile. • Strier avec un cure dent chacune des colonies resuspendues dans un de ces quartiers. • Incuber les boîtes à 37°C après les avoir retournées. III) Dénombrement des bactéries de la suspension initiale traitée par mutagénèse Compter le nombre de colonies obtenues sur chaque boîte LB. Déterminer la concentration cellulaire réelle de la suspension utilisée pour la mutagénèse IV) Résultats de la mutagénèse Dénombrer la quantité de cellules [KanR] et en déduire la fréquence de transposition. École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 -9- TROISIÈME JOUR I) Isolement des mutants dits L 1- Lecture des boîtes MK1. Repérer le phénotype [mal-/mal+] des colonies λr. 2- Resuspendre si possible 8 colonies [mal-, λr] et 8 colonies [mal+, λr] dans un tube de 2mL contenant 50 µl de milieu LB. Homogénéiser au vortex. 3- Vérifier la résistance à λvir de ces mutants en procédant comme la veille avec les mutants M (figure 7, 2-1). 4- Diviser le fond d’une boîte de milieu MK1 en 4 à l’aide d’un marqueur indélébile. Strier chacune des colonies resuspendues dans un de ces quartiers. 5- Mettre à incuber à 37°C pour la nuit sans agitation les tubes de 2 mL contenant les colonies [mal, λr] après avoir ajouté dans chacun d’eux 2 ml de LB. II) Étude des mutants dits M (suite) 1- Lire les boîtes de test de sensibilité à λvir. Les refaire éventuellement pour confirmation. 2- Pour 2 mutants M [mal-, λr] et pour 2 mutants M [mal-, λs], à partir des boîtes de purification (MK1), prélever une colonie isolée et la resuspendre dans un tube contenant 2 ml de LB si et seulement si l’ensemble de la strie est homogène. 3- Si vous avez un doute quant à l’homogénéité de vos mutants (mélange de colonies blanches et rouges sur strie MK1) vous devez refaire : a/ les stries sur une boîte MK1 et b/ test de sensibilité à λvir. 3bis-Pour cela prélever une colonie isolée BLANCHE et la resuspendre dans un tube de 2 ml contenant 50 µl de milieu LB puis procéder comme au jour deux 3ter- Une fois les tests phénotypiques refaits, ajouter 2 ml de LB. 4- Incuber l’ensemble de vos tubes à 37°C pour la nuit sans agitation. III) Discussion-rédaction • Déterminer : - l’efficacité de la transposition. - la fréquence des mutants [mal-]. • À votre avis, les mutants L sont-ils indépendants ? Et les mutants M ? • En fonction des phénotypes de vos différents mutants M et L et de la structure du régulon maltose, quelles hypothèses pouvez-vous faire sur la nature de vos différents mutants ? • À quoi sert l’étape d’incubation des mutants L avec le phage λvir. • Etc … École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 - 10 - QUATRIÈME JOUR IDENTIFICATION DES MUTANTS VOIR plan d’organisation des expériences (Figure 9) I) Test de complémentation fonctionnelle Ce test sera réalisé en transformant chacun des 2 mutants [mal-, λs] étudié par 3 plasmides portant respectivement : 1) les gènes F et G de MalB : plasmide pMalFG 2) le gène G de MalB : plasmide pMalG 3) le gène Q de MalA : plasmide pMalQ 1- Préparation de bactéries compétentes 1-1) Pour chacun des 2 mutants [mal-, λs] clairement caractérisés, préparer un erlen de 50 ml contenant 10 ml de LB préchauffé à 37°C. Ensemencer par 0,5 ml de vos précultures après avoir correctement homogénéiser vos tubes. Mettre à agiter à 37°C jusqu’à 0.3 < A600 < 0.6. Une mesure d’absorbance sera réalisée après 2 heures de culture Passer au point II : conjugaison bactérienne 1-2) Quand 0.3 < A600 < 0.6, transférer rapidement dans la glace pour stopper la croissance. ATTENTION : À PARTIR DE CET INSTANT, IL EST IMPERATIF QUE LES BACTÉRIES RESTENT A 0°C. 1-3) Transférer 5 x 2 ml de culture dans 5 tubes de 2 ml. Centrifuger 30 secondes dans une centrifugeuse de paillasse à 13000 rpm. 1-4) Décanter soigneusement le surnageant et re-suspendre le culot bactérien dans 1 ml de CaCl2 100 mM glacé. 1-5) Laisser dans la glace pendant au moins 30 minutes. 1-6) Centrifuger les bactéries pendant 30 s dans une centrifugeuse de paillasse à 13000 rpm 1-7) Éliminer soigneusement le surnageant et re-suspendre chaque culot dans 100 µl de CaCl2 100 mM glacé. 1-8) Rassembler les suspensions en un seul tube sur glace. 2- Transformation Ce protocole doit être réalisé pour chacun des 2 mutants. 2-1) Dans des tubes de 1,5 mL glacés, réaliser les mélanges suivants pour chaque mutant : Tubes Bactéries compétentes pMalFG à 2ng/mL pMalG à 2ng/mL pMalQ à 2ng/mL 1 0,1 ml 10 µl 2 0,1 ml 3 0,1 ml 4 0,1 ml 10 µl 10 µl 2-2) Laisser les mélanges au moins 15 min sur la glace. 2-3) Transférer vos tubes dans un bain-marie à 37°C pendant 2 min, puis remettre sur glace pendant 2 min. ATTENTION à bien respecter les TEMPS ! 2-4) Ajouter dans chaque tube 0,8 ml de [LB + 20 mM glucose], mélanger doucement et mettre à 37°C pendant 30 minutes sans agitation. La solution stock de Glucose est à 1M. École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 - 11 - 3- Étalements 3-1) Centrifuger 30 secondes à 13000 rpm vos tubes. 3-2) Décanter soigneusement le surnageant. 3-3) Resuspendre le culot bactérien par 100 µl de MgSO4 10-2 M. 3-4) Étaler chaque suspension bactérienne sur boîte MK3. 3-5) Mettre les boîtes à incuber à 37°C après les avoir retournées et identifiées. II) Localisation génétique des mutants par conjugaison 1- Croisement en liquide Choisissez 4 mutants parmi les mutants M ou L de façon à obtenir 2 mutants [mal-, λr] et 2 mutants [mal-, λs] (il s’agit des mêmes mutants que ceux pour lesquels vous réalisez la complémentation fonctionnelle), réaliser les mélanges suivants (tubes de 2 ml) : A 0,2 ml Mutant + 0,8 ml de F- TP1 B 0,2 ml Mutant + 0,8 ml F- TP2 ATTENTION À NE PAS VORTEXER VOS MUTANTS ! Mettre au bain-marie à 37°C sans agitation pendant 2h30. 2- Dépôts des témoins sur les boîtes 2-1) Pendant l’incubation des croisements, préparer les boîtes MK2 où seront étalés les croisements. 2-2) Déposer 20 µl des suspensions des témoins et mutants d’origine comme indiqué sur le schéma (figure 8). Laisser sécher en veillant à ne pas bouger les boîtes. TP1 Mutant x TP1 Mutant TP2 Mutant x TP2 Figure 8 3- Dépôts des croisements sur les boîtes 3-1) Centrifuger chacun des 8 croisements pendant 30 secondes (13000 rpm). 3-2) Décanter soigneusement le surnageant et resuspendre les culots bactériens dans 250 µl de MgSO4 10-2 M 3-3) Pour chacun des 8 croisements, déposer 50 µl sur les boîtes comme indiqué sur le schéma (figure 8). Laisser sécher en veillant à ne pas bouger les boîtes. Étaler, de plus, sur une boîte MK2 : 200 µl pour les croisements avec TP2 ; 100 µl pour les croisements avec TP1. 3-4) Une fois les boîtes sèches, les mettre à 37°C sans oublier de les retourner. III) Étude des mutants L (suite) 1- Lire les boîtes de test de sensibilité à λvir. Les refaire éventuellement pour confirmation. 2- Vérifier la pureté de vos mutants. École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 - 12 - CINQUIÈME JOUR I) Lecture des boîtes de conjugaison II) Lecture des boîtes de complémentation III) Interprétation —> Identification du gène muté dans les souches étudiées. IV) Discussion générale École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS
