Etude génétique du cycle cellulaire et de sa régulation. Cours du 17
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Etude génétique du cycle cellulaire et de sa régulation. Cours du 17 Septembre 2008 : MD1 Introduction. Comment a-t-on pu établir le cycle cellulaire de cette espèce ? Chez tous les organismes : il y a des étapes faciles a observées comme la division cellulaire. Chez les eucaryotes supérieurs, la mitose est également facilement observable. Les populations cellulaires sont asynchrones : toutes les cellules ne se divisent pas en même temps : techniques spéciales pour les synchroniser. Estimation de la durée de la phase S. On fait un marquage de l’ADN néo-synthétisé avec un marqueur appelé BrdU. Puis on fixe immédiatement les cellules et on rajoute des Ac anti-BdrU. Ainsi, on ne marque que les cellules qui sont à un moment précis de leur cycle et qui fixe donc ce BrdU. Pour les cellules de mammifères, la phase S représente environ 1/3 du cycle. Mais ou se situe exactement cette phase S dans un cycle ? Estimation de la phase G2. On rajoute du BrdU pendant différents temps, jusqu’à que l’on ne voit plus de marquage. Cela marque la durée entre la fin de la phase S et le début de la mitose. Analyse du cycle cellulaire par iodure de propidium (IP). [Il s’agit d’un agent intercalant : la quantité fixée est directement liée à la quantité d’ADN.] Le nocodazole est un poison du fuseau mitotique : les chromosomes ne peuvent pas migrer aux pôles. Les hépatocytes ont un contenu en ADN de type G1. Ils ne se divisent plus en temps normal. Mais la morphologie des hépatocytes en G1 quiescent sont différents de ceux en G1 cyclant. : on a alors appelé ce stage G0. 1948 : premières cultures de cellules de mammifères. Quelques années plus tard, on est capable de faire fusionner des cellules de mammifères ce qui donne des hétérocaryons. Les cellules qui arrivent à survivre à la fusion et à la culture arrivent à un stade d’hybrides somatiques (4n ADN). Que se passe t’il si les cellules fusionnent ne sont pas au même stade cellulaire ? G1 avec G2 : G1 fait ses G1, S, G2 pendant que G2 attend puis les deux cellules rentrent en mitose. G1 avec S : G1 écourte son S et rattrape l’autre puis les deux cellules rentrent en mitose. Il existe donc des protéines régulatrices. On garde toujours le même ordre des phases. En G1 et S, il doit y avoir des inhibiteurs de rentrée en mitose pour le noyau de G2. En S, il doit y avoir des activateurs de rentrée en S pour les cellules G1 et des inhibiteurs de rentrée en S pour le noyau de G2. Phénomènes hautement régulés. Une fusion d’une cellule en mitose avec n’importe qu’elle cellule aux stades G1, S, G2 provoque une condensation des chromosomes (en G1 : chromosomes à une chromatide) (en G2, ca se passe bien) (en S : pas viable). Il existe un activateur de rentrée en M très puissant qui permet dans ce cas uniquement d’inverser l’ordre des phases : c’est le MPF (mitosis promotting factor). On peut faire condenser des chromosomes humains avec un noyau mitotique de souris, drosophile…etc.et réciproquement. Le MPF est très conservé. Caractéristiques de S.cerevisae et S.pombe. Génome haploïde : 17,5Mbases. Cycle cellulaire chez S.cerevisae. La cellule qui commence a présenté un bourgeon comme sa phase S. C’est un moyen physique de reconnaitre les cellules qui rentrent dans ce stade. (Erreur sur le schéma du polycopier). Il s’agit d’un organisme haplo-diplo-biontique. -haploïde : utile pour avoir des mutants récessifs -diploïde : utile pour avoir des mutants dominants. Les cellules de type A sécrètent un peptide A qui est capable de bloquer les cellules α au stade Start, ainsi que les cellules de type α sécrètent un peptide α qui est capable de bloquer les cellules A au stade Start. Les cellules sont donc au même stade avant de fusionner. Mutants de cycles conditionnels (cdc) Prix Nobel 2001. On va passer par des mutants thermosensibles (le phénotype de thermosensibilité n’est pas forcement la létalité). C’est la protéine qui sera thermosensible. La protéine sauvage résistera jusqu’à x degrés alors que la mutante y sera instable. On utilise en général 3 températures chez la levure : -11°C : la levure se divise de façon normale (si <, alors on n’observe que peu de divisions) -36°C -23°C WT Mutants TS Mutants CS 11°C + + - 23°C + ? ? 36°C + + Sélections de mutants létaux thermosensibles (TS) indépendants. =>plusieurs mutants sont créés. On met en culture pour obtenir une large palette de mutants différents. On ne veut surtout pas que deux mutants provenant de la même cellule mère soit créés. On commence à faire une culture à température non permissive pour éviter des mutants déjà présents pour la protéine recherchée. Les mutants, qui n’ont pas le temps de se diviser, ne tombe que dans un seul tube donné lors de l’élution. (On se dépêche de faire des aligots pour éviter que le mutant ne se divise). On met ensuite en culture sur un milieu riche pour éviter les parasitages des mutations qui auraient été induites partout ailleurs (ex : mutants des voies métaboliques…) Analyse génétique : procédure générale. Combien de gènes sont touchés dans ces mutants ? On étale les cellules sur un milieu Ura- Leu- parce que les diploïdes n’aient pas besoin d’Ura et Leu pour vivre (Ura et Leu sont dominants). Cependant, nos levures sont de même sexe, donc il va falloir créer soit des levures A ou des levures α. On va faire passer la méiose aux levures pour les faire sporuler. Pour récupérer les bonnes spores, et éviter les problèmes de probabilité de récupérer les bons mutants, on va faire pousser les levures sur différents milieux sous différentes conditions. On récupère alors cdc x, Ura3, Leu2, α/A. Il nous reste à savoir si la souche et A ou α ? =>on fait des croisements arbitrairement avec des souches de références dont le sexe est connu. On fait pousser sur un milieu sans Ura ni Leu pour que seules les cellules diploïdes poussent. Si ca pousse, on verra l’apparition de colonies a l’intersection des stries sur la boite de Pétri. Si muté dans le même gène : Si muté dans un gène différent : Résultats finaux : un panel de 32 gènes ont été identifiés.
