UNIVERSITE DE MEDECINE ET PHARMACIE DE CRAIOVA FACULTE DE MEDECINE EVALUATION DU ROLE DES COMPOSANTES EPITHELIALE ET STROMALE DANS LE COMPORTEMENT DU CARCINOME GASTRIQUE THESE DE DOCTORAT - RESUME - Coordinateur scientifique: Prof. Dr. Ioan T. ROŞCULESCU Doctorant: Aurelia GLAVICI 2008 INTRODUCTION Le cancer gastrique est l'un des cancers le plus puissant dans le monde entier avec un déterminisme multifactoriel, avec un développement et distribution qui sont également influencées par un large éventail de facteurs et avec un profil clinicomorphologique polymorphe. En définitive, tous ces aspects, conduisent à une espérance de vie très faible à partir du moment de détection. Une raison pour cela est le pronostic très réservé des formes avancées, avec des taux de survie moins de 23% et rarement plus de 15% [1, 2]. Les résultats des traitement appliqués sont encore peu satisfaisantes. L'une des difficultés diagnostiques principaux et d'établir des stratégies thérapeutiques efficaces, c'est le manque d'un certain nombre d'indicateurs pour son comportement clinique [3]. Le stroma tumoral n'est pas seulement un spectateur passif, mais plutôt un participant actif dans les processus d'initiation, la progression et les métastases du cancer, qui peut, comme le suggèrent certains auteurs, d'être une cible thérapeutique prometteuse. Bien que dans le monde scientifique international nombreux groupes ont fait des etudes sur le stroma tumoral, il y a encore peu d'études sur le stroma dans le carcinome gastrique. Dans notre pays ces etudes sont presque disparu. ETAT DE LA CONNAISSANCE Le carcinome gastrique. Le cancer gastrique est l'un des cancers les plus fréquents et mortels dans le monde entier, en particulier en Asie de l'Est, y compris la Chine. Le taux de survie à 5 ans n'est que de 20% [4]. Il est une maladie multifactorielle. La variabilité géographique marqué, l’évolution dans le temps et l'effet de la migration sur l'incidence du cancer gastrique, suggèrent que des facteurs environnementaux et ceux liés au mode de vie jouent un rôle important dans l'étiologie de la maladie. Il ya aussi des différences dans la susceptibilité génétique, le profil pathologique, les manifestations cliniques et le pronostic. Les différences observées entre les différents sites du cancer gastrique donne à penser qu'ils sont des maladies distinctes avec différentes étiologies [5]. Le carcinome gastrique montre des variations considérables dans la structure histologique et le degré de différenciation. L'hétérogénéité morphologique des carcinomes gastriques à la fois entre les différentes tumeurs, mais aussi dans la même tumeur conduit à un grand nombre de tentatives pour mettre en place un système de classification à inclure ces aspects de la morphologie des tumeurs qui ont une signification pronostique. Mais le fait que de nombreux classification histologique de l'adénocarcinome gastrique existent suggère qu'aucun d'entre eux n'est entièrement satisfaisante [6]. Le facteur prédictif le plus approprié pour le pronostic du cancer gastrique reste le système TNM [7, 8]. Le changement de l'incidence avec le transfert vers des formes de la partie proximale, avec un phénotype plus agressif, mais ausi l'incapacité de détecter les formes précoces, ont limités dans les 20 dernières années, les possibilités d'amélioration significative de la survie [9]. Les chances individuelles d'un patient ayant survécu 5 ans après le diagnostic sont très petites [10, 11, 12]. Le stroma tumoral. La tumeur est plus qu’un groupe de cellules solitaires transformées. Les cellules épithéliales tumorales peut se développer que dans un microenvironnement dévié, constitué de la matrice extracellulaire altérée et de nombreuses cellules non transformées qui jouent un rôle dans l'initiation et la progression de tumeurs [13, 14, 15, 16]. Le stroma tumoral est définie comme l'ensemble des structures mésenchymateuses modifiés qui soutiennent les tissus cancéreux. Comme structure de support et système nutritif, le stroma accompagne toute prolifération néoplasique, même si elle est mieux répartie dans les carcinomes que dans les sarcomes où ele est très difficile d'identifier. Elle représente la reaction du tissu conjonctif qui souffre de divers changements en contact avec le parenchyme tumoral et comprend, donc, des éléments de néoformation mai pas tumorales [17, 18]. Selon l'expression de CD34, CD31, α-actine du muscle lisse et de caldesmon à poids moléculaire élevé, dans le tractus gastro-intestinal, dans des conditions normales et pathologiques, on a mis en évidence cinq phénotypes différentes de cellules stromales, autres que les cellules inflammatoires et les cellules interstitielles de Cajal. L'angiogenèse exprimée en moyenne densité vasculaire est en étroite relation avec les métastases et un pronostic défavorable du cancer gastrique, de telle sorte que DVM et les métastases dans les ganglions lymphatiques sont des facteurs pronostiques indépendants pour les patients atteints de cancer gastrique [3]. M AT É R I E L CONTRIBUTION PERSONNELLE E T M É TH O D E S . La base de l'étude a été composée à l'origine d'un groupe de 59 patients admis et opéré dans la Clinique de Chirurgie de l'Hôpital Universitaire CFR de Craiova entre 2003 et 2008, pur lesquelles l'examen histopathologique postopératoire a diagnostiqué un carcinome gastrique. Les critères d'inclusion pour les patients dans le groupe et sous-groupes étaient les suivants: existence d'une intervention chirurgicale, le diagnostic histopathologique de carcinome gastrique. Du premier lot trois groupes d'étude ont étés individualisées: Groupe 1a, composé de 43 patients atteints auxquels l'examen histopathologique a révélé dans la masse tumorale l'existence d'une seule aspet morphologique selon la classification de l'OMS [19]; le Groupe 1b, composé de 16 patients chez qui l'histopathologie a révélé dans la masse tumorale deux zones avec classification morphologique OMS différente; Groupe 2, composé de 75 zones tumorales. Le matériel d'étude a été représenté par deux types de sources de données. La première catégorie est représentée par les dossiers médicaux des patients inclus dans l'étude: fiches d'observation cliniques, les dossiers de protocoles de chirurgie, registres de diagnostic histopathologique. La deuxième catégorie de matériau étudié était composé de: pièces prélevés des cas opérés lors de l'étude, des blocs de paraffine des cas opérés avant l'étude et inclus dans l'étude et les préparations histologiques de tous les cas inclus dans étude. L'étude a été rétrospective et prospective, et divisé en deux chapitres: L’étude du profil clinico-morphologique; L’étude des corrélations entre les paramètres cliniques et morphologiques. Paramètres évalués. On a créé des fichiers de type "base de données" dans l'ordinateur ou on a placé tous les paramètres considérés. Ces paramètres ont été répartis comme suit: Paramètres cliniques: sexe, âge. Paramètres d'évaluation morphopatologique: l'emplacement de la lésion sur la pièce d'excision chirurgicale, l’aspect macroscopique de la lésion sur la pièce d'excision chirurgicale, l’aspect microscopique de la lesion sur la pièce d'excision chirurgicale (classification de l'OMS, classification Lauren, classification Goseki, et la classification Carneiro); le degré d'extension tumorale (invasion du paroi gastrique sur la pièce d'excision chirurgicale, l’invasion des ganglions loco-régionaux et la diffusion à distance, le stade TNM); Le degré d'agressivité de la tumeur (Détermination du marqueur de prolifération Ki67, Détermination du p53, l'évaluation du composant stromale tumeural, des paramètres du composant fibrillaire; paramètres pour évaluer le composant cellulaire spécifique, l'évaluation de la densité vasculaire intratumorale). Les données préliminaires sur les paramètres cliniques et les mesures morphologiques ont été introduits dans les tableaux de base de données informatiques du module Microsoft Excel du Microsoft Office XP Professionnel. Histopathologie. Les fragments de tissus tumoraux ont été soumis à des techniques classiques de traitement histologique (fixation et l'inclusion dans la paraffine). Des coupes sériées ont été fabriqués à partir de chaque bloc. Les cinq premières sections ont été colorées avec des méthodes de coloration classiques (hématoxyline-éosine, trichrome de Masson, Gömöri, Mucicarmin, Bleu Alcian). Les six sections suivantes ont été utilisées pour le marcage IHC avec les anticorps suivants: CD34, SMA, Ki67, p53, MUC1, MUC 2. Acquisition d'images microscopiques. Les aspects histopathologiques ont été sélectionnés à l'aide de l'oculaire avec un grossissement de X4. Pour l'acquisition d'images, nous avons utilisé les objectifs planapocromats optiques corrigés avec un grossissement de X4, X10, X20 et X40. Les images les plus importantes ont été prises avec une caméra vidéo digitale directement dans l'ordinateur et traitées en utilisant un logiciel d'analyse d'image spécialisé. Mesures morphologiques quantitatives. Les mesures morphométriques quantitatives de diverses composantes de stroma intratumoral ont été réalisées avec le module «Mesures» du programme d'analyse d'image. Dans les cas qui ont présenté deux grandes zones tumorales distinctes, les déterminations pour chacun des paramètres stromales quantifiés ont été effectuées séparément pour chacune des deux zones tumorales et entré séparément, seulement pour le Groupe 2. Pour évaluer la composante fibrillaire du stroma intratumoral deux séries de mesures on étés effectuées sur des coupes sériées colorées par deux techniques différentes pour l'identification des fibres de collagène: Masson et Gömöri. On a considéré, pour chaque champ, puis pour chaque cas (zone principale de la tumeur), que la valeur de la PCFS-M est la valeur la plus élevée de mesures sur les deux techniques. Dans l'évaluation de l'activité de la composante cellulaire stromale produisant de collagène on a calculé l’indice de fibrillogenèse - IF. Pour calculer le poids de chacun des types de fibres de collagène on a utilisé un algorithme spécial. Pour l'évaluation de la composante cellulaire stromale ont été effectuées deux séries de mesures sur des coupes sériées marqués par immunohistochimie avec l'actine du muscle lisse pour les cellules stromales SMA+; les anticorps contre CD34 pour mettre en évidence les cellules endothéliales vasculaires et les cellules stromales CD34+. La valeur était la somme des deux déterminations. Pour l'évaluation de la densité de cellules stromales CD34+, sur les 5 champs marquées avec anticorps anti-CD34, les cellules marquées ont été comptés pour chaque champ et ensuite on a calculé la densité cellulaire/mm2. Pour l'évaluation de la densité vasculaire sur les 5 champs sélectionnés et marqués pour CD34, les structures vasculaires ont été comptés pour chaque champ et ensuite on a calculé la densité vasculaire/mm2. Pour l'évaluation de l'agressivité des tumeurs étudiées ont a calculé l’index de prolifération Ki67 et l'index p53. Pour définir ces indices on a compté au moins 1.000 noyaux de cellules malignes dans plusieurs champs microscopiques photographiés avec l'objectif 40X. Analyse statistique et interprétation des résultats. Pour l'analyse des corrélations entre les paramètres, la filtration de données brutes, avec leur division en groupes, a été nécessaire. Pour les paramètres numériques les suivants indicateurs statistiques ont été calculés: VMIN, VMAX, VMOY, STDEV, IC - 95%. Pour les paramètres numériques on a utilisé l’index de corrélation "Pearson". Pour les paramètres divisée en classes á l’aide d’une échelle de stratification on a utilisé le test de corrélation "χ2". Ll'expression graphique des résultats et de leur interprétation a été réalisée grâce à des programmes spécialisés de statistiques. É TU D E DU P O F I L C L I N I C O -M O R P H O L O G I E Le profil clinico-morphologique. Bien qu'il existe des études indépendantes qui ont montré que le type mixte est une réalité et non une situation rare et qui, en outre, ont indiqué qu'il avait un pronostic plus sévère que les types purs [6, 20, 21], les classifications qui comprennent cette entité sont encore loin de devenir une pratique courante. Dans le tableau 24 on compare les aspects significatifs tirées de l'analyse des données pour chacun des deux groupes. Ainsi les tumeurs avec un seul aspect histologique dans la masse tumorale ont été généralement constaté chez les hommes âgés, n’avaient une nette préférence pour l'une des segments du tractus digestif tandis que la yone antro-pylorique était plus fréquemment impliquée, s'exprimant aussi bien par l’infiltration de la paroi et la protrusion dans la lumière, dans les deux situations avec ulcération de la surface tumeurale. De point de vue histologique l’étude a montré une tendance généralement indifférencié (diffuse dans la classification Lauren - 1965, avec des cellules isolées, ou solide dans la classification Carneiro - 1995), et un modèle tubulaire/glandulaire, habituellement modérément différencié et généralement secreteur. Le comportement biologique était agressif, avec l’invasion totale de la paroi gastrique, avec des embolies tumorales fréquentes dans les structures vasculaires sanguines intrapariétales, l'invasion dans les ganglions lymphatiques régionaux représentant presque une règle, comportement reflète dans la forte proportion de stades III et IV déterminée par le système TNM. Le phénomène nécrotique, visible sur la surface de la tumeur ou dans la masse tumorale était également une observation commune. D'autre part, les tumeurs avec deux aspects histologiques dominantes dans la masse tumorale, on montré une patient plus jeune en général, habituellement une femme, qui avait une tumeur située presque exclusivement dans la région antropylorique, avec un aspect prédominant infiltrant et avec l'ulcération de la surface plane de la tumeur. Le pattern histologique dominant a été tubulaire/glandulaire, mais souvent mal différenciés, souvent accompagnés par des zones mucineuses avec phénotype sécrétoire. Le comportement biologique a été un peu moins agressif, envahissant toute la paroi, mais qui ne dépassait pas la séreuse, envahissant rare des structures pariétaux particulières et généralement vasculaire et périnerveux, avec invasion ganglionaire reduite et avec métastases à distance deux fois plus fréquentes que dans l'autre type. Par ensemble, la classification TNM était moin douce que dans l'autre groupe. Le phénomène nécrotique était présent, comme déjà mentionné, mais le plus rare que dans le groupe des tumeurs monomorphes. Les marqueurs tumoraux ont montré des valeurs comparables, avec une expression plus fréquente de p53 dans les tumeurs avec deux modèles morphologiques au sein de la tumeur. La difficulté sinon l'impossibilité pratique d'obtenir des données sur le développement des patients hors de l’hôpital, nous a mis dans une situation d’impossibilité en ce qui concerne l’évaluation comparative du pronotic des deux groupes de tumeurs et la comparaison de nos résultats avec la littérature. Le profil du stroma intratumoral. Par ensemble, le stroma tumoral, variait généralement entre 10% et 40% de l’arie tumeurale, variation expliquée par un nombre élevé de tumeurs invasifs du paroi gastrique au-delà de la sous-muqueuse. Les structures des fibrillaires dominaient l'architecture générale du stroma, le ratio moyen des deux composantes étant "2". Ainsi, pour près de 40% des cas, les mesures ont été regroupés dans la classe de score "2", ce qui signifie une répartition relativement équilibrée des deux composants, à partir de la prévalence faible de la composante fibrillaire à un pourcent double de la composante fibrillaire en regard de la composante cellulaire. On doit noter que dans 20% des déterminations, spécifique la composante cellulaire a été mieux que la composante fibrillaire. Chaqun des deux types de fibres ont representée 10% de la composante globale de fibrilles, par enesemble, la composante fibrillaire a representée le plus souvent entre 10% et 30%, sans quatre cas avec une composante très riche en fibrilles (plus de 30% de la tumeur. Les fibres réticulaires ont généralement dominé le compartiment fibrillaire, traitat une activité sécrétoire importante de certaines cellules du stroma. Le compartiment cellulaire a été composée en majorité de cellules spécifiques qui produisent le matérielle fibrillaire du MEC, cellules vasculaires (cellules endothéliales et adventiciales) qui représentent environ la 10-ème - 13-ème partie du compartiment cellulaire. Le compartiment vasculaire a montré une grande variabilité de la densité du réseau intra-tumorale, avec une moyenne de moins de 200 au vaisseaux/mm2, plus de moitié des valeurs de la densité vasculaire étant inférieur à la moyenne. E TU D E D E S C O R R E L AT I O N S E N TR E M O R P HO L O G I Q U ES LES P AR AM E TR E S C L I N I CO - Les systèmes d'évaluation morphologique ont été corrélés les uns avec les autres, ce qui ne doit nous surprendre aussi longtemps que le paradigme d'évaluation tumeurale conserve le résultat de l'observation directe, c’est-á-dire la morphologie des cellules en première étape et des tumeurs en deuxième étape pour obtenir enfin, indépendamment de l'approche de l'une des classifications, le même objectif, en toute sécurité dans l'algorithme de diagnostic de la pensée du praticien pathologiste – savoir établir le degré de différenciation ("la tumeur fait des tubes/glandes ou non?" “La tumeur séecréte ou non?”). On persiste à placer au centre du système d’évaluation le degré de différenciation, bien qu'aucun des systèmes créés n’est pas en corrélation avec un indicateur de comportement morphologique et biologique macroscopique et microscopique des tumeurs étudiées, ce qui est observé dans nombreuses études de la littérature qui prend en charge très fortement l'absence de valeur prédictive de la plupart des systèmes de classification. Il ya une exception notable, la corrélation directe et logique entre l'embolie tumorale en particulier dans les structures vasculaires de la paroi gastrique et la probabilité d'invasion plus pariétale que ganglionaire. L’évaluation des interactions entre les différentes composantes de stroma tumoral fait ressortir un comportement très fortement active et dynamique de stroma intratumorale, ce qui tend à maintenir l'équilibre entre les différentes composantes morphologiques, sans doute pour le pliage de la population de cellules qui doit le soutenir. Une exception ici, cette fois le décalage de cerrélation entre la population de cellules produisant des structures fibrillaires et des fibres de collagène de type fasciculaire. Ce type de fibre est probablement le squelette de base, même dans une conception architecturale avec un haut degré de désordre que la tumeur, squelette qui ne varie presque du tout. L’adaptation de la structure fibrillaire de soutien á la dynamique de la population de cellules tumorales est obtenue en faisant varier le nombre de cellules produisant des matières de fabrication du matériel fibrillaire nécessaire prédominant réticulaire, ce qui est confirmé par la corrélation étroite entre le nombre de cellules et la quantité de fibres de ce type qui répondent beaucoup mieux á la "construction" désordonnée du parenchyme tumeoral. Dans l'analyse des corrélations entre les indicateurs morphologiques et les composants stromales d'une tumeur ont doit mentionner la tendance des tumeurs à différenciation glandulaire et sans propriétés sécrétoires d’avoir un support stromal mieux représenté, autant que les formes solides et d’une nature sécrétoire bien exprimé ont une tendance d’avoir un support stromal inférieur. En outre, le soutien vasculaire peut se corrélér avec l'architecture tumeurale, étant reduit dans les formes différenciées riche en cellules (formes papillaires) ou avec une production intense de mucus, mais mieux représentées dans les formes avec faible différenciation ou indifférenciée. Il ne faut pas négliger une autre corrélation évidente avec l’embolie vasculaire, qui est en quelque sorte logique, d'autant plus frappante que le réseau vasculaire intratumoral est miex développé. CONCLUSIONS Notre étude a conduit aux conclusions suivantes: Le type de tumeurs avec deux aspects histologiques dominantes est une réalité qui ne peut pas être contestée, dont les auteurs de classifications essayent de son individualisation dans les systèmes de d’évaluation du néoplasie maligne épithéliale gastrique. Nos résultats ont présenté un profil morphologique et biologique qui s'avère différent de cel des tumeurs monomorphes, mais le profil doit être complété et validé. L’analyse des composantes du stroma tumural démontre que le microenvironnement stromal est un participant actif dans le phénomène néoplasique, avec un rôle central du compartiment cellulaire qui remodèle et adapte continuellement la structure porteuse aux besoins de cellules épithéliales néoplasiques mais seulement en étroite collaboration avec le compartiment vasculaire, corrélation indépendante du profil morphologique de la population de cellules malignes. Le profil tumeural doit être redéfini en identifiant certains paramètres descriptifs qui se concentrent principalement sur la prévisibilité de l'évolution du processus néoplasique maligne, tandis que, à la suite de notre analyse, la tendance des rapports finaux seulement au termes morphologiques descriptifs ne fournit pas un support solide pour la construction d'une stratégie thérapeutique et de prévention. Le phénomène de l'embolie tumorale comme facteur pronostique indépendant attire l’attention sur une zone potentielles d'exploration pour identifier la valeur prédictive des paramètres descriptifs, c’est-á-dire le profil biologique des cellules malignes. Le détournement de l'attention de la description morphologique exhaustive ou l'identification d'un pattern génétique individuel vers l'identification et la description précise des caractéristiques qui définissent le comportement biologique peut conduire à trouver ceux indicateurs pronostiques attendu depuis longtemps. BIBLIOGRAPHIE SELECTIVE 1. Tanaka K, et al Incidence and prognosis of gastric cancer in a population-based cohort survey: the Hisayama study. Scand J Gastroenterol. 2004; 439:459-463 2. Steward BW, Kleihues P: World Cancer Report. IARC Press: Lyon, 2003 3. Zhao H-C, et al. Microvessel density is a prognostic marker of human gastric cancer. World J Gastroenterol. 2006; 12(47): 7598-7603 4. Stadtlander CT, Waterbor JW. Molecular epidemiology, pathogenesis and prevention of gastric cancer. Carcinogenesis.1999; 20: 2195-2208 5. Crew KD, Neugut AI. Epidemiology of gastric cancer. World J Gastroenterol 2006; 12(3): 354-362 6. Campbell F, et al. Tumors of the Esophagus and Stomach In: Fletcher CDM (Editor) Diagnostic Histopathology of Tumors, 3d Edition, Churchill LivingstoneElsevier, 2007, Vol 1, pp 327-377 7. Harrison JC, et al: Adenocarcinoma of the stomach with invasion limited to the muscularis propria. Hum Pathol. 1991; 22:111-117 8. Roder JD, et al: Prognostic factors in gastric carcinoma. Results of the German Gastric Carcinoma Study 1992. Cancer, 1993; 72:2089-2097 9. Jemal A, et al. Cancer statistics, 2005. CA Cancer J Clin. 2005; 55:10-30 10. Roder D. The Epidemiology of gastric cancer. Gastric Cancer. 2002; 5(Supp1):5–11 11. South Australian Cancer Registry. Epidemiology of Cancer in South Australia. Incidence, Mortality and Survival, 1977 to 1999. Incidence and Mortality, 1999. Adelaide, Australia: Openbook Publishers 2000 12. Ilson DH. Adjuvant therapy for noncolorectal cancers. Curr Opin Oncol. 2001; 13:287–290 13. Weinberg R, Mihich E. Eighteenth annual pezcoller symposium: tumor microenvironment and heterotypic interactions. Cancer Res. 2006; 66:11550– 11553. 14. Bissell MJ, Radisky D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 2001;1:46–54. 15. Radisky D, et al. Tumors are unique organs defined by abnormal signaling and context. Semin Cancer Biol. 2001; 11:87–95 16. Tlsty TD, Hein PW. Know thy neighbor: stromal cells can contribute oncogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 2001; 11:54–59 17. Zaharia B., et al: Stroma tumorală In Morfopatologie, Vol. 1 Morfopatologie Generală, Editura Medicală Universitară Craiova, 1999 18. Cabanne F., Bonenfant J.L. Anatomie Pathologique - Principes de pathologie générale et spéciale. Les Presses de L'Université Laval Québec & Maloine S.A. Editeur Paris, 1980, pg 254-257 19 Fenoglio-Preiser et al. Gastric Carcinoma In: Hamilton SR and Aaltonen L (eds.) WHO Classification of Tumours Pathology and Genetics. Tumours of the Digestive System., Lyon, IARC Press: 2000, 38-52 20. Carneiro F Classification of gastric carcinomas. Current Diagnostic Pathology. 1997; 4:51-59 21. Kosuki T, et al. Differences in p53 and cadherin-catenin complex expression between histological supbtypes in diffusely infiltrating gastric carcinoma. Histopathology. 2002; 41:56-64 22. Laurén P. The two histological main types of gastric carcinoma: diffuse and so-called intestinal-type carcinoma. Acta Path. Microbiol. Scand .1965; 64:3149. 23. Carneiro F, et al New elements for an updated classification of the carcinomas of the stomach. Pathol Res Pract .1995; 191:571 – 584